王利杰 余曉斌 方銀兵 顧秋亞

（1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122；2. 寧波中瑞生物科技有限公司，寧波 315821）

可抑制致病菌的益生菌篩選及抑菌物質(zhì)的初步確定

王利杰1余曉斌1方銀兵2顧秋亞1

（1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122；2. 寧波中瑞生物科技有限公司，寧波 315821）

為了得到可抑制致病菌的益生菌并初步確定其抑菌物質(zhì)。從土壤、飼料添加劑和肥料添加劑3種樣品中初篩能產(chǎn)生抑菌圈的菌株。用牛津杯法，對(duì)初篩得到的菌株和實(shí)驗(yàn)室保存的菌株進(jìn)行復(fù)篩。對(duì)復(fù)篩的未知菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、16S rRNA基因序列和生理生化特征鑒定。對(duì)復(fù)篩菌株的發(fā)酵上清液進(jìn)行酸堿作用驗(yàn)證、高溫處理、蛋白酶處理、鹽析處理和透析處理，再進(jìn)行抑菌活力測定。結(jié)果顯示復(fù)篩中有8株對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌都有較強(qiáng)抑制作用的菌株。8株菌中有4株已知菌，4株未知菌。已知菌株分別為保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌。4株未知菌中3株被鑒定為地衣芽孢桿菌，1株被鑒定為乳酸片球菌。地衣芽孢桿菌能產(chǎn)生多種耐高溫的抑菌物質(zhì)，其中包含能透過8-14 kD透析袋的小分子和不能透過8-14 kD透析袋的大分子，初步判定為多肽類物質(zhì)。5株產(chǎn)酸菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要是酸性物質(zhì)。

益生菌；牛津杯法；16S rRNA；抑菌物質(zhì)

抗生素為人類作出了巨大的貢獻(xiàn)，但由于抗生素濫用，也讓人們?cè)絹碓揭庾R(shí)到抗生素的危害性。從瑞典1986年在養(yǎng)殖行業(yè)首次禁抗，到2006年歐盟全面禁止使用促生長抗生素，再到2015年我國要求停止生產(chǎn)用于食品動(dòng)物的部分抗生素制劑。這些都表明無抗養(yǎng)殖已經(jīng)成為今后的發(fā)展趨勢(shì)，開發(fā)新型無抗飼料添加劑，對(duì)于國家及企業(yè)，都有迫切的需求［1］。

益生菌是指能夠以一定數(shù)量存活并定殖于宿主腸道內(nèi)，通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，對(duì)宿主健康發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱［2］。其主要通過與動(dòng)物消化道內(nèi)各種微生相互作用，來改善微生物和酶的平衡，從而改善動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)、抑制有害菌和提高免疫力［3］。研究表明，某些乳酸菌能產(chǎn)生細(xì)菌素［4-8］，芽孢桿菌能產(chǎn)生抗菌肽或者是抗菌蛋白［9，10］等。目前國內(nèi)外針對(duì)可抑制致病菌的益生菌的篩選，也主要集中在乳酸菌和芽孢桿菌上。例如，有關(guān)研究篩選到可抑制致病菌的干酪乳桿菌［6］、植物乳桿菌［8］等乳酸菌，以及可抑制致病菌的淀粉液化芽孢桿菌［11］、側(cè)孢短芽孢桿菌［12］等芽孢桿菌。

