郭利，李家偉，姚慶，李建友，程世鵬

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動物分子生物學(xué)重點實驗室，農(nóng)業(yè)部經(jīng)濟動物疫病重點實驗室，長春 130112；2.安圖縣畜牧獸醫(yī)總站，安圖 133600；3.龍井市畜牧業(yè)管理局，龍井 133400)

牛傳染性鼻氣管炎病毒LAMP方法的建立及與PCR方法的對比研究

郭利1，李家偉2，姚慶3，李建友1，程世鵬1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動物分子生物學(xué)重點實驗室，農(nóng)業(yè)部經(jīng)濟動物疫病重點實驗室，長春 130112；2.安圖縣畜牧獸醫(yī)總站，安圖 133600；3.龍井市畜牧業(yè)管理局，龍井 133400)

本研究利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù)建立了可視化牛傳染性鼻氣管炎病毒（BoHV-1）LAMP檢測方法，并與普通PCR方法進行對比研究。試驗結(jié)果證明，LAMP具有良好的敏感性、特異性，可檢測到2．23×103拷貝/μL的BoHV-1基因含量，其臨床樣品的陽性檢出率高于普通PCR。

牛傳染性鼻氣管炎病毒；LAMP；PCR

傳染性鼻氣管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR)又名牛皰疹病毒Ⅰ型(Bovine herpesvirus type1 infections，BoHV-1)感染癥，是由牛傳染性鼻氣管炎病毒引起的牛的一種急性接觸性傳染病，臨床表現(xiàn)形式多樣，以呼吸道為主[1]，為B類疫病[2]。病牛和帶毒動物是主要傳染源，隱性感染的種公牛精液帶毒。病牛愈后可帶毒6～12個月，甚至長達19個月。病毒主要存在于鼻、眼、陰道分泌物和排泄物[3]。急性BoHV-1呼吸道感染還可繼發(fā)其他細菌性或病毒性感染，造成牛呼吸道疾病綜合征（BRDC）[4]。目前，IBR已在世界范圍內(nèi)流行，可結(jié)合流行病學(xué)做出初步診斷，實驗室診斷包括病毒分離鑒定和血清學(xué)試驗。

IBR是牛場臨床常見的多發(fā)病，可給養(yǎng)牛業(yè)造成極大的損失。BoHV-1為雙股DNA病毒，但其病毒基因平均GC含量高于75%[5]，這一基因組的特殊性限制了BoHV-1的病原學(xué)快速檢測方法的建立。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的核酸等溫擴增技術(shù)[6]，是近年來發(fā)展起來的一項疾病快速臨床診斷方法，具有條件簡單、操作方便等十分突出的優(yōu)點。本研究針對BoHV-1病毒gE基因，建立了BoHV-1的LAMP快速檢測方法，產(chǎn)物通過目視檢測基于鈣黃綠素顯色的熒光和瓊脂糖凝膠電泳，亦可根據(jù)反應(yīng)液濁度來直接判斷反應(yīng)結(jié)果，可視化程度高。同時，采用該方法檢測臨床樣品與普通PCR進行對比分析，以期為疫病的預(yù)后篩查和治療檢測提供一種簡單快速的試驗手段。

1 材料與方法

1．1 毒株和細胞

BoHV-1、BPIV3、BVDV和BRSV病毒及標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒、MDBK細胞均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所分子生物學(xué)重點實驗室保存。

1．2 儀器與試劑

水浴鍋：杭州博日科技有限公司；分光光度計：Eppendorf；PCR 擴增儀：美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；瓊脂糖購自Promega公司；胎牛血清購自Hyclone公司。DNA、RNA提取試劑盒購自AXYGEN公司；鈣黃綠素(FD) 購自日本榮研化學(xué)株式會社公司；Bst DNA、LATaq聚合酶購自寶生物科技有限公司；引物由長春庫美生物有限公司合成。

1．3 試驗設(shè)計

1.3.1 病毒增殖及DNA提取

將MDBK細胞用含8%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)和傳代，待細胞長成單層后，用于BoHV-1病毒接種。取-70℃保存的牛傳染性鼻氣管炎病毒接種單層MDBK細胞進行培養(yǎng)（MOI 0.01），72h后，-20℃反復(fù)凍融3次，收獲病毒。病毒DNA的提取按試劑盒操作說明進行。

