袁風(fēng)嬌,李雪晴,李劍芳,劉艷,鄔敏辰

1 (江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2 (江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

Lactobacillusplantarum苯丙酮酸還原酶的異源表達(dá)及其在苯乳酸制備中的應(yīng)用

袁風(fēng)嬌1,李雪晴1,李劍芳1,劉艷1,鄔敏辰2*

1 (江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2 (江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

構(gòu)建產(chǎn)苯丙酮酸還原酶的基因工程菌E.coli/ppr，優(yōu)化其目的蛋白表達(dá)條件，并利用全細(xì)胞催化制備光學(xué)純的D-苯乳酸。以Lactobacillusplantarum的基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出一種編碼苯丙酮酸還原酶的基因 (ppr)，并將其在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)。以苯丙酮酸為底物，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，然后對(duì)E.coli/ppr全細(xì)胞制備苯乳酸的工藝進(jìn)行研究。結(jié)果表明：E.coli/ppr在IPTG終濃度為0.5 mmol/L，20 ℃誘導(dǎo)8 h時(shí)具有最高的苯丙酮酸還原酶活性。由其催化制備苯乳酸的最佳條件為：反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)初始pH 6.5，葡萄糖濃度20 mmol/L。在上述條件下增加苯丙酮酸的濃度至25 mmol/L，5 h后苯乳酸的最終產(chǎn)率達(dá)到98.4%，產(chǎn)物D-苯乳酸光學(xué)純度eegt;99.9%。

苯丙酮酸還原酶；表達(dá)；苯乳酸；條件優(yōu)化；全細(xì)胞催化

苯乳酸 (phenyllactic acid, PLA) 是一種新型的天然防腐劑，主要存在于蜂蜜和乳酸菌發(fā)酵制品中，具有較為寬廣的抑菌譜，對(duì)大多數(shù)細(xì)菌和真菌均有明顯的抑制作用[1-3]。與其他生物防腐劑相比，苯乳酸具有分子量低、親水性強(qiáng)，能夠在各種食品體系中均勻擴(kuò)散等優(yōu)點(diǎn)，因此作為廣譜抑菌劑其應(yīng)用前景十分廣闊[1]。此外，還可以通過聚合反應(yīng)將苯乳酸聚合成為聚苯乳酸，可作為一種潛在的替代聚乳酸的新型高分子材料，廣泛應(yīng)用于制藥工程、組織工程和高分子材料等領(lǐng)域[4]。

苯乳酸可由多種微生物發(fā)酵而來，LAVERMICOCCA等[2]通過對(duì)酸面團(tuán)中乳酸菌菌群進(jìn)行抗真菌能力的研究，首次從1株Lactobacillusplantarum21B的發(fā)酵液中檢測出苯乳酸。MU等[5-6]通過對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化和恒定pH流加培養(yǎng)，Lactobacillussp. SK007產(chǎn)苯乳酸的量從2.42 g/L上升到17.38 g/L，產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到0.241 g/(L·h)和51.1%，這是目前通過發(fā)酵法生產(chǎn)苯乳酸的最高紀(jì)錄。RODRIGUEZ等[7]對(duì)5株發(fā)酵產(chǎn)生苯乳酸的乳酸菌進(jìn)行研究，其中L.plantarumCECT-221苯乳酸的產(chǎn)量最高，以苯丙氨酸為底物對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，在2 L的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)158 h，產(chǎn)量由原來的0.23 g/L上升到0.7 g/L。隨著研究的深入，多種來自不同家族的脫氫酶類被發(fā)現(xiàn)具有轉(zhuǎn)化苯丙酮酸制備苯乳酸的活性，大部分來自乳酸菌，包括D和L兩種構(gòu)型[8-11]。苯丙酮酸還原酶是微生物合成苯乳酸的一種重要酶[11]，基于苯乳酸較強(qiáng)的抑菌性能，篩選產(chǎn)酶活性較高的菌株，挖掘其能夠產(chǎn)生高活性及高選擇性的苯丙酮酸還原酶基因，生產(chǎn)純度好、抑菌活性強(qiáng)的苯乳酸是未來研究亟待解決的問題。

