周振宇 胡金麗 蘇昕 劉冬雪 卜寧 馬蓮菊

（沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 沈陽 110034）

一株野大豆內(nèi)生真菌YD02菌株的鑒定及抗逆性研究

周振宇 胡金麗 蘇昕 劉冬雪 卜寧 馬蓮菊

（沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 沈陽 110034）

從野大豆組織中分離篩選出1株內(nèi)生真菌菌株YD02，通過形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)方法對該菌株進(jìn)行鑒定；用單因素實驗和正交試驗確定菌株的最佳發(fā)酵條件；采用菌絲干重法和對峙培養(yǎng)法分別測定菌株的抗重金屬鎘脅迫的能力以及對植物病原菌的影響。結(jié)果表明：YD02菌落黑色或墨綠色，菌絲分支且產(chǎn)孢；為鏈格孢屬（Alternaria Nees）菌株；其最佳發(fā)酵條件是以PDB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，蔗糖 4%，氯化銨 0.6%，磷酸氫二鉀 0.4%，硫酸鎂0.05%，pH5或pH9，培養(yǎng)溫度28℃，裝液量為60%，120 r/min發(fā)酵60 h；當(dāng)鎘濃度為140 mg/L時，YD02正常生長幾乎停止。YD02菌株對瓜果腐霉病和蘋果霉心病的病原菌具明顯拮抗作用，抑菌率分別達(dá)到64.15%和71.68%。

野大豆；內(nèi)生真菌；鑒定；抗逆性

植物內(nèi)生菌是指其生活史中某一階段或整個階段生活在生長在健康的植物組織或細(xì)胞內(nèi)，并對宿主植物沒有引起明顯病害癥狀的一類微生物群［1-2］。內(nèi)生真菌廣泛存在于植物根、莖、葉、花和果實等部位［3-4］。一些植物內(nèi)生菌在植物體內(nèi)進(jìn)行代謝會產(chǎn)生促進(jìn)植物生長的物質(zhì)，諸如生長素、赤霉素等［5］。許多資料表明植物與內(nèi)生菌的共生作用會增強(qiáng)植株的抗逆性［6-7］。大豆作為重要的糧食作物，與人類的生產(chǎn)生活息息相關(guān)。有研究表明，栽培大豆在進(jìn)化的過程中失去一些野大豆具有的優(yōu)良屬性，其中最明顯的表現(xiàn)是失去了抗旱、抗鹽、抗重金屬等特性［8-10］。栽培大豆在進(jìn)化過程中不僅基因發(fā)生變異，同時野大豆原本具有的內(nèi)生菌在栽培大豆中也逐漸失去［11］。本研究以分離得到的野大豆內(nèi)生真菌YD02為研究對象，探究其抗重金屬鎘脅迫和抗植物病原菌的能力，旨為其資源開發(fā)和潛在應(yīng)用價值的挖掘提供一定的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2016年9月于遼寧省沈陽市蒲河濕地采集完野大豆整植株，將其裝入滅菌的自封紙袋中，取樣后于24 h內(nèi)進(jìn)行組織分離。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%，121℃滅菌30 min；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）：馬鈴薯20%、葡萄糖2%，121℃滅菌30 min；含鎘培養(yǎng)基：在PDB中分別加入CdCl2，使培養(yǎng)基中Cd2+濃度分別為 0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 g/L；含鹽培養(yǎng)基：在PDB中分別加入NaCl，使培養(yǎng)基中含鈉離子濃度分別為3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%。