1.3.2 LAMP反應(yīng)引物的設(shè)計與篩選

從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得牛傳染性鼻氣管炎病毒保守序列g(shù)E（GenBank∶ L27212.1)的序列，利用軟件Primer design V4設(shè)計LAMP反應(yīng)所需的4組引物（內(nèi)引物FIP和BIP、外引物F3和B3），引物序列見表1。將4組引物分別用于LAMP反應(yīng)，選取最佳擴增引物。

表1 引物序列

反應(yīng)混合物總體系25μL，分別加入4組引物：引物F3 0.5μL，引物B3 0.5μL，引物FIP 4μL，引物BIP 4μL，Bst DNA酶0.5μL，2×buffer13μL，模板2μL，鈣黃綠素0.5μL。反應(yīng)溫度設(shè)置為65℃，反應(yīng)時間為50min，以雙蒸水為陰性對照。利用鈣黃綠素觀察熒光和瓊脂糖凝膠電泳的反應(yīng)結(jié)果選擇最優(yōu)引物組。試驗設(shè)陰性和陽性對照。

1.3.3 特異性試驗

對篩選出來的最佳引物組進行特異性試驗，分別以陰性對照雙蒸水，以牛呼吸道相關(guān)病毒BoHV-1病毒DNA和BPIV3、BRSV 、BVDV三種病毒陽性質(zhì)粒為模板，通過瓊脂糖凝膠電泳和鈣黃綠素來檢測引物特異性，待檢測樣本中含有BoHV-1基因序列時，就可以發(fā)生LAMP反應(yīng)，產(chǎn)生大量焦磷酸鎂白色沉淀，與鈣黃綠素結(jié)合顯示黃綠色熒光，而陰性樣品不發(fā)生擴增呈橙色，瓊脂糖凝膠電泳可見特異擴增條帶。

1.3.4 敏感性試驗

按試劑盒說明操作提取BoHV-1總DNA，根據(jù)定量進行10倍梯度稀釋至終濃度為10-6倍。25μL體系反應(yīng)混合物在63℃反應(yīng)50min后進行LAMP敏感性檢測（反應(yīng)條件同上），并與PCR方法檢測靈敏性進行對比，PCR反應(yīng)總體系25μL，各組分的體積分別為：引物P1 0.5μL，引物P2 0.5μL，LATaq酶0.5μL，10×buffer 2.5μL（高GC），dNTP 2μL，模板1μL，去離子水補至25μL。反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 30s，57℃15s，72℃ 1min，30個循環(huán)，72℃總延伸5min。

1.3.5 臨床樣品檢測

采用建立的IBR LAMP檢測方法對來自吉林、內(nèi)蒙古、黑龍江和山東等地區(qū)發(fā)病牛場的10份臨床DNA樣品進行檢測。LAMP反應(yīng)條件、普通PCR反應(yīng)條件同上。

2 結(jié)果與分析

2．1 最佳引物篩選結(jié)果

根據(jù)BoHV-1gE特異性保守序列設(shè)計了4組LAMP引物，依照LAMP試劑盒優(yōu)化條件，分別加入4組不同引物，在63℃反應(yīng)50min。由圖1、圖2可以看出，引物組2、3、4反應(yīng)結(jié)束后無擴增，引物組1呈陽性擴增，陰性對照成立。選擇引物組1為BoHV-1-LAMP方法擴增引物。

圖1 4組引物的擴增結(jié)果

圖2 4組引物的擴增熒光變化結(jié)果

2．2 特異性試驗結(jié)果

分別以陰性對照雙蒸水，以牛呼吸道相關(guān)病毒BoHV-1、BPIV3、BRSV和BVDV的DNA為模板，通過瓊脂糖凝膠電泳和鈣黃綠素來檢測引物特異性。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示。BoHV-1模板反應(yīng)管可見特異擴增條帶，其他三組未見LAMP反應(yīng)擴增條帶，且陰性對照結(jié)果成立，表示該引物對BoHV-1具有良好的特異性（圖3）。LAMP結(jié)果顯示，BoHV-1基因反應(yīng)管為陽性，出現(xiàn)黃綠色熒光；BPIV3、BRSV和BVDV樣品為陰性，無黃綠色熒光，沒有產(chǎn)生沉淀（圖4）。

