何慶林 白艷芬 周威 殷華 陳寧 莊以彬 劉濤

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

利用糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73B6在大腸桿菌中生物催化酚苷類(lèi)天然產(chǎn)物

何慶林1，2白艷芬2周威2殷華2陳寧1莊以彬2劉濤2

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

植物紅景天來(lái)源的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73B6，具有底物寬泛性，能糖基化多種天然化合物。旨在實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中生物催化合成酚苷類(lèi)化合物。利用糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73B6的催化活性，在大腸桿菌BL21（DE3）中飼喂7種不同酚類(lèi)化合物，通過(guò)生物轉(zhuǎn)化的方法，首次實(shí)現(xiàn)利用糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73B6催化8種糖苷化合物的合成，進(jìn)一步探索了糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73B6的底物寬泛性。在此基礎(chǔ)上，提供了一種通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)生物合成酚苷類(lèi)化合物的方法，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73B6；生物轉(zhuǎn)化；酚苷類(lèi)化合物；大腸桿菌

天然產(chǎn)物的糖基化在生物體中發(fā)揮著重要作用［1-4］，不僅使代謝產(chǎn)物變得豐富多樣，而且可改變化合物的理化性質(zhì)，如增加溶解度、增強(qiáng)穩(wěn)定性、促進(jìn)在活細(xì)胞中的儲(chǔ)存和積累以及調(diào)節(jié)其化學(xué)性質(zhì)和生物活性。酚類(lèi)化合物廣泛存在于自然界中，從簡(jiǎn)單的酚酸到復(fù)雜的黃酮類(lèi)和花青素等［5］。據(jù)報(bào)道，酚類(lèi)化合物具有抗衰老、抗氧化、抗惡性細(xì)胞增殖等功能［6］。酚類(lèi)化合物的糖基化在植物和微生物中有著重要的意義，如改變花的顏色，增加苷元的可溶性和降低外源物質(zhì)的毒性等［7-8］。此外，酚類(lèi)化合物糖基化可提高其生物活性，如柚皮苷、熊果苷和水楊苷等［7，9］。有研究發(fā)現(xiàn)，將水飛薊素A進(jìn)行糖基化得到水飛薊素A-7-O-β-吡喃葡萄糖苷后，其生物利用率顯著提高［10］。糖基化修飾可以使外源化合物的理化性質(zhì)與生物活性發(fā)生明顯變化，利用生物技術(shù)改變天然產(chǎn)物的糖基化類(lèi)型從而獲得更多的天然產(chǎn)物及其衍生物成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［11-17］。

Ma等［18］利用RACE技術(shù)從紅景天植株中分離得到糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73B6，并證明該酶可以將酪醇轉(zhuǎn)化為紅景天苷。UGT73B6是首個(gè)報(bào)道的參與紅景天苷合成的糖基轉(zhuǎn)移酶。本實(shí)驗(yàn)室利用UGT73B6實(shí)現(xiàn)了紅景天苷和天麻素在大腸桿菌中異源合成，并且產(chǎn)物中同時(shí)合成了酪醇、對(duì)羥基苯甲酸和對(duì)羥基苯甲醛葡萄糖基化副產(chǎn)物［19］。因此，UGT73B6對(duì)小分子酚類(lèi)化合物具有一定的底物寬泛性。

本研究為進(jìn)一步探索糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73B6潛在底物，利用大腸桿菌全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的方法，在UGT73B6重組菌中飼喂7種不同種類(lèi)的酚類(lèi)化合物，以期實(shí)現(xiàn)其相應(yīng)的糖苷化合物的合成，旨為酚苷類(lèi)化合物的生物合成提供案例參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pET28a購(gòu)于Novagen公司。質(zhì)粒pGEX-4T-1-ugt73b6由上海捷瑞公司合成。

1.1.2 試劑 Phusion超保真DNA聚合酶購(gòu)自New England Biolabs公司；限制性內(nèi)切酶Nde I、Bam HI 購(gòu)自Fermentas公司；T4連接酶購(gòu)自TaKaRa Biotechnology 公司；3，5-二羥基甲苯、4-甲氧基苯酚、間甲基苯酚、對(duì)羥基苯丙酸、白藜蘆醇、愈創(chuàng)木酚、香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自百靈威公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L；M9培養(yǎng)基：磷酸氫二鈉12.8 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，氯化鈉0.5 g/L，氯化銨1 g/L，葡萄糖2 g/L，硫酸鎂0.24 g/L，氯化鈣11.1 g/L。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)底物 本研究選擇了7種小分子的酚類(lèi)化合物作為UGT73B6的潛在底物進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。所用底物及其結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1。

表1 本研究所選用底物及其結(jié)構(gòu)

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒pET28a-ugt73b6及重組菌BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6的構(gòu)建 ugt73b6（GenBank accession number：AY547304）來(lái)自庫(kù)頁(yè)紅景天（Rhodiola sachalinensis），由上海捷瑞公司合成，為了在大腸桿菌中使用進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，用ugt73b6syn來(lái)表示。合成的ugt73b6syn基因片段被克隆到pGEX-4T-1載體，由捷瑞公司構(gòu)建成pGEX-4T-1-ugt73b6。以限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I對(duì)pET28a質(zhì)粒和pGEX-4T-1-ugt73b6分別進(jìn)行酶切；通過(guò)凝膠電泳回收載體及基因片段；以載體與基因片段摩爾數(shù)比為1∶3進(jìn)行連接，獲得質(zhì)粒pET28a-ugt73b6。質(zhì)粒pET28augt73b6轉(zhuǎn)化至BL21（DE3），獲得重組菌株BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6。質(zhì)粒pET28a轉(zhuǎn)入到BL21（DE3）中，獲得菌株BL21（DE3）/ pET28a。

1.2.2 SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá) 分別挑取BL21（DE3）/pET28a與 BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6菌株單克隆于3 mL液體LB中，37℃培養(yǎng)12 h；按體積比1∶100轉(zhuǎn)接至50 mL液體LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG于16℃進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)24 h，收集發(fā)酵液2 mL，12 000 r/min離心10 min；加入200 μL的5 ×loading buffer，沸水浴10 min，12 000 r/min離心10 min，上樣量 5 μL。

1.2.3 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化 挑取重組菌BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6與BL21（DE3）/pET28a單克隆，分別接種至3 mL液體LB中，37℃培養(yǎng)12 h；按體積比1∶100轉(zhuǎn)接至50 mL液體LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG于16℃進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)，蛋白誘導(dǎo)時(shí)間為24 h；4 000 r/min離心10 min，收集菌體，加入50 mL M9Y發(fā)酵培養(yǎng)基（含0.025% Yeast Extract）進(jìn)行重懸；培養(yǎng)基中添加終濃度為2 mmol/L的催化底物，于30℃繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后取樣進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物HPLC和LC-MS 分析檢測(cè) 取發(fā)酵液1 mL，12 000 r/min離心10 min，收集上清。HPLC檢測(cè)系統(tǒng)是島津液相色譜儀；檢測(cè)條件為：HPLC流動(dòng)相A = 水（含0.1%甲酸），B = 甲醇；流速 = 1 mL/min，溶液配比為二元濃度梯度，洗脫條件：0-5 min 5% B，6-45 min 5% B到100% B；進(jìn)樣量20 μL；液相色譜柱為Agela Innoval C18柱（4.6× 250 mm）；UV檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

LC-MS檢測(cè)：配有紫外檢測(cè)器的安捷倫1260系統(tǒng)和配有ESI離子源探針的bruker microQ-TOF Ⅱ質(zhì)譜儀，檢測(cè)條件包括：Agela Innoval C18柱（4.6 ×250mm）；UV檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流動(dòng)相A =水（含0.1%甲酸），B =甲醇；流速 = 1mL/min，溶液配比為二元濃度梯度，洗脫條件：0-5 min 5% B，6-45 min 5%B到100% B；進(jìn)樣量20 μL；ESI正離子源，分子量掃描范圍50-800。

