鄒廣平 李雅麗 馮夢薇 楊修 許智偉

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，包頭 014010）

甘草懸浮細(xì)胞肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）基因的克隆及表達(dá)分析

鄒廣平 李雅麗 馮夢薇 楊修 許智偉

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，包頭 014010）

根據(jù)已報(bào)道的刺甘草C4H基因序列（GenBank ID：D87520.1），采用RT-PCR技術(shù)克隆得到烏拉爾甘草懸浮細(xì)胞的C4H基因編碼區(qū)序列，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。另外，采用q-PCR方法對C4H基因受茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）誘導(dǎo)后的表達(dá)模式進(jìn)行分析。所克隆的C4H基因編碼區(qū)開放閱讀框（Opening reading frame，ORF）長為1 515 bp，編碼504 個氨基酸。q-PCR實(shí)驗(yàn)證明C4H基因受MeJA的誘導(dǎo)，在懸浮體系添加MeJA后12 h達(dá)到最高表達(dá)水平。

肉桂酸-4-羥化酶；甘草細(xì)胞；茉莉酸甲酯；表達(dá)分析

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.），別名國老、甜草、甜根子，豆科甘草屬多年生草本植物，是一種補(bǔ)益的中草藥，藥理作用顯著，我國傳統(tǒng)中藥配方制劑的80%都把它作為主要成分。甘草黃酮因其良好的抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗HIV病毒等特性成為甘草中一類主要成分。植物體內(nèi)黃酮類化合物的生物合成均源于苯丙烷代謝途徑，多種含苯丙烷骨架的次生代謝產(chǎn)物都是由這一途徑直接或者間接生成［1］。肉桂酸 -4-羥化酶（Cinnamate 4-hydroxylase，C4H）是苯丙烷代謝途徑的第2 個酶，催化反式肉桂酸生成β香豆酸，是黃酮類化合物合成的關(guān)鍵酶之一，它是植物P450單加氧酶中首個被鑒定、被克隆、被確認(rèn)功能的酶，在植物各組織中均具有很高的活性［2-4］。C4H在轉(zhuǎn)錄水平上的豐度和蛋白質(zhì)水平上的活性能有效影響植物中芳香族化合物和黃酮類化合物的生物合成［5］。茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）是植物次生代謝途徑中最主要的信號分子，它常常作為第二信使參與植物次生代謝物尤其是黃酮類化合物的合成調(diào)控［6］。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已報(bào)道的刺甘草C4H基因序列設(shè)計(jì)引物，用RTPCR從甘草懸浮細(xì)胞中克隆C4H基因的編碼區(qū)并進(jìn)行序列分析，同時通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測了懸浮體系中添加MeJA后各時間段甘草細(xì)胞中C4H 的表達(dá)水平，為深入研究C4H基因在甘草黃酮類化合物生物合成途徑上的分子調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)，對進(jìn)一步構(gòu)建轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)甘草黃酮的基因工程細(xì)胞株具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的甘草品種為烏拉爾甘草，種子購自內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市達(dá)拉特旗。愈傷組織由幼嫩的甘草無菌苗下胚軸和子葉誘導(dǎo)而來，在固體MS培養(yǎng)基附加0.5 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L NAA與0.5 mg/L 6-BA上 培養(yǎng)和繼代。懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)的建立：取6 g分散性強(qiáng)、生長狀態(tài)良好的固體細(xì)胞置于250 mL三角瓶中，120 r/min震蕩培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)基為100 mL液體MS培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，光照強(qiáng)度 36 μmol/m2·s，光照時間 16 h/d，培養(yǎng)溫度 25℃［7］。

總 RNA 抽提試劑盒、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA限制性內(nèi)切酶、T4-DNA 連接酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒和 pUM-T 載體均購自大連寶生物技術(shù)有限公司。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甘草懸浮細(xì)胞總RNA的提取及cDNA的合成 將懸浮培養(yǎng)的甘草細(xì)胞抽濾后迅速轉(zhuǎn)移至研缽中研磨，同時向研缽不間斷地添加液氮，研磨成細(xì)細(xì)的粉末即可?？俁NA提取步驟嚴(yán)格按照TaKaRa Total RNA 提取試劑說明書進(jìn)行操作。以提取的甘草懸浮細(xì)胞總RNA為模板，利用 Prime ScriptTMReverse Transcriptase Kit合成cDNA第一鏈。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中刺甘草C4H基因序列（序列號：D87520.1），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了3對引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的。

表1 三對PCR引物信息

1.2.3 甘草懸浮細(xì)胞C4H基因克隆 用cDNA 作為模版，對C4H基因的3對不同的引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定甘草C4H基因的最適引物。對PCR產(chǎn)物中1 800 bp左右處的條帶進(jìn)行膠回收。通過膠回收（OMEGA Gel Extraction Kit試劑盒）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物與寶生物購買的克隆載體（pMD18-T載體）連接，重組質(zhì)粒pMD18-T-C4H轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。菌落PCR篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒DNA檢測與雙酶切驗(yàn)證。把提取的質(zhì)粒和保存的菌液寄到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序分析。