圖3 LAMP方法特異性試驗

圖4 LAMP方法特異性試驗熒光變化

2．3 敏感性試驗結(jié)果

將BoHV-1病毒的細胞培養(yǎng)物提取其總DNA，定量為5.58×108個拷貝/μL，10倍系列稀釋至10-6，25μL 反應(yīng)體系中BoHV-1含量為2.23×106拷貝/μL～2.23×101拷貝/μL，用LAMP方法和PCR進行檢測并設(shè)陰性對照。結(jié)果顯示，LAMP擴增在病毒模板稀釋到10-5即BoHV-1基因組含量為2.23×103個拷貝時仍可被檢測到（圖5），陽性樣品顯示黃綠色熒光（圖6）；PCR方法檢測2.23×103個拷貝數(shù)時呈弱陽性（圖7）。

圖5 LAMP敏感性試驗結(jié)果

圖6 LAMP敏感度試驗熒光變化結(jié)果

圖7 普通PCR敏感度試驗結(jié)果

2．4 臨床樣品檢測結(jié)果

收集到來自安徽、內(nèi)蒙古、吉林、黑龍江、山東、遼寧等部分地區(qū)發(fā)病牛場的臨床樣品10份，其中鼻拭子4份，血樣3份，糞拭子3份。采用建立的LAMP方法對10份樣品進行檢測。結(jié)果顯示，在10份臨床樣品中，LAMP方法檢出陽性樣品6份，瓊脂糖凝膠電泳均可見特異條帶（圖8），對應(yīng)陽性樣品可見黃綠色熒光，陰性對照成立（圖9）。PCR方法檢出BoHV-1陽性樣品3份，陰性對照成立（圖10）。結(jié)果表明，PCR檢出的陽性樣品3、5和6對應(yīng)LAMP檢測均為陽性，LAMP陽性檢測結(jié)果與PCR方法陽性檢測符合率為100%，且LAMP陽性檢出率高于普通PCR。

圖8 臨床樣品LAMP檢測結(jié)果

圖9 臨床樣品LAMP熒光變化檢測結(jié)果

圖10 臨床樣品PCR檢測結(jié)果

3 討論

IBR是由BoHV-1病毒引起的牛常見傳染病[7]，各種年齡的牛都易感染，病毒隱藏在三叉神經(jīng)內(nèi)，形成隱性感染，適當(dāng)條件下重新發(fā)病，病畜是主要傳染源。本病呈全球性分布，各養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達國家均有流行。BoHV-1為DNA病毒，屬皰疹病毒科，感染后一般發(fā)生病毒潛伏而長期帶毒，適當(dāng)應(yīng)激條件下重新發(fā)病，使疾病在牛群中廣泛流行[8]。通常情況下，鑒定血清學(xué)中陽性動物是檢查動物感染狀態(tài)非常有用而且理想的指標(biāo)，抗體陽性動物可認(rèn)為是病毒攜帶動物和潛在的排毒者。國內(nèi)目前大型養(yǎng)牛場有使用IBR疫苗的，或者幼畜通過吸食初乳獲得母源抗體，所以依靠血清抗體對疫病篩查需結(jié)合具體情況進行分析，最后的臨床診斷仍是對病原的監(jiān)測。

本研究室對國內(nèi)部分省市的BoHV-1血清流行病學(xué)調(diào)查顯示，僅個別地區(qū)未見有血清抗體陽性，絕大部分省區(qū)均有IBR的流行，某些地區(qū)BoHV-1血清抗體陽性率可達100%，說明BoHV-1病毒在中國流行廣泛。BoHV-1臨床樣本檢測方法主要包括Real Time-PCR技術(shù)、PCR技術(shù)、ELISA及中和試驗[9,10]等，但上述方法都局限在實驗室條件下進行?；矢推降萚11]建立了IBRLAMP檢測方法，特異性好，靈敏性可檢測到1.68×104拷貝/μL。LAMP對引物要求高，且反應(yīng)時間不宜過長，時間越久假陽性結(jié)果越明顯。提高反應(yīng)的靈敏性和特異性對疾病的快速診斷是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。本研究建立的牛傳染性鼻氣管炎病毒（BoHV-1）的LAMP快速檢測方法，經(jīng)對引物反復(fù)篩選和反應(yīng)條件的優(yōu)化，1h之內(nèi)完成檢測，普通水浴后可根據(jù)溶液顏色變化肉眼觀察判定結(jié)果，具有良好的特異性和敏感性。臨床樣品檢測時，LAMP陽性檢測率高于普通PCR方法，且與PCR方法陽性檢測符合率為100%。

