彭智超 仝贊華 邱德文

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100081）

蛋白激發(fā)子PeaT1與井岡霉素混合使用誘導(dǎo)煙草對(duì)TMV抗性的研究

彭智超 仝贊華 邱德文

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100081）

煙草病毒可侵染危害煙草、番茄、辣椒和土豆等多種作物導(dǎo)致病毒病發(fā)生，是生產(chǎn)上難以防治的病害。為了探索蛋白激發(fā)子PeaT1與井岡霉素混合使用對(duì)煙草病毒病防治的最佳混配比例，本研究選用3-7片真葉的本生煙（Nicotiana benthamiana cv. Huangmiaoyu），分別噴施清水、井岡霉素、蛋白激發(fā)子PeaT1及蛋白激發(fā)子PeaT1-井岡霉素復(fù)合制劑，采用摩擦接種的方式接種TMV-GFP病毒，在紫外光下觀察病毒的侵染情況。結(jié)果表明，噴施了井岡霉素和蛋白激發(fā)子復(fù)合制劑的本生煙對(duì)TMV的抗性較單劑具有增效作用，其中蛋白激發(fā)子PeaT1-井岡霉素按3：4混配的性?xún)r(jià)比最高，共毒系數(shù)達(dá)到157.64，相對(duì)防效為73.39%。這說(shuō)明井岡霉素和蛋白激發(fā)子PeaT1都能使煙草產(chǎn)生對(duì)TMV的系統(tǒng)獲得抗性，而其復(fù)合制劑更有著疊加效應(yīng)。

蛋白激發(fā)子；井岡霉素；誘導(dǎo)抗性；TMV-GFP

煙草病毒能侵染危害煙草、番茄、辣椒和土豆等多種作物。20世紀(jì)50年代以來(lái)，病毒病先后在世界各國(guó)農(nóng)作物上發(fā)生，煙草花葉病毒病（Tobacco mosaic virus，TMV）具有種類(lèi)多、分布廣的特點(diǎn)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大損失，成為主要病害之一［1］。PeaT1是從極細(xì)鏈格孢菌中分離的一種能誘導(dǎo)植物廣譜抗性的蛋白激發(fā)子［2］，能誘導(dǎo)植物提高自身的免疫抗性，對(duì)多種植物病毒病有較好的控制作用［3］。因此，利用蛋白激發(fā)子作為植物免疫誘導(dǎo)劑，通過(guò)激發(fā)植物自身的免疫防御系統(tǒng)以控制農(nóng)作物病毒病，具有安全、高效和防效持久的優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上控制植物病毒病的有效措施之一。井岡霉素是由吸水鏈霉菌井崗變種產(chǎn)生的抗生素，對(duì)控制水稻紋枯病有特效，已推廣使用多年，表現(xiàn)出良好的抗病增產(chǎn)效果，但其對(duì)防治病毒病是否有效還未見(jiàn)報(bào)道。張穗等［4］曾報(bào)道，井岡霉素能夠誘導(dǎo)水稻抗病性。為了明確井岡霉素對(duì)病毒病的作用效果，以及其與蛋白激發(fā)子PeaT1聯(lián)合使用對(duì)水稻病毒病等的防治效果，本研究以模式植物煙草為例，驗(yàn)證井岡霉素以及蛋白激發(fā)子PeaT1-井岡霉素復(fù)合劑對(duì)煙草花葉病毒?。═MV）的防控效果，以期為新型復(fù)合生物藥劑同時(shí)防治多種農(nóng)作物病害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 本生煙（Nicotiana benthamiana cv. Huangmiaoyu）播種于防蟲(chóng)溫室的苗盤(pán)中，溫度25-30℃，光照14 h 條件下土培（滅菌土∶草炭土∶蛭石= 1∶1∶1）生長(zhǎng)，待長(zhