王汝金，朱建德，張麗芳，薛飛群

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，獸藥安全評價與獸藥殘留重點(diǎn)開放實驗室，上海 200241)

高效液相色譜法測定沙咪珠利中的水合肼殘留量

王汝金，朱建德，張麗芳*，薛飛群*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，獸藥安全評價與獸藥殘留重點(diǎn)開放實驗室，上海 200241)

建立了一種沙咪珠利中水合肼殘留檢測的高效液相色譜法。含水合肼樣品用鹽酸溶液溶解后，加苯甲醛溶液衍生化，再用己烷提取，過濾后進(jìn)樣測定。采用Dikma Technologies Diamonsil C18色譜柱(250×4.6 mm, 5 μm)；流動相為乙二胺四乙酸鈉0.03% m/V∶乙腈(300∶700，V/V)；流速1 mL/min；紫外檢測波長268 nm。該方法在5～150 ng/mL的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程Y=260.35X+796.12，R2=0.9993。10、50、100 ng/mL三個添加濃度的添加回收率分別為105.58%、100.21%、102.60%，RSD分別為2.66%、3.16%、2.31%。該方法精密度好，快速準(zhǔn)確，適用于沙咪珠利樣品中水合肼殘留量的檢測。

沙咪珠利；水合肼；含量測定；高效液相色譜法

水合肼是肼的一水化合物，又名水合聯(lián)氨，是一種基礎(chǔ)的強(qiáng)性還原劑。肼及其鹽作為一種中間體，廣泛應(yīng)用于藥物工業(yè)以得到具有不同功效的藥物，例如脫羧酶抑制劑、抗血壓及抗菌等。水合肼還可作為一種玻璃發(fā)泡劑、腐蝕抑制劑及火箭燃料等[1-3]。同時，肼也是一種有毒物質(zhì)。國際化學(xué)安全項目及綜合風(fēng)險信息系統(tǒng)根據(jù)該系統(tǒng)的證據(jù)特征權(quán)重給予肼B2的分級[4](可能的人類致癌物質(zhì))，因為肼在很多動物體內(nèi)可以誘導(dǎo)腫瘤的產(chǎn)生并且在許多測定中表現(xiàn)出誘變的特性[5]。肼是一種刺激性強(qiáng)烈的皮膚致敏物；它對神經(jīng)系統(tǒng)、肝、腎有嚴(yán)重的不良影響。因為肼是一種毒性的并可能致癌的物質(zhì)，它在歐洲藥典論著中一些藥物中的含量受到限制[6]。

沙咪珠利是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動物藥學(xué)實驗室設(shè)計合成的新型結(jié)構(gòu)的抗球蟲藥物，該藥物具有良好的抗球蟲效果，與地克珠利、妥曲珠利等其他傳統(tǒng)抗球蟲藥物無交叉耐藥性，安全高效。水合肼是該藥物合成過程中的一種中間體。在沙咪珠利原料藥的質(zhì)量研究中，需對水合肼的殘留量進(jìn)行檢測，以使該藥物符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求。目前國內(nèi)對肼的測定方法有氣相色譜面積歸一化法[7-8]、薄層色譜法、陽離子交換柱液相色譜法、分光光度法[9]、高效液相色譜法等。高效液相色譜法是藥物合成中間體檢測的常用方法[10-11]，具有靈敏度高、專屬性好等特點(diǎn)。本研究的目的在于建立一種水合肼檢測的高效液相色譜方法，從而為沙咪珠利及相關(guān)藥品的水合肼質(zhì)量控制提供一種檢測方法。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

1.1.1 肼標(biāo)準(zhǔn)品 H4N2·2HCl，西格瑪化學(xué)試劑，Pcode:1012120562，含量≥99.99%。

1.1.2 沙咪珠利樣品 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動物藥學(xué)研究室制備，批號20150104；20150106；20150107。

1.1.3 試劑 苯甲醛，分析純，阿法埃莎化學(xué)有限公司；鹽酸，分析純，上海埃彼化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸鈉，分析純，上海埃彼化學(xué)試劑有限公司；己烷，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜純，賽默飛世爾科技。