1.2.5 糖苷化合物的分離制備 按照1.2.3所述方法進(jìn)行發(fā)酵液的制備，發(fā)酵總量為1 L。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液4 000 r/min離心15 min，取上清。將預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂SP-825（樹(shù)脂用量為發(fā)酵液體積的50%）裝入層析柱，加入發(fā)酵液離心后的上清，流速可控制在2 mL/min，使樹(shù)脂充分吸附發(fā)酵產(chǎn)物，待發(fā)酵液流盡后，用兩倍柱體積的水洗脫殘留在樹(shù)脂柱中的雜質(zhì)，之后用80%乙醇洗脫兩個(gè)柱體積，收集洗脫液，分離得到的溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮。最后，用1-2 mL甲醇將分離得到的各組分從旋蒸瓶中轉(zhuǎn)移出來(lái)。HPLC分離條件為：島津高效液相色譜半制備儀，測(cè)定條件包括：檢測(cè)器SPD-20A，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流動(dòng)相A = 水（含0.1%體積甲酸）B = 甲醇；流速 = 4 mL/min；洗脫條件：65%A和35%B；進(jìn)樣量100 μL。

1.2.6 糖苷化合物的NMR檢測(cè) 樣品經(jīng)干燥后溶于500 μL為氘代甲醇轉(zhuǎn)入直徑2.5 mm核磁管中，用Bruker Avance III 400 MHz核磁共振儀測(cè)定1H NMR。

2 結(jié)果

2.1 載體pET28a-ugt73b6的驗(yàn)證

重組載體pET28a-ugt73b6用Nde I和BamH I酶切驗(yàn)證，得到大小為1.5 kb和5.3 kb兩條帶（圖1），與理論大小一致，并送金唯智測(cè)序公司進(jìn)行了DNA測(cè)序驗(yàn)證。

圖1 載體pET28a-ugt73b6構(gòu)建

2.2 SDS-PAGE檢測(cè)ugt73b6蛋白表達(dá)

BL21（DE3）/ pET28a與 BL21（DE3）/pET28augt73b6菌株按照1.2.2的方法發(fā)酵并誘導(dǎo)蛋白，制備樣品，進(jìn)行蛋白膠電泳，染色，脫色后SDSPAGE如圖2所示，UGT73B6蛋白條帶大小為 53.9 kD，說(shuō)明目的蛋白成功表達(dá)。

2.3 發(fā)酵液中產(chǎn)物HPLC及LC-MS鑒定

按方法1.2.3進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，對(duì)菌株 BL21（DE3）/ pET28a和 菌 株 BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，取48 h的發(fā)酵液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，結(jié)果如圖2-9所示，其中菌株BL21（DE3）/ pET28a均無(wú)新化合物產(chǎn)生，菌株BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6中7種底物都有新化合物的合成（四角星所對(duì)應(yīng)的峰）。對(duì)新化合物進(jìn)行LC-MS檢測(cè)，結(jié)果表明7種底物都發(fā)生葡萄糖基化，因此推斷糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73B6對(duì)所選取的7種小分子的酚類(lèi)化合物都有催化活性，生成了糖苷化合物。

圖2 BL21（DE3）/pET28a與BL21（DE3）/pET28augt73b6SDS-PAGE檢測(cè)圖

2.4 白藜蘆醇糖苷化合物的1H NMR鑒定

圖3 菌株BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6添加底物3，5-二羥基甲苯HPLC（A）及LC-MS（B）檢測(cè)結(jié)果

圖4 菌株BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6添加底物4-甲氧基苯酚HPLC（A）及LC-MS（B）檢測(cè)結(jié)果

圖5 菌株BL21（DE3）/ pET28a-ugt73b6添加底物間甲基苯酚HPLC（A）及LC-MS（B）檢測(cè)結(jié)果

圖6 菌株BL21（DE3）/ pET28a-ugt73b6添加底物愈創(chuàng)木酚HPLC（A）及LC-MS（B）檢測(cè)結(jié)果

圖7 菌株BL21（DE3）/ pET28a-ugt73b6添加底物香豆酸HPLC（A）及LC-MS（B）檢測(cè)結(jié)果

圖8 菌株BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6添加對(duì)羥基苯丙酸HPLC（A）及LC-MS（B）檢測(cè)結(jié)果

圖9 菌株BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6添加白藜蘆醇HPLC（A）及LC-MS（B）檢測(cè)結(jié)果

為進(jìn)一步確定圖9中a與b兩種白藜蘆醇糖苷化合物的結(jié)構(gòu)，對(duì)這兩種化合物進(jìn)行1H NMR鑒定?；衔颽的1H NMR顯示，該化合物結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)對(duì)位取代的苯環(huán)［δH= 7.38（d，J = 8.6 Hz，2 H），6.77（d，J = 8.6 Hz，2 H）］，一個(gè)間位三取代的苯環(huán)［δH= 6.95（d，J = 2.1 Hz，1 H），6.77（d，J = 8.6 Hz，2 H）］，一個(gè)雙鍵［7.08（d，J = 16.3 Hz，1 H），6.89（d，J= 16.3 Hz，1 H）］，這與苷元白藜蘆醇結(jié)構(gòu)一致，另外化合物含有典型的葡糖糖苷分子信號(hào)［4.94（d，J= 7.5 Hz，1 H），3.94（dd，J = 12.0，2.2 Hz，1H），3.70（dd，J = 12.0，6.3 Hz，1H），3.56-3.33（m，4 H）］，結(jié)合橋頭碳上氫的耦合常數(shù)為7.5 H，可確定為β構(gòu)型糖苷鍵，參照相關(guān)文獻(xiàn)［20-21］可以最終確定保留時(shí)間為25.5 min的化合物a為白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖苷；另一保留時(shí)間為27.5 min的化合物b的1H NMR顯示，該化合物同樣具有白藜蘆醇苷元結(jié)構(gòu)［δ = 7.45（d，J = 8.8 Hz，2 H），7.08（d，J =8.8 Hz，2 H），7.00（d，J = 16.3 Hz，1 H），6.88（d，J = 16.3 Hz，1 H），6.47（d，J = 2.2 Hz，2 H），6.18（t，J = 2.1 Hz，1 H）］，高場(chǎng)區(qū)信號(hào)顯示化合物為葡萄糖苷產(chǎn)物，根據(jù)橋頭碳原子上氫的耦合常數(shù)為7.5 H，可確定為β構(gòu)型糖苷鍵，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［20-21］化合物b鑒定為白藜蘆醇-3-O-β-D-葡萄糖苷。

3 討論

本研究通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，利用糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73B6，飼喂7種不同的酚類(lèi)化合物，首次實(shí)現(xiàn)利用糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73B6獲得相應(yīng)的8種糖苷化合物。

基于3，5-二羥基甲苯、4-甲氧基苯酚、間甲基苯酚、對(duì)羥基苯丙酸、愈創(chuàng)木酚和香豆酸結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可根據(jù)HPLC及LC-MS檢測(cè)結(jié)果確定所對(duì)應(yīng)糖苷化合物的結(jié)構(gòu)。底物白藜蘆醇因具有多個(gè)羥基，為了確定具體的催化位置，對(duì)其進(jìn)行放大發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，提取分離獲得催化產(chǎn)物，經(jīng)NMR檢測(cè)，確定了糖基轉(zhuǎn)移酶可以分別催化白藜蘆醇3和4'位的羥基形成單糖苷化產(chǎn)物。這表明糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73B6能夠催化白藜蘆醇合成不同結(jié)構(gòu)類(lèi)型的糖苷化合物，為其多羥基底物合成結(jié)構(gòu)多樣的糖苷化合物提供了一種有效的方法。

基因ugt73b6來(lái)源于植物紅景天，本研究中僅對(duì)其DNA序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，為了使蛋白在大腸桿菌中更好的表達(dá)，接下來(lái)可以對(duì)誘導(dǎo)劑IPTG濃度和蛋白誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化，以確定更合適的蛋白誘導(dǎo)條件，未來(lái)工作中還可以通過(guò)提高蛋白的可溶性等方面來(lái)提高蛋白的表達(dá)及活性［22］，從而進(jìn)一步提高糖苷化合物的產(chǎn)量。另外，可以對(duì)ugt73b6基因進(jìn)行易錯(cuò)PCR篩選以及定點(diǎn)飽和突變，從而得到催化效率更高的突變體，以提高產(chǎn)物的產(chǎn)量；并且可以進(jìn)一步探索糖基轉(zhuǎn)移酶ugt73b6的底物寬泛性，研究該酶對(duì)底物的催化規(guī)律。