由于乳酸菌 (Lactic acid bacteria, LAB)是公認(rèn)為安全 (Generally Recognized As Safe, GRAS)的微生物，千百年來用于食品加工、保藏，更適于工業(yè)化生產(chǎn)。本研究選擇Lactobacillusplantarum作為原始菌株，將來自Lactobacillusplantarum的苯丙酮酸還原酶 (phenylpyruvate reductase, ppr) 克隆表達(dá)至大腸桿菌E.coliBL21中，構(gòu)建重組工程菌E.coli/ppr。以苯丙酮酸為底物，通過重組全細(xì)胞催化對(duì)目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件及苯乳酸的制備條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為進(jìn)一步提高微生物合成苯乳酸的產(chǎn)率和底物轉(zhuǎn)化率提供借鑒。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

Lactobacillusplantarum、大腸桿菌 (E.coli) JM109、BL21(DE3) 和表達(dá)載體pET-28a(+)：由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；克隆載體pUCm-T：購自上海Sangon公司；重組質(zhì)粒pUCm-T-ppr和pET-28a-ppr由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏。

1.1.2 主要試劑

SanPrep DNA膠回收試劑盒：購自上海Sangon公司；rTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA和蛋白質(zhì)Marker：購自大連TaKaRa公司；D,L-苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品和苯丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品：購自上海Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI中已知的L.plantarumD-苯丙酮酸還原酶基因 (D-ppr) 序列 (GenBank: LUXK01000001.1) 設(shè)計(jì)特異性引物如表1所示，由上海Sangon公司合成。

表1 擴(kuò)增苯丙酮酸還原酶基因的引物

注：下劃線為酶切位點(diǎn)。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以提取的Lactobacillusplantarum的基因組DNA為模板擴(kuò)增出目的基因 (ppr)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測。將割膠回收的目的基因片段連接至pUCm-T載體上，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)藍(lán)白斑篩選及菌液PCR鑒定后獲得陽性克隆子E.coliJM109/pUCm-T-ppr，并送往上海Sangon公司測序。將測序正確的轉(zhuǎn)化子用NdeI和NotI雙酶切，經(jīng)割膠回收獲得目的基因ppr，與同樣經(jīng)雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+) 連接，并轉(zhuǎn)化至E.coliBL21，經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證，獲得重組大腸桿菌E.coli/ppr并送往上海Sangon公司進(jìn)行測序。

1.2.3 苯丙酮酸還原酶誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

分別挑取測序正確E.coli/pET-28a、E.coli/ppr和E.coliBL21的單菌落接種于2 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12～14 h。按2%的接種量 (體積分?jǐn)?shù)) 轉(zhuǎn)接入100 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8，添加IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，于25 ℃、220 r/min誘導(dǎo)8 h。離心收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液 (100 mmol/L、pH 7.0) 制備一定濃度的菌懸液，用于SDS-PAGE分析。

采用單因素試驗(yàn)考察誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)全細(xì)胞合成苯乳酸的影響。重組大腸桿菌初始誘導(dǎo)條件為：添加IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，25 ℃誘導(dǎo)8 h。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件 (如表2)。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.4 高效液相色譜分析方法

反相色譜柱型號(hào): ProntoSIL C18AQ(4.6 mm×250 mm，5 μm)；優(yōu)化后的HPLC條件為：流動(dòng)相為均含有0.05%的三氟乙酸的甲醇 (A) 和水 (B) 的混合液，梯度洗脫程序?yàn)椋?～15 min由20%A線性變化至65%A，15～16 min由65%A線性變化至100%并保持3 min，19～20 min由100%A線性變化至20%，流速1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測器為紫外檢測器，檢測波長210 nm，柱溫30 ℃。

通過正相HPLC分析苯乳酸的構(gòu)型，正相色譜柱型號(hào)：Chiralcel OD-H (0.46 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為含有0.05%三氟乙酸的正己烷/異丙醇 (98∶2) 混合液，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測器為紫外檢測器，波長為210 nm，柱溫30 ℃。

1.2.5 重組大腸桿菌全細(xì)胞催化制備苯乳酸的工藝優(yōu)化

在優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察pH、反應(yīng)溫度和葡萄糖濃度等因素對(duì)轉(zhuǎn)化苯丙酮酸合成苯乳酸工藝的影響。初始轉(zhuǎn)化條件為：pH 7.0，細(xì)胞濕重50 g/L，底物濃度10 mmol/L，葡萄糖濃度50 mmol/L，反應(yīng)溫度37 ℃，反應(yīng)時(shí)間為20 min。

