于義娟，秦 濤，閔娟娟，漆世華，靖志強(qiáng)，付 婭，李晶梅，廖園園，舒銀輝，朱 薇，徐 松，謝紅玲

(武漢中博生物股份有限公司，武漢 430070)

BHK-21細(xì)胞不同處理方式對(duì)裸鼠致瘤性的影響

于義娟，秦 濤，閔娟娟，漆世華，靖志強(qiáng)，付 婭，李晶梅，廖園園，舒銀輝，朱 薇，徐 松，謝紅玲*

(武漢中博生物股份有限公司，武漢 430070)

為分析BHK-21細(xì)胞不同處理方式對(duì)裸鼠致瘤性的影響，分別用甲醛、二乙烯亞胺(BEI)、β-丙內(nèi)酯(BPL)進(jìn)行滅活和在-20 ℃進(jìn)行凍融處理的BHK-21細(xì)胞接種裸鼠，通過病理組織形態(tài)學(xué)觀察判定其是否存在致腫瘤的特性。結(jié)果顯示，甲醛、BEI、BPL、凍融2次或3次分別處理的BHK-21細(xì)胞接種裸鼠，對(duì)裸鼠致瘤率為零。凍融1次的BHK-21細(xì)胞和107、105和103個(gè)BHK-21細(xì)胞分別接種裸鼠，致瘤率為100%。10個(gè)BHK-21細(xì)胞接種裸鼠，未見成瘤。試驗(yàn)表明，裸鼠檢測(cè)BHK-21細(xì)胞致瘤性敏感性為103個(gè)細(xì)胞；凍融2次、甲醛、BEI、BPL處理，BHK-21細(xì)胞均喪失致瘤性；凍融1次不能使BHK-21細(xì)胞喪失致瘤性。

BHK-21細(xì)胞；裸鼠；致瘤性

BHK-21細(xì)胞為地鼠腎傳代細(xì)胞系，具有致瘤性，其完整活細(xì)胞具有較高的致癌、致瘤性，不能用于活疫苗的制備[1]。BHK-21細(xì)胞滅活后不具有致瘤性，是世界衛(wèi)生組織推薦的生產(chǎn)獸用疫苗細(xì)胞，現(xiàn)已在規(guī)?；a(chǎn)中應(yīng)用，主要用于口蹄疫滅活疫苗的生產(chǎn)[2]。本研究以《中國獸藥典》所載的致瘤性檢驗(yàn)方法，對(duì)滅活劑、凍融處理的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行檢驗(yàn)，從中選擇能夠使BHK-21細(xì)胞喪失致瘤性的處理方法，用于獸用生物制品的研發(fā)和生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 BALB/c-nu/nu裸鼠，雌性，4～6周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2 飼料 裸鼠料，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.3 細(xì)胞 BHK-21細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞系(HELA)細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，均由武漢中博生物股份有限公司技術(shù)中心提供。

1.1.4 試劑 2-溴乙胺氫溴酸鹽(BEA)、甲醛、硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、氫氧化鈉(NaOH)均為國產(chǎn)分析純。取0.4 mol/L的BEA和0.4 mol/L的NaOH等體積混合，37 ℃孵育1 h制成0.2 mol/L的二乙烯亞胺(BEI)。DMEM培養(yǎng)液為HYCLONE公司產(chǎn)品。

1.1.5 儀器 S8智能型獨(dú)立通氣籠IVC(蘇州市蘇杭科技器材有限公司)、LEICA RM2235石蠟切片機(jī)、JK-6 生物組織攤烤片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)、水浴鍋、離心機(jī)、超凈臺(tái)、冰箱、電磁爐。

1.1.6 分組 將裸鼠分為13組，每組10只，見表1。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組Tab 1 Experimental animal grouping

1.2 方法

1.2.1 各組接種物的制備

1.2.1.1 細(xì)胞懸液的制備 取懸浮培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BHK-21細(xì)胞，1000 r/min離心8 min，棄上清，用DMEM培養(yǎng)液重懸稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為107/0.5 mL、105/0.5 mL、103/0.5 mL、10/0.5 mL。