1.1.3 試劑 真菌基因組DNA快速抽提試劑盒、ITS序列擴(kuò)增引物與其余藥品及試劑均購自生工生物（上海）股份有限公司。

1.1.4 供試菌株見表1。

1.2 方法

1.2.1 野大豆內(nèi)生真菌的分離純化 將供試野大豆植株根莖葉先用自來水沖洗掉表面的泥土，再用無菌水進(jìn)一步?jīng)_洗，用75%乙醇浸泡1 min，無菌蒸餾水沖洗3-4次，0.1%升汞浸泡30-40 s，無菌水沖洗3-4次。用無菌刀片將根、莖和葉健康組織切成5-10 mm大小組織塊，分別貼放于PDA平板上，同時將最后一遍沖洗的無菌水涂布平板作為對照，于28℃培養(yǎng)數(shù)天。觀察對照平板有無雜菌污染，若無污染，則可將放有組織塊培養(yǎng)平板上長出的菌落進(jìn)行傳代培養(yǎng)，直至平板內(nèi)菌落形態(tài)一致，4℃斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 YD02菌株的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：菌絲形態(tài)觀察采用直接壓片法，于光鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài)，菌落形態(tài)觀察采用平板培養(yǎng)法，觀察菌落正反面的形態(tài)、顏色等特征。分子生物學(xué)鑒定：用真菌基因組快速提取試劑盒提取YD02菌株的基因組DNA。以菌株YD02 基因組DNA為模板，18S-ITS1：5'-TCCG-TAGGTGAACCTGCGG-3'和18S-ITS4：5'-TCCTCCG-CTTATTGATATGC-3'為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。采用50 μL PCR 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 3 min；95℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行同源性序列分析與比對。根據(jù)測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 供試菌株

1.2.3 YD02菌株生長特性測定

1.2.3.1 菌株生長曲線的測定 挑取備用菌絲至50 mL PDB培養(yǎng)基中，120 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，制備菌懸液。接種菌懸液到新的50 mL PDB培養(yǎng)基中（每瓶 1 mL），分別在 0、20、40、60、80、100、120、140、160、180和200 h取樣品，每組做3個平行，以不加菌作對照。28℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)。將濾紙?zhí)崆? d于37℃烘干至恒重，稱重，將菌絲進(jìn)行抽濾并用無菌水進(jìn)行沖洗后37℃烘干至恒重，計算菌絲干重。

1.2.3.2 初始pH對YD02菌株生長的影響 將YD02菌液分別轉(zhuǎn)接到pH 為1、3、5、7、9、11、13的50 mL PDB培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)60 h，測量菌菌絲干重，每組做3個平行，以不加菌作為對照。

1.2.3.3 鹽濃度對YD02菌株生長的影響 將YD02菌液接種到含鹽（NaCl）濃度分別為0、3、5、7、9、11、13、15的50 mL PDB培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)60 h，測量菌絲干重，每組做3個平行，以不加菌作為對照。

1.2.3.4 裝液量對YD02菌株生長的影響 將YD02菌液轉(zhuǎn)接至含有50、75、100、150 mL PDB培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，28℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)60 h，測量菌絲干重，每組做3個平行，以不加菌作為對照。1.2.3.5 不同碳、氮源對YD02菌株生長的影響 以PDB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入2%的葡萄糖，乳糖，麥芽糖，甘露醇，蔗糖，接種YD02菌液，28℃，120 r/min培養(yǎng)60 h，測量菌絲干重，每組做3個平行，以不加額外碳源作對照，篩選最佳碳源；用相同方法在培養(yǎng)基中加入0.3%的牛肉膏、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀作為供試氮源，以不加氮源為對照，篩選最佳氮源。

1.2.3.6 正交試驗 以馬鈴薯液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加碳源、氮源、NaCl、K2HPO4、MgSO4進(jìn)行四因素五水平正交試驗，正交表見表2。

表2 四因素五水平正交試驗

1.2.4 Cd2+對YD02菌株生長的影響 用氯化鎘調(diào)PDB培養(yǎng)基重金屬含量，設(shè)置鎘濃度分別為0、20、40、60、80、100、120、140、160、180 和 200 g/L共7個實驗組，接種制備好的的YD02菌液，28℃，120 r/min振蕩培60 h，測量菌絲干重，每組做3個平行，以不加菌作為對照。

1.2.5 YD02菌株抑菌活性的測定 采用對峙培養(yǎng)法測定YD02菌株對10種植物病原菌的抑菌活性。分別將直徑6 mm的病原菌菌塊放于平板中央，然后等距離點接菌株，放置培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)至菌體長滿平板，觀察有無抑菌圈及抑菌圈大小，計算抑菌率。

抑菌率（%）=r2-（d-r1）/r2×100%

2 結(jié)果

2.1 野大豆內(nèi)生真菌株的分離鑒定

經(jīng)組織分離法自野大豆分離篩選得到1株植物內(nèi)生真菌YD02。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，該菌株在固體培養(yǎng)菌落呈黑色或墨綠色，中央菌絲呈墨綠色或黑色，周圍菌絲呈白色，均呈絨狀，菌落正反面顏色不一，生長迅速。菌絲分支且產(chǎn)孢，隔和縱隔的壁磚狀分隔，暗褐色，常數(shù)個成鏈（圖1）。