LAMP法操作流程簡便，針對DNA病毒樣品易于處理，為BoHV-1的臨床檢測提供了一種簡單快速的試驗手段，更適合IBR的診斷和臨床現(xiàn)場快速檢測，可對疫病的防控起到臨床科學(xué)的指導(dǎo)作用。

[1]Pritchard GC, Banks M, Vernon RE． Subclinical breakdown with infectious bovine rhinotracheitis virus infection in dairy herd of high health status[J]． Vet Rec, 2003, 153:113-117．

[2]Pritchard GC, Banks M, Vernon RE． Subclinical breakdown with infectious bovine rhinotracheitis virus infection in dairy herd of high health status[J]． Vet Rec, 2003, 153:113-117．

[3]Griffin D, Chengappa MM, Kuszak J, et al． Bacterial pathogens of the bovine respiratory disease complex[J]． Vet Clin North Am Food AnimPract, 2010,26:381-394．

[4]Baker JC．Bovine viral diarrhea virus: Rosskopf, M．, Staub, E．,Ackermann, M．, 1994． Comparison of two ELISA systems for the detection of antibodies against IBR/IPVand against enzootic bovine leukemia virus． Schweiz． Arch．Tierheilk． 136,58-67．

[5]Borsberry S． Challenges of BoHV-1 eradication in 'closed' cattle herds[J]． Vet Rec,2012,170:652．

[6]NotomtTH, Okayama H, Masubuchi T,et al． Amino, and T．Hase．Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]． Nucleic Acids Res, 2000, 28:E63．

[7]Tomita N，Mori Y,Kanda H，et al．Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products[J]． Nat． Protoc, 2008,3:877-882．

[8]Wyler, R．, Engels, M．, Schwyzer, M．, 1989． Infectious bovinerhinotracheitis/vulvovaginitis． In: Wittmann, G． (Ed．),HerpesvirusDiseases of Cattle, Horses and Pigs． Kluwer Academic Publishers, Boston, Dordrecht, London, pp． 1-72．

[9]陳茹,畢英佐,曹永長,等． 牛傳染性鼻氣管炎病毒 LUX 新型熒光 PCR 檢測方法的建立[J]． 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2007,29(4):303-308．

[10] Yason C．V, Harris L．M．, Kibenge F．S．Establishment of conditions for the detection of bovine herpesvirus-1 polymerase chain reaction using primers in the thymidine kinase region[J]．Canadian Journal of Veterinary Research, 1995, 59(2):94-101．

[11]皇甫和平,石冬梅,許文博,等． 牛 傳 染 性 鼻 氣 管 炎 病 毒 g E 基因LAMP 檢 測 方 法 的 建 立[J]． 中國獸醫(yī)雜志,2016,52(6):14-16．

Establishment of LAMP Method for Bovine Hypersvirus Type 1 and Comparison with PCR

GUO Li1, LI Jia-wei2, YAO Qing3, LI Jian-you1, CHENG Shi-peng1
(1.The Key Laboratory for Molecular Biology of Special Economic Animals, Institute of Special Economic Animal and Plant Sciences , Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Special Animal Epidemic Disease, Ministry of Agriculture, Changchun 130112; 2.Animal Husbandry and Veterinary Station of Antu, Antu 133600; 3.Bureau of Animal Husbandry of Longjing, Longjing 133400)

This study using loop mediated isothermal amplification (LAMP) technology to establish the infectious bovine rhinotracheitis virus (BoHV-1) LAMP detection method, and compares with the ordinary PCR method. The results show that the LAMP is more sensitivity and specificity than the ordinary PCR method. The LAMP method can be detected 2.23×103copies /μL. The detection of clinical samples were compared with normal PCR results showed that clinical samples positive rate was higher than that of ordinary PCR.

Infectious bovine rhinotracheitis virus; Loop-mediated isothermal amplification; PCR

S858.23

A

1004-4264（2017）11-0025-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.11.007

2017-03-11

牛傳染性鼻氣管炎活疫苗（LNM株）產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用（20150307024NY）；國家重點研發(fā)計劃：畜禽重大疫病防控與高效安全養(yǎng)殖綜合技術(shù)研發(fā)（2016YFD0500907）；規(guī)?；雠２《拘愿篂a凈化體系建立及推廣應(yīng)用（20170309002NY）。

郭利（1977-），女，吉林長春人，副研究員，主要從事動物病毒和生物制品的研究。