生物轉(zhuǎn)化法修飾天然產(chǎn)物，不僅僅應(yīng)用于酚類(lèi)化合物，還可以應(yīng)用于萜類(lèi)、甾體類(lèi)、生物堿以及黃酮類(lèi)等多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型的化合物，在增加天然化合物的結(jié)構(gòu)多樣性方面具有極大的潛力［23］。我國(guó)天然產(chǎn)物資源豐富，在天然化合物領(lǐng)域擁有良好的研究基礎(chǔ)，目前已經(jīng)分離鑒定了大量的不同結(jié)構(gòu)類(lèi)型的天然產(chǎn)物，可進(jìn)一步將生物轉(zhuǎn)化技術(shù)引入到天然產(chǎn)物的研究中，包括資源開(kāi)發(fā)、藥物設(shè)計(jì)和新的活性先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)與篩選等各個(gè)環(huán)節(jié)，從而開(kāi)發(fā)出擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、并具有中國(guó)特色的創(chuàng)新藥物［24］。

糖基化可賦予多酚類(lèi)化合物新的特性及生物學(xué)活性，是新藥篩選的一個(gè)重要手段，逐漸成為國(guó)內(nèi)外天然藥物開(kāi)發(fā)利用研究的熱點(diǎn)。本研究中得到的8種糖苷類(lèi)化合物都具有重要的實(shí)用價(jià)值及研究?jī)r(jià)值，研究選取的7種酚類(lèi)化合物底物，其中，白藜蘆醇是天然的抗氧化劑，能夠降低血液黏稠度、保持血液暢通等；間甲基苯酚主要用作農(nóng)藥中間體，生產(chǎn)殺蟲(chóng)劑；4-甲氧基苯酚可用作乙烯基型塑料單體的阻聚劑、紫外線抑制劑和化妝品的抗氧化劑等；愈創(chuàng)木酚和3，5-二羥基甲苯多用于香料、染料的合成；香豆酸和對(duì)羥基苯丙酸是重要的醫(yī)藥和材料中間體。糖基化也許能夠賦予它們新的生物活性，為進(jìn)一步研究其藥用功能奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究在大腸桿菌BL（DE3）中，利用糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73B6，飼喂7種不同底物，成功獲得相對(duì)應(yīng)的糖苷化合物。不僅展示了糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73B6對(duì)酚類(lèi)化合物的底物寬泛性，并且為天然化合物的分子結(jié)構(gòu)修飾提供了一種新的途徑。

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Biocatalysis of Phenolic Glycosides Natural Products in Escherichia coli Strain Using UGT73B6

HE Qing-lin1，2BAI Yan-fen2ZHOU Wei2YIN Hua2CHEN Ning1ZHUANG Yi-bin2LIU Tao2
（1. School of Biological Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457；2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Science；Tianjin 300308）

The glycosyltransferase UGT73B6 from Rhodiola sachalinensis with substrate flexibility can glycosylate many natural products catalyzed by UDP-glycosyltransferases（UGTs）. To achieve the biosynthesis of phenolic compounds in Escherichia coli，in this study，we utilized the catalytic activity of the glycosyltransferase UGT73B6 and fed 7 different phenolic compounds in Escherichia coli BL21（DE3）.By using biotransformation，we successfully achieved the biocatalysis of 8 glycoside compounds for the first time in Escherichia coli with UGT73B6，and further we explored the substrate flexibility of UGT73B6. On the basis of this study，we provided an effective and economical method to produce phenolic glycosides by microbial transformation，which has a great application value.

glycosyltransferase UGT73B6；biotransformation；phenolic glycosides；Escherichia coli

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0363

2017-06-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31400026，21302214），中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略生物資源服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計(jì)劃項(xiàng)目（ZSTH-023）

何慶林，男，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物合成生物學(xué)；E-mail：15002262485@126.com

莊以彬，男，博士，研究方向：天然產(chǎn)物合成生物學(xué)；E-mail：zhuang_yb@tib.cas.cn劉濤，男，博士，研究員，研究方向：天然產(chǎn)物合成生物學(xué)；E-mail：liu_t@tib.cas.cn

（責(zé)任編輯 朱琳峰）