1.2.1.2 甲醛滅活組細(xì)胞的制備 取107/0.5 mL的BHK-21細(xì)胞，加入甲醛溶液使終濃度為0.1%，37 ℃滅活72 h。

1.2.1.3 BEI滅活組細(xì)胞的制備 取107/0.5 mL的BHK-21細(xì)胞，加入BEI溶液使終濃度為0.005 mol/L，37 ℃滅活48 h，加入硫代硫酸鈉(Na2S2O3)溶液使終濃度為0.005 mol/L。

1.2.1.4 BPL滅活組細(xì)胞的制備 取107/0.5 mL的BHK-21細(xì)胞，按1/4000比例加入BPL，2～8 ℃滅活24 h，37 ℃水解2 h。

1.2.1.5 凍融組細(xì)胞的制備 取107/0.5 mL的BHK-21細(xì)胞，-20 ℃分別凍融1次、2次和3次。

1.2.1.6 HELA細(xì)胞和CEF細(xì)胞懸液制備 分別取靜置培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HELA細(xì)胞和CEF細(xì)胞，胰酶溶液消化使細(xì)胞分散，離心收集細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)液重懸，使細(xì)胞濃度為106/0.5 mL。

1.2.1.7 陰性對(duì)照2組細(xì)胞的制備 取107/0.5 mL的BHK-21細(xì)胞，置于沸水中煮10 min。

1.2.2 裸鼠接種與觀察測(cè)量

1.2.2.1 裸鼠接種 按表1選擇接種物。在裸鼠頸背部和背部前1/3處，皮下注射，0.5 mL/只。

1.2.2.2 試驗(yàn)觀察 觀察14 d，檢查有無結(jié)節(jié)或腫瘤形成。如果有結(jié)節(jié)或可疑病灶，繼續(xù)觀察至少1周，解剖，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，檢查內(nèi)臟器官(心、肝、脾、肺、腎、腦)有無異常病變。對(duì)未發(fā)生結(jié)節(jié)的動(dòng)物，取其中半數(shù)，觀察21d，對(duì)另外半數(shù)動(dòng)物觀察12周，對(duì)接種部位進(jìn)行解剖和病理學(xué)檢查，觀察各淋巴結(jié)和各器官中有無結(jié)節(jié)形成，如果可疑，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組觀察21 d[3-4]。

1.2.2.3 腫瘤組織切片制備和病理形態(tài)學(xué)觀察 斷頸處死裸鼠，取出裸鼠皮下腫瘤結(jié)節(jié)，用中性福爾馬林作常規(guī)組織固定，制備石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察。

1.2.2.4 判定標(biāo)準(zhǔn) 在陽性對(duì)照組裸鼠成瘤率為100%，陰性對(duì)照組裸鼠成瘤率為零時(shí)，實(shí)驗(yàn)成立。實(shí)驗(yàn)組裸鼠無腫物生長(zhǎng)或者雖有隆突狀腫物生長(zhǎng)但卻是非腫瘤的，接種物無致瘤性；若有隆突狀腫物生長(zhǎng)，經(jīng)病理形態(tài)學(xué)觀察證實(shí)為腫瘤的，接種物有致瘤性。

2 結(jié) 果

記錄各實(shí)驗(yàn)組裸鼠精神、飲食、排便、接種部位腫塊情況，并對(duì)成瘤情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見表2。

表2 試驗(yàn)各組成瘤數(shù)統(tǒng)計(jì)Tab 2 Tumor formation statistics for all groups

2.1 陰、陽性對(duì)照組 CEF細(xì)胞接種后觀察21 d，裸鼠均未見腫塊，精神良好，飲食、排便正常(圖1)。煮沸10 min的BHK-21細(xì)胞接種裸鼠，均未出現(xiàn)腫塊，且精神、飲食、排便均沒出現(xiàn)異常表現(xiàn)。接種后21 d剖檢5只裸鼠，接種后12周剖檢5只裸鼠，觀察各淋巴結(jié)和各器官，均無結(jié)節(jié)形成(圖2)。HELA細(xì)胞接種后一周，裸鼠接種部位有腫塊形成，腫塊直徑8 mm左右，具有腫瘤的病理形態(tài)(圖3)。107個(gè)BHK-21細(xì)胞接種裸鼠，接種后一周接種部位有腫塊形成，腫塊數(shù)量3個(gè)以上，且在背部后方皮下也有腫塊形成。腫塊直徑10～20 mm，腫塊質(zhì)地較軟，含血量豐富，具有腫瘤的病理形態(tài)。所有裸鼠接種12～14 d全部死亡(圖4)。

2.2 凍融組 凍融1組裸鼠在接種后第2周陸續(xù)出現(xiàn)腫塊，腫塊1到2個(gè)，腫塊直徑8 mm左右，具有腫瘤的病理形態(tài)，部分腫瘤組織表皮出現(xiàn)破潰，剖檢腫塊含血量較高，質(zhì)地較軟(圖5)。凍融2組均未出現(xiàn)腫塊，且精神、飲食、排便均沒出現(xiàn)異常表現(xiàn)。接種后21 d剖檢5只裸鼠，接種后12周剖檢5只裸鼠，觀察各淋巴結(jié)和各器官，均無結(jié)節(jié)形成(圖6)。凍融3組裸鼠均未出現(xiàn)腫塊，且精神、飲食、排便均沒出現(xiàn)異常表現(xiàn)。接種后21 d剖檢5只裸鼠，接種后12周剖檢5只裸鼠，觀察各淋巴結(jié)和各器官，均無結(jié)節(jié)形成(圖7)。

2.3 滅活劑處理組 甲醛組：1周內(nèi)有4只裸鼠接種部位有腫塊形成，2周腫塊消失，21 d剖檢，經(jīng)病理形態(tài)學(xué)檢查，無腫瘤組織。另6只裸鼠沒有出現(xiàn)腫塊，且精神、飲食、排便均沒出現(xiàn)異常表現(xiàn)，21 d剖檢3只裸鼠，12周剖檢3只裸鼠，觀察各淋巴結(jié)和各器官，均無結(jié)節(jié)形成(圖8)。BEI、BPL組：裸鼠均未出現(xiàn)腫塊，且精神、飲食、排便均沒出現(xiàn)異常表現(xiàn)。BEI、BPL組接種后21 d分別剖檢5只裸鼠，接種后12周分別剖檢5只裸鼠，觀察各淋巴結(jié)和各器官，均無結(jié)節(jié)形成(圖9、圖10)。

2.4 梯度組 梯度1組：接種后一周接種部位有腫塊形成，腫塊數(shù)量2個(gè)以上，且在背部后方皮下也有腫塊形成。腫塊直徑8～16 mm，腫塊質(zhì)地較軟，含血量豐富，具有腫瘤的病理形態(tài)，觀察期內(nèi)沒有死亡(圖11)。梯度2組：接種后一周均未出現(xiàn)腫塊，在接種后2周有8只裸鼠接種部位有腫塊形成，在接種3周有2只裸鼠接種部位有腫塊形成，腫塊直徑在4 mm左右，具有腫瘤的病理形態(tài)(圖12)。梯度3組：裸鼠均未出現(xiàn)腫塊，精神、飲食、排便均沒出現(xiàn)異常表現(xiàn)。接種后21 d剖檢5只裸鼠，接種后12周剖檢5只裸鼠，觀察各淋巴結(jié)和各器官，均無結(jié)節(jié)形成(圖13)。

圖1 陰性對(duì)照1組裸鼠Fig 1 Negative control group 1

圖2 陰性對(duì)照2組裸鼠Fig 2 Negative control group 2

圖3 陽性對(duì)照1組裸鼠Fig 3 Positive control group 1

圖4 陽性對(duì)照2組裸鼠Fig 4 Positive control group 2

圖5 凍融1組裸鼠Fig 5 Freezing-thawing group 1

圖6 凍融2組裸鼠Fig 6 Freezing-thawing group 2

圖7 凍融3組裸鼠Fig 7 Freezing-thawing group 3

圖8 甲醛組裸鼠Fig 8 Formaldehyde treatment group

圖9 BEI組裸鼠Fig 9 BEI treatment group

圖10 BPL組裸鼠Fig 10 BPL treatment group

圖11 梯度1組裸鼠Fig 11 Gradient group 1

圖12 梯度2組裸鼠Fig 12 Gradient group 2

圖13 梯度3組裸鼠Fig 13 Gradient group 3

2.5 HELA細(xì)胞致瘤裸鼠腫瘤病理學(xué)觀察 采集裸鼠皮下腫瘤結(jié)節(jié)，進(jìn)行組織切片制備和病理形態(tài)學(xué)觀察。細(xì)胞排列紊亂，失去正常的排列層次，細(xì)胞大小不一(圖14)。有些細(xì)胞體積偏大，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的比例增大，細(xì)胞核形態(tài)大小不一，染色質(zhì)粗糙，出現(xiàn)病理性核分裂象(圖15)。

圖14 HELA細(xì)胞致瘤 HE 200×Fig 14 Tumor caused by Hela cells HE 200×

→：病理性核分裂相→：Pathological mitotic phase圖15 HELA細(xì)胞致瘤 HE 400×Fig 15 Tumor caused by Hela cells HE 400×