圖1 YD02菌落形態(tài)、孢子和菌絲

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

YD02菌株的 18S rDNA 序列經(jīng) BLAST 比對，可鑒定菌株為鏈格孢屬（Alternaria Nees），基因同源相似度達(dá)99%.基于 18S r DNA利用MEGA 6.0 構(gòu)建YD02菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖 2），由圖可知菌株YD02與菌株KU728276.1_Fungal_sp._strain_LBF13同源性最高。

2.3 YD02菌株生長曲線

菌株在生長第48 h進(jìn)入對數(shù)期，在120 h為對數(shù)期的最高點。120 h至168 h為菌株生長的平臺期，168 h之后進(jìn)入衰亡期（圖3）。

圖2 YD02菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 YD02菌株的生長曲線

2.4 YD02菌株生長條件優(yōu)化

2.4.1 pH對菌株生長的影響 初始pH值在1-11之間時，菌株均能生長，其中當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為5和9時，菌絲干重達(dá)到最大值，說明菌株在偏酸和偏堿的環(huán)境下均能達(dá)到最佳生長點（圖4）。

圖4 初始pH對YD02菌株生長的影響

2.4.2 鹽（NaCl）濃度對YD02菌株生長情況的影響 當(dāng)培養(yǎng)基的初始鹽濃度在0-15%之間時，菌株均能生長，初始鹽濃度為5%時，菌株的生長狀況最為良好（圖5）。

圖5 鹽脅迫對YD02菌株生長的影響

2.4.3 裝液量對菌株生長的影響 菌株在裝液量為50、75、100、150 mL的 PDB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中均能生長，其中當(dāng)裝液量為150（60%）時，菌株生長狀況最好（圖6）。

圖6 裝液量對YD02菌株生長的影響

2.4.4 不同碳氮源對菌株生長的影響 對比5種碳源對菌株生長的影響可見，加入碳源后菌株的生長狀況與未加碳源相比差異極顯著。以蔗糖為碳源培養(yǎng)菌株相比于對照組生長狀況提高最為顯著（圖7）。

圖7 不同碳源對YD02菌株生長的影響

同樣，培養(yǎng)基中加入氮源與未加氮源相比，菌株的生長狀況有顯著差異。其中加入氯化銨后與對照組相比菌絲干重的提高最為顯著（圖8）。

圖8 不同氮源對YD02菌株生長的影響

由 R 值大小得各因素作用的主次順序為：碳源（蔗糖）＞鹽（氯化鈉）＞氮源（氯化銨）＞緩沖物質(zhì)（磷酸氫二鉀）＞無機(jī)鹽（硫酸鎂）。由上述發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗結(jié)果中的各列 K 值可知：碳源蔗糖的最適濃度為 A4，氮源氯化銨的最適濃度為 B4，氯化鈉的最佳濃度為 C1，磷酸氫二鉀的最適濃度為D4，硫酸鎂的最適濃度為E2。可確定菌株 YD02的發(fā)酵培養(yǎng)基的最好水平組合為 A4 B4 C1 D4 E2，即：蔗糖 4%（40 g/L），氯化銨 0.6%、（6 g/L），氯化鈉 0，磷酸氫二鉀 0.4%（4 g/L），硫酸鎂0.05%（0.5 g/L）。

2.5 重金屬鎘影響下的菌株生長情況測定

菌體耐重金屬鎘的性能較好，在鎘濃度為60 mg/L時，菌體的耐性最好，生長狀況最為良好，在140 mg/L時依舊可以生長（圖9）。

圖9 鎘脅迫對YD02菌株生長的影響

2.6 YD02菌株對植物病原真菌的抑菌拮抗作用

YD02菌株對10株供試病原菌進(jìn)行抑菌測試，結(jié)果（圖10）表明YD02菌株對瓜果腐霉和蘋果霉心病菌具有顯著的抑菌效果，經(jīng)測定，對瓜果腐霉和蘋果霉心病菌的抑菌半徑分別為0.833 cm和1.433 cm，計算抑菌率分別為64.15%和71.68%，抑菌效果顯著，可對部分植物病原菌針對性的防治中具有較大的應(yīng)用潛力。

圖10 YD02菌株抑菌作用

3 討論

野大豆具有栽培大豆所不具備的眾多優(yōu)良屬性，與其特有的內(nèi)生菌密切相關(guān)，這也是當(dāng)下的一個重要的研究方向［12-14］。目前使大豆增產(chǎn)主要通過施肥的方式，但與此同時帶來的土壤板結(jié)酸化的問題也日益凸顯，而在抗病蟲害方面也大多通過使用農(nóng)藥的方式，給環(huán)境帶來較大的危害。因此，探尋能促進(jìn)大豆生長，對不良環(huán)境有抵御能力的內(nèi)生菌成為當(dāng)前研究的目標(biāo)。