1.2 儀器 Waters2690高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Waters 2487檢測器(美國Waters公司)；AE240雙量程分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；超聲波清洗器(SCQ-250型，上海申波超聲公司)；超純水系統(tǒng)(上海瑞楓生物科技有限公司)；渦旋混合器(上海凌初環(huán)保儀器有限公司)；LXJ-IIB低速離心機(jī)(上海安亭(飛鴿))。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

1.3.1.1 肼標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取相當(dāng)于10 mg 肼的鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品至10 mL容量瓶中，加入適量10%的鹽酸溶液溶解并定容至刻度，得到肼濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密量取適量上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用10%的鹽酸溶液逐步稀釋成系列濃度的肼標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.1.2 苯甲醛溶液的制備 精密稱取6 g苯甲醛至100 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋并定容至刻度。將上述溶液轉(zhuǎn)移至250 mL的錐形瓶中，加入100 mL水并混勻，得到苯甲醛溶液。

1.3.2 溶液衍生化 精密量取2 mL待測溶液至15 mL離心管中，加入2 mL苯甲醛溶液，渦旋90 s，加入2 mL己烷，渦旋120 s，待溶液分層后取上層過濾進(jìn)樣。

1.3.3 色譜條件 Dikma Technologies Diamonsil C18色譜柱(250×4.6 mm, 5μm)；流動相為乙二胺四乙酸鈉0.03% m/V∶乙腈(300∶700，V/V)；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；運(yùn)行時間20 min；柱溫30 ℃；紫外檢測波長268 nm。

1.3.4 方法學(xué)考察

1.3.4.1 專屬性 取2 mL 10%的鹽酸溶液衍生化后進(jìn)樣，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為參考，觀察空白溶液的色譜圖，考察方法的專屬性。

1.3.4.2 線性及范圍 將肼濃度分別為5、10、20、50、100、150 ng/mL的肼標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化后進(jìn)樣。將得到的峰面積對進(jìn)樣濃度進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。

1.3.4.3 檢測限和定量限 將肼標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋，衍生化后進(jìn)樣，記錄色譜圖。以檢出目標(biāo)峰峰高為3倍基線噪音值時所對應(yīng)的溶液濃度為該方法的檢測限濃度，以檢出目標(biāo)峰峰高為10倍基線噪音值時所對應(yīng)的溶液濃度為該方法的定量限濃度。

1.3.4.4 精密度 將濃度為50 ng/mL肼標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化后在1.3.3項的色譜條件下進(jìn)行分析，平行進(jìn)樣6次，測定峰面積間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3.4.5 添加回收率 精密稱取9份0.5 g沙咪珠利樣品放置在不同的15 mL離心管中，加入適量的肼標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用10%的鹽酸溶液稀釋，得到添加濃度分別為10、50、100 ng/mL各3個添加溶液。將各個溶液超聲10 min，4000 r/min離心5 min，取上清液衍生化后在1.3.3項的色譜條件下進(jìn)行分析，測定高、中、低三種添加濃度的回收率。

1.3.4.6 耐用性 將肼標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化后在1.3.3項的色譜條件下進(jìn)行分析，然后分別改變1.3.3項色譜條件中的流速(±0.2 mL/min)、柱溫(±5 ℃)、流動相配比(±2%)、色譜柱(更換色譜柱)，進(jìn)樣分析，考察色譜條件變動時，該方法的耐用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性 空白對照及標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖1所示?？瞻讓φ盏纳V圖在肼的出峰位置并無峰出現(xiàn)，表明空白溶劑對肼的測定并無影響。對照品的峰與其他峰并無干擾且峰型較好，這說明對照品能與其他物質(zhì)實現(xiàn)良好分離，該方法的專屬性較好。

2.2 線性及范圍 以對照品的濃度對其峰面積進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：Y=260.35X+796.12，R2=0.9993。這表明肼在5～150 ng/mL的范圍內(nèi)線性良好。

2.3 檢測限及定量限 以檢出目標(biāo)峰峰高為3倍基線噪音值時所對應(yīng)的溶液濃度為該方法的檢測限濃度，以檢出目標(biāo)峰峰高為10倍基線噪音值時所對應(yīng)的溶液濃度為該方法的定量限濃度。經(jīng)測定，該方法的檢測限濃度及定量限濃度分別為3 ng/mL及8 ng/mL。根據(jù)添加回收率的測定方法，沙咪珠利樣品中水合肼的檢測限濃度及定量限濃度分別為0.06 mg/kg及0.16 mg/kg。