2 結(jié)果與討論

2.1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以L.plantarum的基因組DNA為模板擴(kuò)增出目的基因 (ppr)，經(jīng)T4DNA連接酶連接至pUCm-T，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌液PCR驗(yàn)證篩選出陽性轉(zhuǎn)化子并送往上海sangon測序。分別提取測序正確的轉(zhuǎn)化子及E.coli/pET-28a的質(zhì)粒，經(jīng)NdeI和NotI雙酶切后回收酶切產(chǎn)物，連接后轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞。從轉(zhuǎn)化子中提取重組質(zhì)粒DNA利用通用引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，獲得大小約為1 400bp的片段 (如圖1-a)，與預(yù)期相符。同時(shí)，將提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證獲得大小分別為5 300 bp和1 000 bp的片段 (如圖1-b)，與理論值相符。將驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子命名為E.coli/ppr，保藏并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

M:DNA Marker；(a)1-2:苯丙酮酸還原酶基因的PCR驗(yàn)證；(b)1-2:重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證圖1 重組大腸桿菌E. coli/ppr的驗(yàn)證Fig. 1 Identification of recombinant bacterium E. coli/ppr

2.2重組大腸桿菌的表達(dá)及SDS-PAGE分析

對(duì)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后重組大腸桿菌E.coli/ppr、E.coli/pET-28a及原始菌株E.coliBL21進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖1所示。與對(duì)照菌株相比，E.coli/ppr在約41.3 kDa處有明顯條帶，除去質(zhì)粒上融合表達(dá)的融合標(biāo)簽，與預(yù)測目標(biāo)蛋白大小一致，表明來自Lactobacillusplantarum的ppr在大腸桿菌中成功表達(dá)。

M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；1:原始菌株；2:空質(zhì)粒菌株；3:重組菌株圖2 SDS-PAGE分析苯丙酮酸還原酶蛋白表達(dá)Fig.2 The analysis of phenylpyruvate reductase protein by SDS-PAGE

2.3HPLC檢測重組大腸桿菌E.coli/ppr全細(xì)胞催化制備苯乳酸

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明，重組大腸桿菌E.coli/ppr具有明顯的催化苯丙酮酸制備苯乳酸的能力，在37 ℃、220 r /min條件下轉(zhuǎn)化20 min，10 mmol/L PPA經(jīng)50 mg/mL (濕重) 重組大腸桿菌E.coli/ppr轉(zhuǎn)化還原為4.35 mmol/L苯乳酸，底物、產(chǎn)物標(biāo)品及樣品的HPLC檢測結(jié)果如圖3-a。通過正相HPLC分析苯乳酸的構(gòu)型檢測結(jié)果如圖3-b所示，經(jīng)計(jì)算產(chǎn)物D-苯乳酸光學(xué)純度eegt;99.9%。

圖3 HPLC分析重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成苯乳酸Fig.3 HPLC analysis of PLA production by whole cells of recombinant E. coli

2.4重組大腸桿菌誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.4.1 誘導(dǎo)溫度對(duì)全細(xì)胞合成苯乳酸的影響

如圖4-a所示，隨著誘導(dǎo)溫度的升高，苯乳酸的產(chǎn)量逐漸升高，而當(dāng)溫度高于20 ℃時(shí)，苯乳酸的產(chǎn)量迅速下降?？赡苁怯捎诘蜏貤l件下，宿主菌體生長少，異源蛋白表達(dá)量低；溫度較高時(shí)，宿主菌體生長量大，異源蛋白合成速率高，但高水平表達(dá)異源蛋白會(huì)影響其正確折疊而形成無活性的不溶性包涵體。另外，收集37 ℃誘導(dǎo)條件的菌體經(jīng)超聲破碎，離心收集上清液和沉淀，分別進(jìn)行SDS-PAGE和酶活力分析。破碎上清液中無重組苯丙酮酸還原酶的目的條帶且無活性，而沉淀在41.3 kDa處出現(xiàn)明顯目的蛋白條帶 (圖略)，表明重組蛋白在該條件下形成包涵體。因此，選定20 ℃為最佳誘導(dǎo)溫度進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.4.2 IPTG濃度對(duì)全細(xì)胞合成苯乳酸的影響