1.2.4 序列分析 用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接并對其完整開放閱讀框進(jìn)行氨基酸翻譯，得到氨基酸序列，與GenBank中其他植物的C4H蛋白進(jìn)行Blast同源性對比，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。對甘草C4H蛋白進(jìn)行分析（http://web.expasy.org/protparam/），推測C4H蛋白的分子量。利用 ProtScale工 具（http://web.expasy.org/protscale/）對甘草C4H蛋白進(jìn)行親水/疏水性分析。通過PORTER（http://distill.ucd.ie/porter/）進(jìn)行分析，C4H蛋白中各個氨基酸殘基對應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。將C4H基因編碼的氨基酸序列提交 SWISS-MODEL在線分析軟件，預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

1.2.5 甘草細(xì)胞C4H基因在不同MeJA誘導(dǎo)處理時間的表達(dá)分析 以甘草懸浮細(xì)胞系為研究對象，將生長狀態(tài)良好的種子細(xì)胞接種于新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，添加100 μmol/mL的MeJA進(jìn)行誘導(dǎo)，以加入無水乙醇（配置MeJA的溶劑）為對照組，分別在添加后1、3、6、9和12 h取樣，提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，對C4H基因進(jìn)行熒光定量PCR，以Actin作為內(nèi)參基因，參照2×SYBR Prime Script TM RT-PCR Kit（TaKara）熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量試驗(yàn)。采用2（-△△Ct）法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 甘草細(xì)胞總RNA的提取

紫外可見分光光度計(jì)測得RNA 的OD260/280在1.8-2.2之間，濃度在1 000 ng/μL 左右。電泳結(jié)果（圖1）顯示，28S及18S rRNA兩條主帶清晰可見，且不含有 DNA 及蛋白質(zhì)雜帶。RNA質(zhì)量良好，可用于反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA。

圖1 甘草細(xì)胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 甘草懸浮細(xì)胞C4H基因克隆

對3對不同的引物分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到第二對引物為甘草C4H基因的最適引物，進(jìn)行50 μL體外擴(kuò)增（圖2）。對PCR產(chǎn)物中1 800 bp左右處的條帶進(jìn)行膠回收，將回收的片段與pMD18-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，37℃過夜倒置培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。挑取單菌落6 個，按體系進(jìn)行菌落PCR檢驗(yàn)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖3中可見3號菌落中目的基因已被插入，挑取該菌落培養(yǎng)。

圖2 甘草細(xì)胞C4H基因克隆

圖3 菌落PCR篩選陽性克隆

2.3 C4H的生物信息學(xué)分析

用DNAMAN軟件把測序結(jié)果進(jìn)行拼接，其中cDNA序列包含1個1 515 bp的ORF，共編碼504個氨基酸。在GenBank中下載其他植物C4H基因編碼的氨基酸序列與甘草離體細(xì)胞的序列進(jìn)行同源性對比，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

根據(jù)圖4所示分枝的長短，計(jì)算出烏拉爾甘草與其他物種親緣關(guān)系由近及遠(yuǎn)依次為：蒙古黃芪、狹葉羽扇豆、橄欖、麻風(fēng)樹、喜樹、川椒、馬鈴薯、相思木、蔓花生、菜豆、綠豆、玫瑰、大豆、苜蓿及紅車軸草。其中，烏拉爾甘草與豆科植物蒙古黃芪親緣關(guān)系較近，相比之下，與豆科紅車軸草（即三葉草）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

把甘草C4H蛋白進(jìn)行分析（http://web.expasy.org/protparam/），推測C4H蛋白的分子量為 57.8 kD，等電點(diǎn)為9.14。通過PORTER（http://distill.ucd.ie/porter/）進(jìn)行分析，對C4H蛋白中各個氨基酸殘基對應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果表明，該蛋白中α-螺旋為49.71%、β-折疊為17.15%、無規(guī)卷曲為33.14%，所以C4H蛋白二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主。將C4H基因編碼的氨基酸序列提交SWISS-MODEL在線分析軟件，進(jìn)行蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果見圖5。

圖5 C4H蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4 相對熒光定量PCR表達(dá)分析

使用SYBR Green化學(xué)染料，運(yùn)用相對定量的方法進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)采用2（-△△Ct）法進(jìn)行分析，即先根據(jù)“△Ct=Ct目-Ct對”計(jì)算，再根據(jù)“△△Ct=△Ct實(shí)-△Ct對”進(jìn)行計(jì)算，最后依據(jù)“相對表達(dá)=2（-△△Ct）”計(jì)算出相對表達(dá)數(shù)值。再以處理時間為橫坐標(biāo)，相對表達(dá)量為縱坐標(biāo)做圖。

圖6 MeJA誘導(dǎo)后甘草細(xì)胞C4H基因的表達(dá)分析

由圖6可以看出，在1-12 h期間，C4H基因在添加MJ誘導(dǎo)后的相對表達(dá)量都大于對照組，并且在9 h表達(dá)量最高，說明甘草黃酮生物合成的關(guān)鍵基因酶C4H的表達(dá)明顯響應(yīng)信號分子MeJA的誘導(dǎo)。