2.4 精密度 將同一濃度的肼對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測得其峰面積間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.51%，這表明該方法的精密度較好(表1)。

2.5 添加回收率 對供試樣品分別進(jìn)行10、50、100 ng/mL三個濃度的添加回收試驗，測得高、中、低三個濃度的添加回收率分別為102.60%、100.21%、105.58%，RSD分別為2.66%、3.16%、2.31%，這表明該方法的準(zhǔn)確度較好(表2)。

2.6 耐用性 分別改變1.3.3項色譜條件中的柱溫、流速、流動相配比、色譜柱條件，測定同一肼標(biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果表明，各色譜條件下的主峰均能與其他峰實現(xiàn)良好分離，且峰面積的測定值較穩(wěn)定，測定結(jié)果未產(chǎn)生較大影響，該方法具有一定的耐用性。

2.7 實際樣品測定 選取3批沙咪珠利樣品，準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品至15 mL離心管中，加入10%的鹽酸溶液10 mL，將各個溶液超聲10 min，4000 r/min離心5 min，取上清液衍生化后在1.3.3項的色譜條件下進(jìn)行分析，測定沙咪珠利樣品中的肼含量。經(jīng)測定三批樣品中的肼濃度均在定量限濃度以下。

A 空白對照；B 10ng/mL的肼標(biāo)液；C 50ng/mL的肼標(biāo)液；D 100ng/mL的肼標(biāo)液 A blank; B Hydrazine standard solution 10ng/mL; C Hydrazine standard solution 50ng/mL; D Hydrazine standard solution 100ng/mL圖1 肼含量測定的專屬性色譜圖Fig 1 Specific chromatogram of determination of hydrazine content

進(jìn)樣次序123456RSD/%峰面積1461414831147691469314693147520.51

表2 沙咪珠利中肼添加回收率試驗結(jié)果Tab 2 Experimental results of recovery

3 討論與小結(jié)

3.1 樣品前處理

3.1.1 衍生化試劑 柱前衍生化是對低含量物質(zhì)進(jìn)行液相測定的一種有效方法[12]，現(xiàn)行的用于肼測定的方法大多數(shù)將肼衍生化后測定其衍生物，而不將其衍生化的方法,如使用鈷酞菁電極分析肼水溶液的電流分析法等則較為少用[13]。用于肼衍生化的試劑有肉桂醛、氯苯甲醛、五氟苯甲醛、香草醛、苯甲醛、水楊醛等。肉桂醛、氯苯甲醛、五氟苯甲醛多用于生物樣品的分析，應(yīng)用氣相色譜技術(shù)進(jìn)行檢測；香草醛多用于環(huán)境樣品的分析，應(yīng)用紫外可見分光光度法進(jìn)行檢測；苯甲醛用于藥物或環(huán)境樣品的分析，液相色譜技術(shù)及氣相色譜技術(shù)均可應(yīng)用于其衍生物的檢測分析。系列試驗結(jié)果表明，相比于其他衍生化試劑，苯甲醛與肼生成的衍生物在液相色譜檢測中有較高的靈敏度。本研究的目的是建立測定藥品沙咪珠利中肼含量的高效液相色譜方法，因此采用苯甲醛作為肼的衍生化試劑。

3.1.2 衍生化條件 肼鹽酸鹽與苯甲醛溶液反應(yīng)需在酸性條件下進(jìn)行，故試驗中首先將肼對照品及待測樣品溶解于鹽酸溶液中。某些藥物中肼含量測定以苯甲醛作為衍生化試劑時，常會在加入苯甲醛溶液后出現(xiàn)藥物大量析出的現(xiàn)象。為提高藥物在苯甲醛溶液中的溶解度，增加衍生化效率，往往會在藥物衍生化時對其進(jìn)行加熱處理。本實驗中，在向藥物中加入苯甲醛溶液時，未出現(xiàn)明顯的藥物析出現(xiàn)象，且歐洲藥典中收錄的衍生化方法大多數(shù)在常溫下進(jìn)行，故本試驗的衍生化過程也在常溫下進(jìn)行。與有機(jī)相萃取的溶劑有正己烷、正庚烷、正辛烷等，正庚烷、正辛烷沸點(diǎn)較高多用于加熱條件下的萃取，本試驗在常溫下反應(yīng)且正己烷為較為常用的有機(jī)相萃取溶劑，故將其用于本試驗的有機(jī)相萃取。