基于畜禽生態(tài)平衡理論推出的新型無抗微生物飼料添加劑，是近年來開發(fā)主要方向。目前已有益生菌作為飼料添加劑的相關(guān)研究［13-14］。但益生菌飼料添加劑的作用機(jī)理尚未研究透徹，優(yōu)良菌種缺乏，可用于微生態(tài)制劑的菌種較少，同時(shí)相關(guān)產(chǎn)品較為單一，復(fù)合菌劑的開發(fā)成為重點(diǎn)［15］。因此，篩選優(yōu)良益生菌，探索其中機(jī)理，完善配套應(yīng)用技術(shù)等方面急需深入研究［16］。本實(shí)驗(yàn)主要通過從土壤、飼料添加劑和肥料添加劑樣品中分離到有抑菌效果的菌株。通過牛津杯法和實(shí)驗(yàn)室保存的大量菌株，同時(shí)進(jìn)行抑菌活力的測定，從而篩選到多種能夠明顯抑制致病菌的菌株，再通過試驗(yàn)初步確定抑菌物質(zhì)的類型，為進(jìn)一步開發(fā)研制無抗飼料添加劑等微生物制劑提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品和待測菌種 樣品為土壤、肥料添加劑和飼料添加劑。菌種為本實(shí)驗(yàn)室分離保存的4株產(chǎn)酸菌株，分別為保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）以及23株未知菌株。實(shí)驗(yàn)室保存的菌株源自市售酸奶發(fā)酵劑、益生菌藥品和保健品，以及市售可食用發(fā)酵制劑。

1.1.2 主要儀器 TC-5000 PCR儀：英國TECHEN；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠，Kylin-Bell VORTEX-5：江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司，牛津杯規(guī)格：內(nèi)徑（6.0±0.1）mm、外徑（8.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm。培養(yǎng)皿規(guī)格：內(nèi)徑（90.0±0.1）mm，高（16.5±0.1）mm（上海儀翀科技發(fā)展有限公司）。

1.1.3 指示菌 大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和藤黃微球菌（Micrococcus luteus）都為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.4 主要培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）、MRS固體培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌株的初篩 采用涂布平板法［17］：精確稱取10 g樣品，放入90 mL含有玻璃珠的0.85%的生理鹽水中，37℃、180 r/min震蕩30 min，80℃水浴10 min。然后將樣品進(jìn)行10倍系列的梯度稀釋，分別吸取稀釋倍數(shù)為10-4、10-5、10-6、10-7的樣品100 μL，涂布于LB平板上，37℃培養(yǎng)24 h。挑取能產(chǎn)生抑菌圈的菌落，分離純化，編號(hào)保存。不經(jīng)水浴加熱，同樣采取涂布平板法將樣品涂布于含1%CaCO3的MRS平板上，挑取有溶鈣圈的菌株，分離純化，編號(hào)保存［18］。

1.2.2 牛津杯法復(fù)篩［19］檢測平板的制備：用接種環(huán)挑取在LB平板上生長24 h的指示菌，接到含有生理鹽水的無菌試管中，用旋渦震蕩器震蕩均勻，進(jìn)行不同倍數(shù)的梯度稀釋，再震蕩均勻，測定OD600值后備用。分別吸取800 μL、OD600為1.6的3種指示菌菌懸液于無菌平板中，然后將滅菌的LB培養(yǎng)基冷卻至50-60℃，精確量取20 mL，迅速倒入加過指示菌懸液的平板中，輕輕搖勻，冷卻備用。

發(fā)酵上清液的制備：LB培養(yǎng)基初篩得到的菌株在LB平板上37℃培養(yǎng)24 h，接種在肉湯培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，再以4%的接種量轉(zhuǎn)接在肉湯培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。取樣，在4℃，8 000 r/min，離心5 min，取上清，用孔徑為0.22 μm的水系針頭濾器過濾到無菌離心管中備用。以同樣的方法和條件將產(chǎn)酸菌株在MRS固、液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后制備發(fā)酵上清液。

抑菌活力的測定：對(duì)初篩的菌株進(jìn)行復(fù)篩：分別吸取初篩得到的菌株和實(shí)驗(yàn)室保存的菌株的發(fā)酵上清液200 μL，加入對(duì)應(yīng)編號(hào)的3種檢測平板的牛津杯中，37℃培養(yǎng)24 h，每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)平行，拍照并測量抑菌圈直徑，直徑取3個(gè)平行的平均值。

1.2.3 菌株的形態(tài)觀察及16S rRNA序列分析 對(duì)復(fù)篩得到的菌落形態(tài)特征進(jìn)行觀察，革蘭氏染色，芽孢染色并鏡檢。分別對(duì)各個(gè)未知菌株的基因組進(jìn)行提取、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收和送樣測序。測序序列結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中用Blast軟件搜索近似序列，將所測得的序列和從GenBank中獲得的相關(guān)種屬的16S rRNA基因序列。運(yùn)用Mega6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用鄰接法（Neighbor-joining）進(jìn)行發(fā)育樹分析。

1.2.4 生理生化特征鑒定 對(duì)復(fù)篩得到的未知菌株的生理生化特征進(jìn)行鑒定［20-21］，主要進(jìn)行了V-P測定、淀粉水解、明膠液化、厭氧生長、硝酸鹽還原、過氧化氫酶反應(yīng)，糖利用情況等試驗(yàn)。

1.2.5 抑菌物質(zhì)的初步確定 為了確定復(fù)篩菌株發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)的性質(zhì)，進(jìn)行了如下4種不同的試驗(yàn)。

酸堿作用的驗(yàn)證：測量發(fā)酵上清液的pH，并用3 mol/L的NaOH或3 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH變化較大的發(fā)酵上清液，調(diào)至與發(fā)酵前一致（發(fā)酵前NB培養(yǎng)基pH為7.2，MRS液體培養(yǎng)基pH為6.4），分別吸取調(diào)過pH的發(fā)酵上清液和不調(diào)pH的發(fā)酵上清液，進(jìn)行抑菌活力測定。

高溫處理：將發(fā)酵上清液經(jīng)115℃、30 min高溫處理和不經(jīng)高溫處理，分別進(jìn)行抑菌活力測定。

蛋白酶處理：將一定濃度的蛋白酶k和胃蛋白酶溶液分別加入發(fā)酵上清液，使酶的終濃度為2 mg/mL。調(diào)節(jié)加入蛋白酶k的上清液至pH為7，加入胃蛋白酶的上清液pH為3，37℃溫育4 h，再調(diào)回原來的pH，進(jìn)行抑菌活力的測定。

鹽析處理：取10 mL發(fā)酵上清液，向其中加入硫酸銨至飽和度為65%，進(jìn)行鹽析。用pH為7的磷酸鹽緩沖液將沉淀定容至10 mL，用3.5 kD的透析袋除鹽后和磷酸鹽緩沖液分別進(jìn)行抑菌活力的測定。

透析處理：將10 mL發(fā)酵上清液經(jīng)8-14 kD的透析袋透析處理，將透析袋內(nèi)液和外液分別濃縮至1 mL，并用磷酸鹽緩沖液定容至10 mL，分別進(jìn)行抑菌活力的測定。

2 結(jié)果

2.1 菌種的初篩

根據(jù)不同的樣品，采用涂布平板法進(jìn)行篩選，得到35株能產(chǎn)抑菌圈的菌株。其中6株來自土壤，8株來自肥料添加劑，21株來自飼料添加劑。經(jīng)溶鈣圈試驗(yàn)，其中5株是產(chǎn)酸菌株。

2.2 牛津杯法復(fù)篩

將初篩得到的35株菌株和實(shí)驗(yàn)室保存的27株菌株，用牛津杯法進(jìn)行抑菌活力的測定，部分抑菌效果見圖1。結(jié)果顯示，其中8株菌株的發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌都有明顯的抑制作用。將8株抑菌效果明顯的菌株分別命名為，YB1、YB2、YB3、L-B、L-C、L-R、L-P和BH。其中BH篩選自土壤，YB1篩選自飼料添加劑，YB2和YB3篩選自肥料添加劑。L-B、L-C、L-R和L-P為本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株，分別為保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌。L-B源自市售酸奶，L-C、L-R和L-P源自市售可食用發(fā)酵制劑。通過溶鈣圈觀察，L-B、L-C、L-R、L-P和BH為產(chǎn)酸菌株。

