鄒廣平 李雅麗 馮夢(mèng)薇 楊修 許智偉

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，包頭 014010）

甘草懸浮細(xì)胞肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）基因的克隆及表達(dá)分析

鄒廣平 李雅麗 馮夢(mèng)薇 楊修 許智偉

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，包頭 014010）

根據(jù)已報(bào)道的刺甘草C4H基因序列（GenBank ID：D87520.1），采用RT-PCR技術(shù)克隆得到烏拉爾甘草懸浮細(xì)胞的C4H基因編碼區(qū)序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。另外，采用q-PCR方法對(duì)C4H基因受茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）誘導(dǎo)后的表達(dá)模式進(jìn)行分析。所克隆的C4H基因編碼區(qū)開(kāi)放閱讀框（Opening reading frame，ORF）長(zhǎng)為1 515 bp，編碼504 個(gè)氨基酸。q-PCR實(shí)驗(yàn)證明C4H基因受MeJA的誘導(dǎo)，在懸浮體系添加MeJA后12 h達(dá)到最高表達(dá)水平。

肉桂酸-4-羥化酶；甘草細(xì)胞；茉莉酸甲酯；表達(dá)分析

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.），別名國(guó)老、甜草、甜根子，豆科甘草屬多年生草本植物，是一種補(bǔ)益的中草藥，藥理作用顯著，我國(guó)傳統(tǒng)中藥配方制劑的80%都把它作為主要成分。甘草黃酮因其良好的抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗HIV病毒等特性成為甘草中一類(lèi)主要成分。植物體內(nèi)黃酮類(lèi)化合物的生物合成均源于苯丙烷代謝途徑，多種含苯丙烷骨架的次生代謝產(chǎn)物都是由這一途徑直接或者間接生成［1］。肉桂酸 -4-羥化酶（Cinnamate 4-hydroxylase，C4H）是苯丙烷代謝途徑的第2 個(gè)酶，催化反式肉桂酸生成β香豆酸，是黃酮類(lèi)化合物合成的關(guān)鍵酶之一，它是植物P450單加氧酶中首個(gè)被鑒定、被克隆、被確認(rèn)功能的酶，在植物各組織中均具有很高的活性［2-4］。C4H在轉(zhuǎn)錄水平上的豐度和蛋白質(zhì)水平上的活性能有效影響植物中芳香族化合物和黃酮類(lèi)化合物的生物合成［5］。茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）是植物次生代謝途徑中最主要的信號(hào)分子，它常常作為第二信使參與植物次生代謝物尤其是黃酮類(lèi)化合物的合成調(diào)控［6］。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已報(bào)道的刺甘草C4H基因序列設(shè)計(jì)引物，用RTPCR從甘草懸浮細(xì)胞中克隆C4H基因的編碼區(qū)并進(jìn)行序列分析，同時(shí)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了懸浮體系中添加MeJA后各時(shí)間段甘草細(xì)胞中C4H 的表達(dá)水平，為深入研究C4H基因在甘草黃酮類(lèi)化合物生物合成途徑上的分子調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)，對(duì)進(jìn)一步構(gòu)建轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)甘草黃酮的基因工程細(xì)胞株具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的甘草品種為烏拉爾甘草，種子購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市達(dá)拉特旗。愈傷組織由幼嫩的甘草無(wú)菌苗下胚軸和子葉誘導(dǎo)而來(lái)，在固體MS培養(yǎng)基附加0.5 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L NAA與0.5 mg/L 6-BA上 培養(yǎng)和繼代。懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)的建立：取6 g分散性強(qiáng)、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的固體細(xì)胞置于250 mL三角瓶中，120 r/min震蕩培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)基為100 mL液體MS培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，光照強(qiáng)度 36 μmol/m2·s，光照時(shí)間 16 h/d，培養(yǎng)溫度 25℃［7］。