目的基因插入表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+) 的上游，T7啟動(dòng)子的下游，可以通過加入IPTG來誘導(dǎo)其表達(dá)。IPTG可調(diào)節(jié)異源蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)包涵體的形成，并抑制大腸桿菌的生長[12]。如圖4-b所示，在IPTG濃度為0.5 mmol/L時(shí)，苯乳酸產(chǎn)量最高，故選定0.5 mmol/L為最佳誘導(dǎo)濃度進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.4.3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)全細(xì)胞合成苯乳酸的影響

如圖4-c所示，苯乳酸的產(chǎn)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長而增加，誘導(dǎo)時(shí)間大于8 h時(shí)，其產(chǎn)量略微降低但穩(wěn)定在80%左右，可能是由于誘導(dǎo)時(shí)間延長，大腸桿菌進(jìn)入衰亡期，產(chǎn)酶速率低于被蛋白酶降解的速率，從而導(dǎo)致活性降低。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為8 h時(shí)，重組酶活力最高，故選定8 h為最佳誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

圖4 誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化Fig.4 Optimization of induction condition

2.4.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)，研究各因素和水平之間的的相互關(guān)系。如表3所示，極差分析表明影響重組大腸桿菌產(chǎn)酶因素的重要性次序?yàn)椋赫T導(dǎo)溫度(A)gt;誘導(dǎo)時(shí)間(C)gt;IPTG濃度 (B)，其中誘導(dǎo)溫度對(duì)苯乳酸的產(chǎn)量影響最大，IPTG濃度影響較小。故采用最佳的誘導(dǎo)條件為誘導(dǎo)溫度20 ℃，IPTG終濃度0.5 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間8 h，經(jīng)驗(yàn)證后苯乳酸的產(chǎn)量達(dá)到7.85 mmol/L。

2.5全細(xì)胞生物催化合成苯乳酸的單因素試驗(yàn)

2.5.1 反應(yīng)溫度對(duì)合成苯乳酸的影響

全細(xì)胞催化反應(yīng)其本質(zhì)仍是酶促反應(yīng)，因此溫度也是影響全細(xì)胞催化反應(yīng)的主要因素之一。在pH 7.0的反應(yīng)體系下考察不同反應(yīng)溫度 (20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃) 對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響。從圖5-a可以看出，隨著溫度的升高，苯乳酸的量也逐漸升高，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，其產(chǎn)量達(dá)到最大，繼續(xù)升高溫度，苯乳酸的產(chǎn)量出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，原因可能是溫度升高細(xì)胞膜的傳質(zhì)阻力減小，酶與底物間的有效碰撞增多，合成的產(chǎn)物也能更快滲透到胞外，但過高的溫度會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)中的酶發(fā)生失活，催化反應(yīng)速率隨之降低。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇40 ℃作為苯乳酸合成的最佳反應(yīng)溫度。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析表

2.5.2 反應(yīng)體系pH對(duì)苯乳酸合成的影響

轉(zhuǎn)化體系的pH值是影響生物催化反應(yīng)的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置轉(zhuǎn)化緩沖液pH分別為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，其他試驗(yàn)條件同1.2.5，考察不同pH的反應(yīng)體系對(duì)苯乳酸合成的影響，結(jié)果如圖5-b所示。從圖中可以看出，隨著反應(yīng)體系pH值的增大，合成苯乳酸的量也逐漸增大，當(dāng)pH達(dá)到6.5時(shí)，苯乳酸的產(chǎn)量達(dá)到最高，繼續(xù)增加反應(yīng)體系的pH值，苯乳酸產(chǎn)量反而出現(xiàn)了下降，這可能是因?yàn)檫^高的pH值抑制了酶的活性，導(dǎo)致苯乳酸合成反應(yīng)受阻。因此，選擇pH 6.5為催化合成反應(yīng)的最佳pH值。