圖1 抑菌效果圖

2.3 菌株的形態(tài)及16S rRNA序列分析

YB1、YB2和YB3在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，BH在MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察（圖2）。YB1、YB2和YB3形態(tài)特征相似，菌落都為圓形，表面光亮，邊緣有微列齒，革蘭氏染色呈陽性，芽孢染色并鏡檢顯示，菌體桿狀，有芽孢且芽孢中生或側(cè)生；BH菌落圓形，表面濕潤，中間有乳白色隆起，革蘭氏染色呈陽性，芽孢染色并鏡檢顯示，菌體球狀、大多數(shù)為多個(gè)聚集在一起，無芽孢。由此確定YB1、YB2和YB3為芽孢桿菌，BH為球菌。

圖 2 菌落和菌體形態(tài)特征圖

將菌株YB1、YB2、YB3和BH的16S rRNA序列分別在GenBank中進(jìn)行Blast序列比對(duì)，然后進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。用Neighbor-joining進(jìn)行發(fā)育樹分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，YB1、YB2、YB3和地衣芽孢桿（Bacillus licheniformis）聚在一個(gè)分支上，且同源性≥99%，和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性為97%。BH與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）聚在一個(gè)分支上，且同源性為100%。綜合形態(tài)學(xué)以及16S rRNA序列的分析，確定YB1、YB2和YB3為地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌，BH為乳酸片球菌。

2.4 生理生化特征鑒定

圖3 基于16S rRNA序列的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)形態(tài)學(xué)特征以及16S rRNA的結(jié)果，進(jìn)行有針對(duì)性的生理生化測定。4株菌的部分生理生化特征鑒定結(jié)果見表1。由表1可知，YB1、YB2和YB3的V-P測定，淀粉水解等生理生化特性一致。由生理生化特征可知YB1、YB2和YB3在厭氧情況下能夠生長，通過《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》可知地衣芽孢桿菌能夠在厭氧條件下生長，而枯草芽孢桿菌不能在厭氧條件下生長，所以可以確定YB1、YB2和YB3同為地衣芽孢桿菌。BH的生理生化特征和形態(tài)學(xué)特征以及16S rRNA結(jié)果一致，確定為乳酸片球菌。將YB1、YB2、YB3和BH序列提交至NCBI，分別獲得登錄號(hào)，MF326578、MF326579、MF326580和 MF326581。

表1 生理生化特征

2.5 抑菌物質(zhì)的初步確定

2.5.1 酸堿作用的驗(yàn)證 對(duì)培養(yǎng)液發(fā)酵前后的pH進(jìn)行測定，芽孢桿菌的發(fā)酵上清液pH和發(fā)酵前比較，基本不變，在7.2左右。5株產(chǎn)酸菌上清液發(fā)酵前pH為6.4，發(fā)酵后明顯降低，將產(chǎn)酸菌株的發(fā)酵上清液pH調(diào)至6.4，再做抑菌活力的測定，結(jié)果見表2。由表2可以看出，pH調(diào)回6.4的發(fā)酵上清液和不調(diào)pH的上清液相比，對(duì)金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的抑菌圈直徑減少6.0-12.0 mm，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑減少0.6-2.0 mm，抑菌效果明顯減弱。

2.5.2 高溫處理 為了研究發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)經(jīng)過高溫處理后是否仍然保持抑菌活性，對(duì)發(fā)酵上清液經(jīng)過115℃的高溫處理30 min和不經(jīng)高溫處理的發(fā)酵上清液作對(duì)比進(jìn)行抑菌活力測定。結(jié)果（表3）顯示，發(fā)酵上清液高溫處理相對(duì)于不經(jīng)高溫處理，3株芽孢桿菌對(duì)藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑減少了2.0-6.0 mm，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑減少了0.5-1.0 mm。5株產(chǎn)酸菌株對(duì)金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的抑菌圈直徑減少0.4-3.0 mm，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑減少0.0-1.0 mm。