3 討論

肉桂酸4-羥基化酶（C4H）是植物苯丙烷代謝途徑上的關(guān)鍵酶，能夠催化反式肉桂酸的苯環(huán)C4位羥基化生成 β-香豆酸，經(jīng)4-香豆酰輔酶A連接酶轉(zhuǎn)變?yōu)橄愣辊］o酶A，為木質(zhì)素、類黃酮等下游次級代謝途徑提供前體物質(zhì)［8］。逆境脅迫下，植物可通過調(diào)節(jié)一系列合成相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平從而影響其黃酮類和芳香族類的合成與積累［9］，其 中 就包 括C4H。Cheniany 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，茶樹兒茶素含量與PAL和C4H 基因的表達(dá)水平正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)在模式植物擬南芥ref3突變體中 AtC4H 蛋白的失活會造成植株木質(zhì)素和類黃酮的含量降低［11］；Liang等［12］在黑莓中發(fā)現(xiàn)，黃酮積累量與C4H表達(dá)量在果實(shí)發(fā)育的不同時期表現(xiàn)了同步增加或減少的變化趨勢。黃酮類化合物是中藥甘草的重要有效成分之一［13-14］，解析其生物合成途徑及分子調(diào)控機(jī)理是構(gòu)建高產(chǎn)的基因工程細(xì)胞株的分子基礎(chǔ)。

本研究從甘草懸浮細(xì)胞中克隆到一個 C4H 基因的全長cDNA并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，序列比對分析發(fā)現(xiàn)其包含完整的細(xì)胞色素P450保守結(jié)構(gòu)域，并與多種植物的C4H氨基酸序列具有較高的同源性，說明此C4H屬于C4H基因家族?？寺〕龈什菁?xì)胞C4H 基因的cDNA序列，對其進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析和比較全面的功能預(yù)測，有助于進(jìn)一步研究甘草黃酮合成的分子調(diào)控機(jī)制和作用機(jī)理。另外植物次生代謝產(chǎn)物的合成受環(huán)境因子所誘導(dǎo)，如信號分子ABA、SA、MeJA等。其中，MeJA是植物次生代謝途徑中最主要的次生代謝信號分子，可以顯著誘導(dǎo)次生代謝物的合成，如外源的MeJA對于重要的藥用次生代謝產(chǎn)物如紫杉醇、長春堿、東蓑若堿、尼古丁、青蒿素等均有顯著的誘導(dǎo)合成作用［15-18］。本研究以甘草懸浮細(xì)胞為研究對象，在接種于新鮮培養(yǎng)基48 h后加入信號分子MeJA誘導(dǎo)，用熒光定量PCR技術(shù)檢測誘導(dǎo)不同時間后C4H基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明添加MeJA后明顯提高了C4H基因的表達(dá)，且在誘導(dǎo)后9 h表達(dá)量最高，MeJA誘導(dǎo)后不同時間段的差異性表達(dá)有利于進(jìn)一步了解 C4H在甘草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中調(diào)控黃酮合成作用。

4 結(jié)論

從烏拉爾甘草懸浮細(xì)胞中克隆到C4H基因編碼區(qū)序列，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。另外，采用q-PCR方法對C4H基因受MeJA誘導(dǎo)后的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明C4H基因的表達(dá)受MeJA的誘導(dǎo)。

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Cloning and Expression Analysis of Cinnamate 4-hydroxylase Gene from Glycyrrhiza uralensis Suspension Cultured Cells

ZOU Guang-ping LI Ya-li FENG Meng-wei YANG Xiu XU Zhi-wei
（School of Life Science and Technology，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010）

According to the reported C4H（cinnamate 4-hydroxylase）gene sequence（GenBank accession ID ：D87520.1）from Glycyrrhiza echinata，the coding sequence of C4H gene from Glycyrrhiza uralensis Fisch suspension cultured cells was obtained by RT-PCR cloning technology，and the bioinformatics analysis on it was carried out. In addition，the expression patterns of C4H gene induced by methyl jasmonate（MeJA）were analyzed by q-PCR. The length of the cloned C4H’s open reading frame（ORF）was 1 515 bp，encoding 504 amino acids. The q-PCR experiments showed that C4H gene was induced by MeJA and reached the highest expression level at 12 h after MeJA added into the cell suspension system.

cinnamate 4-hydroxylase；licorice cells；methyl jasmonate；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0466

2017-06-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31460064），內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2017MS（LH）0304），內(nèi)蒙古高等學(xué)校“青年科技英才計(jì)劃”（NJYT-15-A08），內(nèi)蒙古科技大學(xué)科研儀器專項(xiàng)（2015KYYQ03）

鄒廣平，女，碩士研究生，研究方向：藥用植物生物技術(shù)；E-mail：binghuanziyi@163.com

李雅麗，女，博士，研究方向：植物次生代謝調(diào)控；E-mail：btliyali@126.com

（責(zé)任編輯 朱琳峰）