總 RNA 抽提試劑盒、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA限制性?xún)?nèi)切酶、T4-DNA 連接酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒和 pUM-T 載體均購(gòu)自大連寶生物技術(shù)有限公司。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甘草懸浮細(xì)胞總RNA的提取及cDNA的合成 將懸浮培養(yǎng)的甘草細(xì)胞抽濾后迅速轉(zhuǎn)移至研缽中研磨，同時(shí)向研缽不間斷地添加液氮，研磨成細(xì)細(xì)的粉末即可?？俁NA提取步驟嚴(yán)格按照TaKaRa Total RNA 提取試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。以提取的甘草懸浮細(xì)胞總RNA為模板，利用 Prime ScriptTMReverse Transcriptase Kit合成cDNA第一鏈。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中刺甘草C4H基因序列（序列號(hào)：D87520.1），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了3對(duì)引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的。

表1 三對(duì)PCR引物信息

1.2.3 甘草懸浮細(xì)胞C4H基因克隆 用cDNA 作為模版，對(duì)C4H基因的3對(duì)不同的引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定甘草C4H基因的最適引物。對(duì)PCR產(chǎn)物中1 800 bp左右處的條帶進(jìn)行膠回收。通過(guò)膠回收（OMEGA Gel Extraction Kit試劑盒）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物與寶生物購(gòu)買(mǎi)的克隆載體（pMD18-T載體）連接，重組質(zhì)粒pMD18-T-C4H轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒DNA檢測(cè)與雙酶切驗(yàn)證。把提取的質(zhì)粒和保存的菌液寄到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.4 序列分析 用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接并對(duì)其完整開(kāi)放閱讀框進(jìn)行氨基酸翻譯，得到氨基酸序列，與GenBank中其他植物的C4H蛋白進(jìn)行Blast同源性對(duì)比，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。對(duì)甘草C4H蛋白進(jìn)行分析（http://web.expasy.org/protparam/），推測(cè)C4H蛋白的分子量。利用 ProtScale工 具（http://web.expasy.org/protscale/）對(duì)甘草C4H蛋白進(jìn)行親水/疏水性分析。通過(guò)PORTER（http://distill.ucd.ie/porter/）進(jìn)行分析，C4H蛋白中各個(gè)氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。將C4H基因編碼的氨基酸序列提交 SWISS-MODEL在線分析軟件，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 甘草細(xì)胞C4H基因在不同MeJA誘導(dǎo)處理時(shí)間的表達(dá)分析 以甘草懸浮細(xì)胞系為研究對(duì)象，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的種子細(xì)胞接種于新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，添加100 μmol/mL的MeJA進(jìn)行誘導(dǎo)，以加入無(wú)水乙醇（配置MeJA的溶劑）為對(duì)照組，分別在添加后1、3、6、9和12 h取樣，提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，對(duì)C4H基因進(jìn)行熒光定量PCR，以Actin作為內(nèi)參基因，參照2×SYBR Prime Script TM RT-PCR Kit（TaKara）熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量試驗(yàn)。采用2（-△△Ct）法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 甘草細(xì)胞總RNA的提取

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得RNA 的OD260/280在1.8-2.2之間，濃度在1 000 ng/μL 左右。電泳結(jié)果（圖1）顯示，28S及18S rRNA兩條主帶清晰可見(jiàn)，且不含有 DNA 及蛋白質(zhì)雜帶。RNA質(zhì)量良好，可用于反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA。

圖1 甘草細(xì)胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 甘草懸浮細(xì)胞C4H基因克隆

對(duì)3對(duì)不同的引物分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到第二對(duì)引物為甘草C4H基因的最適引物，進(jìn)行50 μL體外擴(kuò)增（圖2）。對(duì)PCR產(chǎn)物中1 800 bp左右處的條帶進(jìn)行膠回收，將回收的片段與pMD18-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，37℃過(guò)夜倒置培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。挑取單菌落6 個(gè)，按體系進(jìn)行菌落PCR檢驗(yàn)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。圖3中可見(jiàn)3號(hào)菌落中目的基因已被插入，挑取該菌落培養(yǎng)。