本實驗從野大豆中分離獲得的內(nèi)生真菌YD02表現(xiàn)出了比較優(yōu)良的耐鹽能力，盛敏等［15］已經(jīng)成功的對玉米接種了AM真菌，接種后的玉米表現(xiàn)出了比不接種AM真菌的玉米具有更好的抗鹽能力；陳亞平等［16］成功的篩選出了耐鹽真菌，并在水稻上檢驗了其協(xié)助植株抗鹽脅迫的能力。本實驗對YD02的最適pH進(jìn)行了測定，其結(jié)果表明該菌株在pH5、9時生長量均大于中性pH7的點，這表明該菌株具有較好的耐酸耐堿能力，蒙程等［17］將AM真菌接種到紫花苜蓿中，其結(jié)果表明接種后紫花苜蓿具有了一定的耐酸能力。YD02菌株具有較好的耐酸堿能力，這對于日后探究YD02菌株協(xié)助栽培大豆抗酸堿環(huán)境有著一定的指導(dǎo)意義，這使得YD02菌株可以作為生物降解菌的菌株之一。

本實驗對YD02菌株的抑菌效果進(jìn)行了評價，其結(jié)果表明該菌株對于瓜果腐霉和蘋果腐霉有著明顯的抑菌效果，但是對于大豆病原菌的抑菌效果并未進(jìn)行評價，日后可針對于倪佳俊、張維瑞等［19-20］的實驗方案對YD02菌株對于大豆病原菌的抑菌能力進(jìn)行評價，以便日后研究。

4 結(jié)論

野大豆內(nèi)生菌YD02，經(jīng)經(jīng) r DNA-ITS 序列分析鑒定為鏈格孢屬（Alternaria Nees），其在120 h可以到達(dá)最大生長點，在偏酸和偏堿的環(huán)境下均可以達(dá)到最大生長量，其最佳發(fā)酵條件是以PDB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，蔗糖 4%，氯化銨 0.6%，磷酸氫二鉀 0.4%，硫酸鎂0.05%，pH5或pH9，培養(yǎng)溫度28℃，裝液量為60%，120 r/min發(fā)酵60 h，菌株具有優(yōu)良的耐鹽能力和抗重金屬鎘的能力，對瓜果腐霉、蘋果霉心病具有抑菌能力，抑菌率為64.15%和71.68%。

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Identification and Resistance of an Endophytic Fungus YD02 Strain in Wild Glycine soja

ZHOU Zhen-yu HU Jin-li SU Xin LIU Dong-xue BU Ning MA Lian-ju
（College of Life Science，Shenyang Normal University，Shenyang 110034）

The endophytic fungus YD02 was isolated from a wild Glycine soja and identified using morphological feature and molecular biology methods. The single factor experiment and the orthogonal test were applied for determining the optimal fermentation conditions of the strain. Further，dry weight method was used to determine the resistance of the strain on heavy metal Cd stress，and the confrontation culture method was to value its effect on the pathogenic bacteria of plant. The results showed that YD02 colony was black or dark green，hyphae branched and spores produced，and it belonged to Alternaria Nees. The optimal fermentation condition was 4% sucrose，0.6% ammonium chloride，0.4% potassium hydrogen phosphate，0.05% magnesium sulfate，pH 5 or pH 9，culture temperature 28℃ with 60% fluid amount，120 r/min and 60 h fermentation on the base of PDB culture medium. When cadmium concentration reached 140 mg/L，YD02’s growth stopped. YD02 strain presented obvious antagonistic effects on the Pythium aphanidermatum and apple moldy core pathogens，and the bacteriostatic rate was 64.15% and 71.68%，respectively.

wild Glycine soja；endophytic fungus；identification；stress resistance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0403

2017-05-17

國家自然科學(xué)基金項目（31270369；31600314），沈陽市科學(xué)技術(shù)計劃項目（F16-205-1-50）

周振宇，男，碩士研究生，研究方向：資源微生物與應(yīng)用；E-mail：461539637@qq.com

馬蓮菊，女，研究生導(dǎo)師，副教授，研究方向：資源微生物與應(yīng)用；E-mail：744289467@qq.com

（責(zé)任編輯 朱琳峰）