2.6 BHK-21細(xì)胞致瘤裸鼠腫瘤病理學(xué)觀察 采集各腫塊，制備石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖16、圖17。

圖16 BHK-21細(xì)胞致瘤 HE 200×Fig 16 Tumor caused by BHK-21 cells HE 200×

→：病理性核分裂相→：Pathological mitotic phase圖17 BHK-21細(xì)胞致瘤 HE 400×Fig 17 Tumor caused by BHK-21 cells HE 400×

結(jié)果顯示，腫塊大部分區(qū)域?yàn)閴乃赖哪[瘤組織，腫瘤細(xì)胞如橫紋肌母細(xì)胞樣彌漫分布，可見病理性核分裂象。

3 討 論

本試驗(yàn)中使用的甲醛、BPL、BEI屬于化學(xué)滅活劑。化學(xué)滅活的優(yōu)點(diǎn)是效果確實(shí)、方法簡(jiǎn)便。甲醛滅活的作用機(jī)制是破壞微生物的核酸及蛋白質(zhì)。甲醛滅活時(shí)首先與含氨基的核苷酸堿基(如A、G、U)結(jié)合而使核酸變性。使用較高濃度的甲醛和較長(zhǎng)時(shí)間的作用時(shí)間，甲醛可與蛋白質(zhì)的胺基結(jié)合，形成羥甲基衍生物或二羥甲基衍生物，后者再與酰胺發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。微生物的蛋白質(zhì)發(fā)生變性，阻止其核酸逸出[5-6]。甲醛滅活存在較多的缺陷，包括刺激性大、致癌危險(xiǎn)、破壞免疫原性、滅活時(shí)間長(zhǎng)、滅活效果受多種因素影響等[7]。BPL滅活的作用機(jī)制是作用于微生物的DNA或RNA，通過與核酸的嘌呤堿基(主要是G)反應(yīng)破壞核酸的結(jié)構(gòu)，但不直接作用于蛋白質(zhì)，因此能保持良好的免疫原性。大劑量BPL是一種潛在致癌物，但是BPL極易水解，在37 ℃水浴水解2 h后消失，其水解為無毒性的人體脂肪代謝產(chǎn)物β-羥基丙酸。BPL滅活的另一優(yōu)勢(shì)是滅活所需時(shí)間短，能顯著縮短疫苗生產(chǎn)周期[5]。BEI滅活的作用機(jī)制是烷化微生物DNA分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤，引起單鏈斷裂、雙螺旋鏈交聯(lián)及干擾酶系統(tǒng)和核蛋白作用，破壞核酸代謝、合成，導(dǎo)致微生物核酸芯破壞。BEI破壞微生物核酸，不作用于蛋白質(zhì)，能較好的保持抗原的免疫原性[5]。本試驗(yàn)中使用凍融處理BHK-21細(xì)胞。凍融是一種破碎細(xì)胞的方法，作用機(jī)理是突然冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，細(xì)胞內(nèi)外溶劑濃度突然改變致使細(xì)胞破碎[8]。

本試驗(yàn)用裸鼠檢測(cè)細(xì)胞致瘤性，裸鼠胸腺先天性缺陷，T淋巴細(xì)胞缺損，適于免疫生物學(xué)、免疫病理學(xué)、移植免疫等研究，是生物制品傳代細(xì)胞致瘤試驗(yàn)的最好動(dòng)物模型[9]。裸鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞，可導(dǎo)致其產(chǎn)生腫瘤或組織癌變，且保持原發(fā)瘤的組織學(xué)形態(tài)、免疫學(xué)特點(diǎn)及其特有的染色體組型[10]。

細(xì)胞染色體遺傳特征決定致瘤性質(zhì)并具有種屬特異性，不同核型細(xì)胞致瘤性不同[11-12]。對(duì)BHK-21細(xì)胞系KA株、M株、YA株的染色體組型與遺傳變異率分析，研究發(fā)現(xiàn)BHK-21細(xì)胞皮下接種裸鼠均產(chǎn)生進(jìn)行性生長(zhǎng)的惡性腫瘤，且不論核型如何始終具有強(qiáng)的致癌性[12]。染色體數(shù)目變異越大，染色體眾數(shù)越多、范圍越寬，染色體條數(shù)越多，致瘤性越強(qiáng)?？赡苁且?yàn)椤皟?yōu)勝劣汰”作用導(dǎo)致染色體數(shù)目變異較小細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)增殖處于劣勢(shì)或被淘汰，相反染色體數(shù)目變異較大細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)增殖處于優(yōu)勢(shì)而明顯增多[13-14]。李六金等學(xué)者研究BHK-21細(xì)胞致瘤性，結(jié)果顯示108BHK-21細(xì)胞和107BHK-21細(xì)胞不論是低代次還是高代次的腫塊形成率和致瘤率均為100%，且代次之間差異不顯著。正常BHK-21細(xì)胞經(jīng)快速裂解后仍具有致瘤性[1]。