表2 產(chǎn)酸菌株調(diào)節(jié)pH前后的抑菌圈直徑（mm）

表3 加熱處理和不加熱處理的抑菌圈直徑（mm）

2.5.3 蛋白酶處理和鹽析處理 發(fā)酵上清液經(jīng)蛋白酶k處理和胃蛋白酶處理前后，進(jìn)行抑菌活力測定，抑菌圈直徑大小相近。由此表明發(fā)酵上清液中產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶K處理和胃蛋白酶不敏感。將發(fā)酵上清液經(jīng)鹽析處理，沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，再透析除鹽后做抑菌活力的測定，測定結(jié)果如表4。由表4可知，3株芽孢桿菌的鹽析沉淀溶解液的抑菌圈直徑大小相近。和對(duì)照相比，3株芽孢桿菌的鹽析沉淀溶解液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌的抑菌圈直徑分別增加了2.8-3.2 mm，13.0-14 mm，5.8-6.4 mm。5株產(chǎn)酸菌株鹽析沉淀溶解液產(chǎn)生的抑菌圈直徑和對(duì)照大小接近。

2.5.4 透析處理 為了確定抑菌物質(zhì)的大致分子量，將各個(gè)菌株的發(fā)酵上清液，經(jīng)透析處理，透析袋內(nèi)保留液和外液分別濃縮并用磷酸鹽緩沖液定容后，進(jìn)行抑菌活力的測定。測定結(jié)果見表5，由表5可知，3株芽孢桿菌抑菌圈直徑大小相近，相對(duì)于對(duì)照，透析內(nèi)液、外液都有更大的抑菌圈直徑。且透析內(nèi)外液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大；藤黃微球菌的抑菌圈直徑次之；大腸桿菌的抑菌圈直徑最小。而5株產(chǎn)酸菌株的透析內(nèi)液產(chǎn)生的抑菌圈大小和對(duì)照相近，透析外液能產(chǎn)生更大的抑菌圈直徑，且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大，藤黃微球菌的抑菌圈直徑次之，大腸桿菌的抑菌圈直徑最小。

表4 鹽析處理的抑菌圈直徑

3 討論

有關(guān)研究表明，芽孢桿菌能夠抑制番茄葉霉病菌等植物有害菌［22］，適合做活菌制劑形式的添加劑［23］；某些產(chǎn)酸菌株對(duì)李斯特菌，志賀氏菌屬也有抑制作用［24］；多種乳酸菌都能產(chǎn)生細(xì)菌素［4-7］，細(xì)菌素是由某些細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽，能夠抑制多種致病菌。

表5 經(jīng)透析處理的抑菌圈直徑（mm）

本研究篩選到8株可抑制致病菌的益生菌，其中BH篩選自土壤，YB1篩選自飼料添加劑，YB2和YB3篩選自肥料添加劑。實(shí)驗(yàn)室保存的保加利亞乳桿菌源自市售酸奶，干酪乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌源自于市售的可食用發(fā)酵制劑中。地衣芽孢桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌和乳酸片球菌都是農(nóng)業(yè)部規(guī)定的安全微生物，可用于養(yǎng)殖動(dòng)物［25］。經(jīng)過大量抑菌活力測定得知這8株菌抑菌活力最強(qiáng)，有望應(yīng)用于混菌發(fā)酵開發(fā)新型無抗飼料添加劑。