2.5.3 反應(yīng)體系中葡萄糖濃度對(duì)苯乳酸合成的影響

來自Lactobacillusplantarum的苯丙酮酸還原酶是NADH依賴型的還原酶，在轉(zhuǎn)化苯丙酮酸的過程中，需要輔酶NADH的參與，通過胞內(nèi)輔因子再生系統(tǒng)提高反應(yīng)體系中NADH的濃度是提高苯乳酸產(chǎn)量的一種有效途徑。葡萄糖作為常用的一種相對(duì)廉價(jià)的碳源，常作為輔助底物用于輔因子再生，維持胞內(nèi)的氧化還原環(huán)境[13]。本研究考察了不同葡萄糖濃度 (0、20、40、60、80、100 mmol/L) 對(duì)苯乳酸合成的影響，其他條件同1.2.5，結(jié)果如圖5-c所示。當(dāng)加入20 mmol/L葡萄糖時(shí)，苯乳酸的產(chǎn)量顯著增加。但隨著葡萄糖濃度的增加，苯乳酸的產(chǎn)量增幅較小，因此，反應(yīng)體系中葡萄糖的濃度為20 mmol/L時(shí)最佳。

圖5 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化Fig.5 Optimization of bioconversion conditions

2.6進(jìn)程曲線的測定

在以上最佳條件下測定反應(yīng)的進(jìn)程曲線，即反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)體系pH為6.5，添加葡萄糖的量為20 mmol/L，并增加底物濃度至25 mmol/L。在此條件下轉(zhuǎn)化需要5 h，最終轉(zhuǎn)化率為98.38%。ZHANG等[14]對(duì)BacilluscoagulansSDM全細(xì)胞催化生產(chǎn)苯乳酸的工藝進(jìn)行研究，在最優(yōu)條件下通過底物流加反應(yīng)20 h后苯乳酸的產(chǎn)量達(dá)到37.3 g/L，轉(zhuǎn)化率為70%。LI等[15]研究表明LeuconostocmesenteroidesATCC 8293生長細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的最佳底物濃度為35 mmol/L，轉(zhuǎn)化率為75.2%～83.3%。本研究獲得的重組工程菌相比于原始菌株具有轉(zhuǎn)化體系簡單，轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化速率快等優(yōu)點(diǎn)，為苯乳酸的大規(guī)模生產(chǎn)及工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖6 重組大腸桿菌E. coli pET-28a-ppr催化產(chǎn)生苯乳酸的進(jìn)程曲線Fig.6 Time course production of PLA by the recombinant E. coli pET-28a-ppr

3 結(jié)論

本研究以重組大腸桿菌濕菌體為全細(xì)胞催化劑，通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)對(duì)目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上對(duì)重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化苯丙酮酸制備苯乳酸的條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的最適條件為轉(zhuǎn)化溫度為40 ℃，轉(zhuǎn)化體系最初pH為6.5，葡萄糖濃度為20 mmol/L。在最佳反應(yīng)條件下，增加底物的濃度至25 mmol/L，經(jīng)過5 h反應(yīng)后，苯乳酸產(chǎn)量達(dá)到4.15 g/L，轉(zhuǎn)化率為98.38%，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于通過發(fā)酵法生產(chǎn)苯乳酸的量。結(jié)果表明基因工程技術(shù)結(jié)合全細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法是一種高效可行的合成苯乳酸的途徑。另外，采用全細(xì)胞催化合成苯乳酸，無需破碎細(xì)胞，工藝大大得到簡化，同時(shí)，還減少了反應(yīng)雜質(zhì)，為后續(xù)苯乳酸的分離純化提供了有利的條件。

[1] DIEULEVEUX V, VAN DER PYL D, CHATAUD J, et al. Purification and characterization of anti-Listeriacompounds produced byGeotrichumcandidum[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(2): 800-803.

[2] LAVERMICOCCA P, VALERIO F, EVIDENTE A, et al. Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdoughLactobacillusplantarumstrain 21B[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(9): 4 084-4 090.

[3] LAVERMICOCCA P, VALERIO F, VISCONTI A. Antifungal activity of phenyllactic acid against molds isolated from bakery products[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(1): 634-640.

[4] FUJITA T, NGUYEN H D, ITO T, et al. Microbial monomers custom-synthesized to build true bio-derived aromatic polymers[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(20): 8 887-8 894.

[5] MU Wan-meng, LIU Feng-li, JIA Jiang-hua, et al. 3-Phenyllactic acid production by substrate feeding and pH-control in fed-batch fermentation ofLactobacillussp. SK007[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(21): 5 226-5 229.