圖2 甘草細(xì)胞C4H基因克隆

圖3 菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆

2.3 C4H的生物信息學(xué)分析

用DNAMAN軟件把測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，其中cDNA序列包含1個(gè)1 515 bp的ORF，共編碼504個(gè)氨基酸。在GenBank中下載其他植物C4H基因編碼的氨基酸序列與甘草離體細(xì)胞的序列進(jìn)行同源性對(duì)比，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

根據(jù)圖4所示分枝的長(zhǎng)短，計(jì)算出烏拉爾甘草與其他物種親緣關(guān)系由近及遠(yuǎn)依次為：蒙古黃芪、狹葉羽扇豆、橄欖、麻風(fēng)樹(shù)、喜樹(shù)、川椒、馬鈴薯、相思木、蔓花生、菜豆、綠豆、玫瑰、大豆、苜蓿及紅車(chē)軸草。其中，烏拉爾甘草與豆科植物蒙古黃芪親緣關(guān)系較近，相比之下，與豆科紅車(chē)軸草（即三葉草）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

把甘草C4H蛋白進(jìn)行分析（http://web.expasy.org/protparam/），推測(cè)C4H蛋白的分子量為 57.8 kD，等電點(diǎn)為9.14。通過(guò)PORTER（http://distill.ucd.ie/porter/）進(jìn)行分析，對(duì)C4H蛋白中各個(gè)氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，該蛋白中α-螺旋為49.71%、β-折疊為17.15%、無(wú)規(guī)卷曲為33.14%，所以C4H蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲為主。將C4H基因編碼的氨基酸序列提交SWISS-MODEL在線分析軟件，進(jìn)行蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 C4H蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 相對(duì)熒光定量PCR表達(dá)分析

使用SYBR Green化學(xué)染料，運(yùn)用相對(duì)定量的方法進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)采用2（-△△Ct）法進(jìn)行分析，即先根據(jù)“△Ct=Ct目-Ct對(duì)”計(jì)算，再根據(jù)“△△Ct=△Ct實(shí)-△Ct對(duì)”進(jìn)行計(jì)算，最后依據(jù)“相對(duì)表達(dá)=2（-△△Ct）”計(jì)算出相對(duì)表達(dá)數(shù)值。再以處理時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)表達(dá)量為縱坐標(biāo)做圖。

圖6 MeJA誘導(dǎo)后甘草細(xì)胞C4H基因的表達(dá)分析

由圖6可以看出，在1-12 h期間，C4H基因在添加MJ誘導(dǎo)后的相對(duì)表達(dá)量都大于對(duì)照組，并且在9 h表達(dá)量最高，說(shuō)明甘草黃酮生物合成的關(guān)鍵基因酶C4H的表達(dá)明顯響應(yīng)信號(hào)分子MeJA的誘導(dǎo)。

3 討論

肉桂酸4-羥基化酶（C4H）是植物苯丙烷代謝途徑上的關(guān)鍵酶，能夠催化反式肉桂酸的苯環(huán)C4位羥基化生成 β-香豆酸，經(jīng)4-香豆酰輔酶A連接酶轉(zhuǎn)變?yōu)橄愣辊］o酶A，為木質(zhì)素、類(lèi)黃酮等下游次級(jí)代謝途徑提供前體物質(zhì)［8］。逆境脅迫下，植物可通過(guò)調(diào)節(jié)一系列合成相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平從而影響其黃酮類(lèi)和芳香族類(lèi)的合成與積累［9］，其 中 就包 括C4H。Cheniany 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)兒茶素含量與PAL和C4H 基因的表達(dá)水平正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)在模式植物擬南芥ref3突變體中 AtC4H 蛋白的失活會(huì)造成植株木質(zhì)素和類(lèi)黃酮的含量降低［11］；Liang等［12］在黑莓中發(fā)現(xiàn)，黃酮積累量與C4H表達(dá)量在果實(shí)發(fā)育的不同時(shí)期表現(xiàn)了同步增加或減少的變化趨勢(shì)。黃酮類(lèi)化合物是中藥甘草的重要有效成分之一［13-14］，解析其生物合成途徑及分子調(diào)控機(jī)理是構(gòu)建高產(chǎn)的基因工程細(xì)胞株的分子基礎(chǔ)。