本試驗(yàn)用裸鼠檢測(cè)BHK-21細(xì)胞致瘤性，結(jié)果顯示，103個(gè)BHK-21細(xì)胞接種裸鼠引發(fā)腫瘤；10個(gè)BHK-21接種裸鼠觀察期內(nèi)未見腫瘤。本試驗(yàn)結(jié)果表明，BHK-21細(xì)胞的數(shù)量及密度對(duì)裸鼠的致瘤性有明顯影響，裸鼠檢測(cè)BHK-21細(xì)胞致瘤性敏感性為103個(gè)細(xì)胞。

本試驗(yàn)對(duì)BHK-21細(xì)胞進(jìn)行-20 ℃凍融1次處理后，進(jìn)行裸鼠致瘤性試驗(yàn)觀察。結(jié)果顯示皮下接種裸鼠引發(fā)腫瘤，且重復(fù)性穩(wěn)定，這和李六金等學(xué)者的正常BHK-21細(xì)胞經(jīng)快速裂解后仍具有致瘤性的結(jié)論相符。

本試驗(yàn)對(duì)BHK-21細(xì)胞分別進(jìn)行甲醛37 ℃滅活72 h、BEI 37 ℃滅活48 h、BPL 4 ℃滅活24 h、-20 ℃凍融2次或3次處理后，進(jìn)行裸鼠致瘤性試驗(yàn)觀察。結(jié)果顯示，甲醛、BEI、BPL、-20 ℃凍融2次或3次后，皮下接種裸鼠均不引發(fā)腫瘤。結(jié)果表明，獸用滅活疫苗若以BHK-21細(xì)胞作為病毒增殖載體收獲的抗原液，經(jīng)2次凍融處理或0.1%甲醛或0.005 mol/L的BEI或1/4000的BPL進(jìn)行滅活，均能使BHK-21細(xì)胞喪失致瘤性。

綜上所述， BHK-21細(xì)胞經(jīng)滅活和凍融處理可喪失對(duì)裸鼠的致瘤性，其結(jié)果可以作為判定BHK-21細(xì)胞是否適用于獸用滅活疫苗抗原生產(chǎn)的參考依據(jù)。

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Zhang D L, Huang G S, Li L J,etal. Study on the origin of the malignant striated muscle tumor (MRT )-the experimental research on the MRT caused by high mutation rate cell lines in nude mice.[J]. Acta Genitica Sinica, 2000, 27(12): 1057-1071.

(編輯：李文平)

EffectsofDifferentTreatmentsofBHK-21CellsonTumorigenicityinNudeMice

YU Yi-juan, QIN Tao, MIN Juan-juan, QI Shi-hua, JING Zhi-qiang, FU Ya, LI Jing-mei,
LIAO Yuan-yuan, SHU Yin-hui, ZHU Wei, XU Song, XIE Hong-ling*

(WuhanChopperBiologyCo.,Ltd,Wuhan430070,China)

XIEHong-ling,E-mail: 13419546263@163.com

For understanding the tumorigenicity of BHK-21 cells, nude mice were injected by BHK-21 cells which inactivated by formaldehyde, diethylenimine (BEI), β-propiolactone (BPL) as well as BHK-21 cells which freezing-thawing at -20 ℃, the tumor-bearing characteristics were observed by pathomorphological changes. The results showed that the tumor morbidity of BHK-21 cells were treated by formaldehyde, BEI, BPL and freezing-thawing for two or three times were zero, 107,105,103BHK-21 cells can 100% cause the tumors as well as the BHK-21 cells were freezing-thawing only once, no tumors were found when the dose of injection is ten. These results suggested that the sensitivity of tumorigenicity of BHK-21 cells in nude mice was 103cells, the tumorigenicity of BHK-21 cells can be killed with freezing-thawing for twice, formaldehyde, BEI and BPL; but it still have tumorigenicity in nude mice with freezing-thawing only once.

BHK-21 cells；nude mice; tumorigenicity

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.11.05

2017-02-23

A

1002-1280 (2017) 11-0028-08

Q813

于義娟，碩士，從事獸用疫苗研發(fā)和動(dòng)物組織病理檢測(cè)研究。

謝紅玲。E - mail：13419546263@163.com