3.2 色譜條件的確定 采用相關(guān)文獻(xiàn)中的檢測波長進(jìn)行試驗時發(fā)現(xiàn)空白溶液在肼的出峰位置有干擾，故重新選擇檢測波長。分別配制鹽酸-己烷提取液、苯甲醛-水-己烷提取液、苯甲醛-鹽酸-己烷提取液以及水合肼對照品衍生溶液，在紫外分光光度計下進(jìn)行全波長掃描，測定結(jié)果如圖2所示。

圖2 紫外吸收圖Fig 1 UV absorption diagram

該紫外吸收圖由上至下依次為水合肼對照品衍生溶液譜圖、苯甲醛-水-己烷提取液和苯甲醛-鹽酸-己烷提取液重合譜圖、鹽酸-己烷提取液譜圖。由圖2可知，水合肼對照品衍生溶液相比于其他空白溶液在205～220、260～280、300～330 nm的波長范圍內(nèi)有較強(qiáng)的紫外吸收，故在這些波長范圍內(nèi)選用幾個波長條件作為液相色譜的檢測波長并做進(jìn)一步研究。將空白溶劑及肼標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化后進(jìn)樣測定，除紫外波長不同外，其他色譜條件均按1.3.3項的要求。結(jié)果表明，205～220 nm及300～330 nm檢測波長下測定的空白溶劑均對肼的測定均有干擾或肼標(biāo)液的測定結(jié)果不理想，而268 nm波長下測定的空白溶劑均對肼的測定無干擾且肼標(biāo)液的測定結(jié)果較為理想。因此，選取268 nm作為肼測定的最終檢測波長。結(jié)合其他文獻(xiàn)資料，最終確定該方法的色譜條件為Dikma Technologies Diamonsil C18色譜柱(250×4.6 mm, 5μm)；流動相為乙二胺四乙酸鈉0.03% m/V∶乙腈(300∶700，V/V)；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；運(yùn)行時間20 min；柱溫30 ℃；紫外檢測波長268 nm。

本研究建立了一種沙咪珠利原料藥中肼殘留的高效液相色譜檢測方法，該方法操作簡便，準(zhǔn)確快速，重現(xiàn)性好，能夠滿足藥物相關(guān)物質(zhì)殘留的檢測要求。

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(編輯：侯向輝)

TheDeterminationofHydrazineHydrateResiduesinAcetamizurilbyHPLC

WANG Ru-jin， ZHU Jian-de，ZHANG Li-fang*，XUE Fei-qun*

(KeyLaboratoryofVeterinaryDrugSafetyEvaluationandResidueResearch,ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai200241,China)

ZHANGLi-fang,E-mail:twingzhang@shvri.ac.cn；XUEFei-qun,fqxue@shvri.ac.cn

A high performance liquid chromatography (HPLC) method for the determination of hydrazine hydrate residues in acetamizuril was established. The hydrazine hydrate sample was dissolved in hydrochloric acid solution and then derivatized with benzaldehyde solution, extracted with hexane and filtered to measure the sample. A Diamonsil C18 column (250×4.6 mm, 5 μm)was used. The mobile phase was sodium ethylenediaminetetraacetate 0.03% m/V, acetonitrile(300∶700，V/V). The flow rate was 1 mL/min and the detection wavelength was 268 nm. The resolute showed that a good linear relationship was obtained with the concentration range of 5～ 150 ng/mL and the regression equation wasY=260.35X+796.12，R2=0.9993. The recoveries at the three concentration of 10、50、100 ng/mL were 105.58%, 100.21%, 102.60% andRSDwere 2.66%, 3.16% and 2.31%, respectively. The method was sensitive, accurate, convenient,and it is suitable for the determination of hydrazine hydrate residues in the samples of acetamizuril.

acetamizuril; hydrazine hydrate; determination; High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.11.09

2017-03-17

A

1002-1280 (2017) 11-0059-06

S859.2

公益性行業(yè)( 農(nóng)業(yè)) 科研專項(201303038)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863 計劃)(2011AA10A214)

王汝金，碩士, 從事藥物分析相關(guān)工作。

張麗芳，twingzhang@shvri.ac.cn；薛飛群，fqxue@shvri.ac.cn