本研究從甘草懸浮細(xì)胞中克隆到一個(gè) C4H 基因的全長(zhǎng)cDNA并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其包含完整的細(xì)胞色素P450保守結(jié)構(gòu)域，并與多種植物的C4H氨基酸序列具有較高的同源性，說(shuō)明此C4H屬于C4H基因家族。克隆出甘草細(xì)胞C4H 基因的cDNA序列，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析和比較全面的功能預(yù)測(cè)，有助于進(jìn)一步研究甘草黃酮合成的分子調(diào)控機(jī)制和作用機(jī)理。另外植物次生代謝產(chǎn)物的合成受環(huán)境因子所誘導(dǎo)，如信號(hào)分子ABA、SA、MeJA等。其中，MeJA是植物次生代謝途徑中最主要的次生代謝信號(hào)分子，可以顯著誘導(dǎo)次生代謝物的合成，如外源的MeJA對(duì)于重要的藥用次生代謝產(chǎn)物如紫杉醇、長(zhǎng)春堿、東蓑若堿、尼古丁、青蒿素等均有顯著的誘導(dǎo)合成作用［15-18］。本研究以甘草懸浮細(xì)胞為研究對(duì)象，在接種于新鮮培養(yǎng)基48 h后加入信號(hào)分子MeJA誘導(dǎo)，用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)不同時(shí)間后C4H基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明添加MeJA后明顯提高了C4H基因的表達(dá)，且在誘導(dǎo)后9 h表達(dá)量最高，MeJA誘導(dǎo)后不同時(shí)間段的差異性表達(dá)有利于進(jìn)一步了解 C4H在甘草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過(guò)程中調(diào)控黃酮合成作用。

4 結(jié)論

從烏拉爾甘草懸浮細(xì)胞中克隆到C4H基因編碼區(qū)序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。另外，采用q-PCR方法對(duì)C4H基因受MeJA誘導(dǎo)后的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明C4H基因的表達(dá)受MeJA的誘導(dǎo)。

［1］Li XH, Park NI, Xu H, et al. Differential expression of flavonoid biosynthesis genes and accumulation of phenolic compounds in common buckwheat（Fagopyrum esculentum）［J］. J Agric Food Chem, 2010, 58（23）：12176-12181.

［2］Fahrendorf T, Dixon RA. Stress responses in alfalfa（Medicago sativa L.）XVIII：Molecular cloning and expression of the elicitorinducible cinnamic acid 4-hydroxylase cytochrome 450［J］. Arch Biochem Biophys, 1993, 305（2）：509-515.

［3］Li W, Yang LX, Jiang LZ, et al. Molecular cloning and functional characterization of a cinnamate 4-hydroxylase-encoding genefrom Camptotheca acuminata［J］. ACTA Physiologiae Plantarum, 2016,38（11）：255-263.

［4］Liu XY, Yu HN, Gao S, et al. The isolation and functional characterization of three liverwort genes encoding cinnamate 4-hydroxylase［J］. Plant Physiol Biochem, 117 ：42-50.

［5］李莉, 趙越, 馬君蘭. 苯丙氨酸代謝途徑關(guān)鍵酶：PAL、C4H、4CL 研究新進(jìn)展［J］. 生物信息學(xué), 2007, 5（4）：187-189.

［6］張梅, 林棋. 茉莉酸甲酯對(duì)錦繡杜鵑黃酮的累積及相關(guān)酶活性的影響［J］. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 50（4）：65-169.

［7］李雅麗, 孟婷婷, 王毛毛, 等. 甘草細(xì)胞在攪拌式生物反應(yīng)器中的放大培養(yǎng)［J］. 植物生理學(xué)報(bào), 2015, 51（3）：302-306.

［8］張東雪, 王艷, 井妍, 等. 大豆GmC4H基因的克隆及同源基因的生物信息學(xué)分析［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2016, 35（10）：2768-2774.