[6] MU Wan-meng, CHEN Chao, LI Xing-Feng, et al. Optimization of culture medium for the production of phenyllactic acid byLactobacillussp. SK007[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(3): 1 366-1 370.

[7] RODRIGUEZ-PAZO N, VAZQUEZ-ARAUJO L, PEREZ-RODRIGUEZ N, et al. Cell-free supernatants obtained from fermentation of cheese whey hydrolyzates and phenylpyruvic acid byLactobacillusplantarumas a source of antimicrobial compounds, bacteriocins, and natural aromas[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2013, 171(4): 1 042-1 060.

[8] MU Wan-meng, YU Shu-huai, JIANG Bo, et al. Characterization of D-lactate dehydrogenase fromPediococcusacidilacticithat converts phenylpyruvic acid into phenyllactic acid[J]. Biotechnology Letters, 2012, 34(5): 907-911.

[9] 王穎,范銘,薛素妹,等. 全細(xì)胞催化合成L-苯基乳酸重組大腸桿菌的構(gòu)建[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2015,41(12): 13-17.

[10] 張玲玲,許國超,倪曄. 不對(duì)稱合成苯乳酸的酮酸還原酶基因克隆和表達(dá)[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2016,35(9): 950-957.

[11] MU Wan-meng, YU Shu-huai, ZHU Lan-jun, et al. Recent research on 3-phenyllactic acid, a broad-spectrum antimicrobial compound[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 95(5): 1 155-1 163.

[12] MALAKAR P, VENKATESH K V. Effect of substrate and IPTG concentrations on the burden to growth ofEscherichiacolion glycerol due to the expression of Lac proteins[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 93(6): 2 543-2 549.

[13] BALZER G J, THAKKER C, BENNETT G N, et al. Metabolic engineering ofEscherichiacolito minimize byproduct formate and improving succinate productivity through increasing NADH availability by heterologous expression of NAD(+)-dependent formate dehydrogenase[J]. Metabolic Engineering, 2013, 20: 1-8.

[14] ZHENG Zhao-juan, MA Cui-qing, GAO Chao, et al. Efficient conversion of phenylpyruvic acid to phenyllactic acid by using whole cells ofBacilluscoagulansSDM[J]. PLoS One, 2011, 6(4): e19030.

[15] LI L, SHIN S-Y, LEE K W, et al. Production of natural antimicrobial compoundD-phenyllactic acid usingLeuconostocmesenteroidesATCC 8293 whole cells involving highly active D-lactate dehydrogenase[J]. Letters in Applied Microbiology, 2014, 59(4): 404-411.

HeterologousexpressionofphenylpyruvatereductasefromLactobacillusplantarumanditsapplicationinthepreparationofphenyllacticacid

YUAN Feng-jiao1, LI Xue-qing1, LI Jian-fang1, LIU Yan1, WU Min-chen2*

1(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(Wuxi Medical School, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to construct a genetic engineering phenylpyruvate reductase strain (E.coli/ppr), the expression conditions and bioconversion medium were optimized to increase the production of PLA with whole-cell transformation. A phenylpyruvate reductase-encoding gene,ppr, was obtained by PCR from the genomic DNA ofLactobacillusplantarumand heterologously expressed inE.coliBL21 (DE3). Taking phenylpyruvic acid as the substrate, single factor and orthogonal experiments was used to optimized the induced expression and whole-cell catalysis conditions. Results showed that after induction with 0.5 mmol/L IPTG at 20 ℃ for 8 h,E.coli/pprdisplayed the highest LpPPR activity. When phenylpyruvic acid was added up to 25 mmol/L, the product enantiomeric excess percent was over 99.9% and the final yield of PLA could reach 98.38% at 5 h under the optimal catalytic conditions as follows: temperature 40 ℃, initial pH 6.5 and 20 mmol/L glucose.

Phenylpyruvate reductase; expression; phenyllactic acid; optimization; whole-cell catalysis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015007

碩士研究生(鄔敏辰教授為通訊作者，E-mail: biowmc@126.com)。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (21676117)； 江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目 (SJLX16-0472)

2017-06-22，改回日期：2017-07-13