經(jīng)抑菌物質(zhì)的分析試驗(yàn)可知，地衣芽孢桿菌發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)非酸堿，而是產(chǎn)生了其它抑菌活性物質(zhì)，這和已知研究地衣芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)［22，26-27］相吻合；經(jīng)過高溫處理、蛋白酶處理和鹽析處理可知，抑菌物質(zhì)具有耐高溫特性，對(duì)蛋白酶K和胃蛋白酶不敏感，鹽析產(chǎn)物抑菌效果較強(qiáng)，由此分析抑菌物質(zhì)可能是一種抗菌肽，和報(bào)道某些芽孢桿菌能產(chǎn)生耐高溫抗菌肽［10］結(jié)果一致。經(jīng)透析處理內(nèi)外液都有較強(qiáng)的抑菌活性，可以判斷有多種抑菌物質(zhì)，且有些是能透過8-14 kD的小分子物質(zhì)，有些是不能透過8-14 kD的大分子物質(zhì)。5株產(chǎn)酸菌株，發(fā)酵上清液的抑菌作用主要是由于產(chǎn)生酸性物質(zhì)引起的，調(diào)節(jié)pH后仍有部分抑菌活性，表明產(chǎn)酸菌株發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)除了酸外，還有其它抑菌物質(zhì)，這和已知研究乳酸片球菌能產(chǎn)生乳酸片球菌素［28］的結(jié)果相似；經(jīng)高溫處理，鹽析處理，透析處理和蛋白酶處理可知，產(chǎn)酸菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有耐高溫性能，不產(chǎn)生或者產(chǎn)生很少量的抗菌蛋白或者多肽類物質(zhì)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)篩選到8株對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌3種致病菌均有較強(qiáng)抑制作用的菌株。其中3株均為地衣芽孢桿菌，5株產(chǎn)酸菌株分別為保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌和乳酸片球菌。其中3株地衣芽孢桿菌能產(chǎn)生多種耐高溫的抑菌物質(zhì)，該抑菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶K和胃蛋白酶不敏感，可能是多肽類物質(zhì)，其包含能透過8-14 kD透析袋的小分子肽和不能透過8-14 kD透析袋的大分子肽。5株產(chǎn)酸菌株產(chǎn)生的耐高溫抑菌物質(zhì)主要是酸性物質(zhì)。

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Screening of Probiotics for Inhibiting Pathogens and Preliminary Determination of Antimicrobial Substances

WANG Li-jie1YU Xiao-bin1FANG Yin-bing2GU Qiu-ya1
（1. The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122 ；2.Ningbo Zhongrui Biotechnology Co.，Ltd. Ningbo 315821）

In order to obtain probiotics that inhibit pathogens and to determine their antimicrobial substances，strains that can produce inhibitory zones were isolated from the soil，feed additives and fertilizer additives. Strains isolated and preserved in the laboratory were rescreened with the Oxford Cup method. Then the unknown strains were identified with morphological observation，16S rRNA -based phylogeny and physiological and biochemical reaction. The antimicrobial activity of fermentation supernatant was determined after treated by acid-base reaction，high temperature，protease decomposition，salting-out and dialysis. Results showed that 8 strains presented the strong inhibitory effect on Escherichia coli，Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus，and 4 strains were known as Lactobacillus bulgaricus，Lactobacillus casei，Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus plantarum. Three of the 4 unknown strains were identified as Bacillus licheniformis and one was identified as Pediococcus lactis. Bacillus licheniformis can produce a variety of antimicrobial substances with different molecular weights and high temperature resistance，which can or cannot pass through 8-14 kD dialysis bags，and the antimicrobial substances produced by Bacillus licheniformis are preliminarily determined as polypeptide，and antimicrobial substances from 5 acid-producing strains are mainly acidic.

probiotics；Oxford Cup method；16S rRNA；antimicrobial substances

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0411

2017-05-26

新型高效無抗生物飼料添加劑的研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化（201501CX-D01037）

王利杰，男，碩士研究生，研究方向：功能微生物；E-mail：2454792926@qq.com

余曉斌，男，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向：發(fā)酵法生產(chǎn)功能性食品/因子酶技術(shù)；E-mail：xbyu@jiangnan.edu.cn

（責(zé)任編輯 朱琳峰）