［9］陳鴻翰, 袁夢(mèng)求, 李雙江, 等. 苦蕎肉桂酸羥化酶基因（FtC4H）的克隆及其 UV-B脅迫下的組織表達(dá)［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2013, 21（2）：137-147.

［10］Cheniany M, Ganjeali Ali. Developmental role of phenylalanineammonia-lyase（PAL）and cinnamate 4-hydroxylase（C4H）genes during adventitious rooting of Juglans regia L.Microshoots［J］. Acta Biol Hung, 2016, 67（4）：379-392.

［11］Sykes RW, Gjersing EL, Foutz K, et al. Down-regulation of p-coumaroyl quinate/shikimate 3'-hydroxylase（C3'H）and cinnamate 4-hydroxylase（C4H）genes in the lignin biosynthetic pathway of Eucalyptus urophylla × E. grandis leads to improved sugar release［J］. Biotechnology for Biofuels, 2015, 8：128-138.

［12］Liang L, Han X, Zhang Z, et al. Cloning and expression analysis of cinnamate 4-hydroxylase（C4H）reductase gene from Aquilaria sinensis［J］. China Journal of Chinese Materia Medica, 2014, 39（10）：1767-1771.

［13］ Li YL, Meng TT, Zhang XL. Study on enzymatic browning in suspension cultures of licorice cells［J］. Biotechnol. &Biotechnol, Equipment, 2016, 30（2）：277-283.

［14］Li YL, Yang Y, et al. Production of Glycyrrhizin in cell suspension of Glycyrrhiza inflata Batalin cultured in bioreactor［J］.Biotechnol. & Biotechnol. eq, 2012, 26（5）：3231-3235.

［15］馮盼盼, 陳鵬, 洪文杰, 等. 擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子家族研究進(jìn)展［J］. 生命科學(xué)研究, 2016, 20（6）：555-560.

［16］楊艷. 茉莉酸甲酯處理雷公藤懸浮細(xì)胞的基因差異表達(dá)分析［D］. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué), 2011.

［17］劉雅靜. 蒙古黃芪懸浮細(xì)胞系的建立及茉莉酸甲酯對(duì)其黃酮含量的調(diào)控［D］. 呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué), 2011.

［18］蔡靜, 馬赟, 陳建偉, 等. 茉莉酸甲酯對(duì)明黨參植株和懸浮細(xì)胞中呋喃香豆素積累的影響［J］. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2017, 42（1）：76-82.

Cloning and Expression Analysis of Cinnamate 4-hydroxylase Gene from Glycyrrhiza uralensis Suspension Cultured Cells

ZOU Guang-ping LI Ya-li FENG Meng-wei YANG Xiu XU Zhi-wei
（School of Life Science and Technology，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010）

According to the reported C4H（cinnamate 4-hydroxylase）gene sequence（GenBank accession ID ：D87520.1）from Glycyrrhiza echinata，the coding sequence of C4H gene from Glycyrrhiza uralensis Fisch suspension cultured cells was obtained by RT-PCR cloning technology，and the bioinformatics analysis on it was carried out. In addition，the expression patterns of C4H gene induced by methyl jasmonate（MeJA）were analyzed by q-PCR. The length of the cloned C4H’s open reading frame（ORF）was 1 515 bp，encoding 504 amino acids. The q-PCR experiments showed that C4H gene was induced by MeJA and reached the highest expression level at 12 h after MeJA added into the cell suspension system.

cinnamate 4-hydroxylase；licorice cells；methyl jasmonate；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0466

2017-06-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31460064），內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2017MS（LH）0304），內(nèi)蒙古高等學(xué)?！扒嗄昕萍加⒉庞?jì)劃”（NJYT-15-A08），內(nèi)蒙古科技大學(xué)科研儀器專(zhuān)項(xiàng)（2015KYYQ03）

鄒廣平，女，碩士研究生，研究方向：藥用植物生物技術(shù)；E-mail：binghuanziyi@163.com

李雅麗，女，博士，研究方向：植物次生代謝調(diào)控；E-mail：btliyali@126.com

（責(zé)任編輯 朱琳峰）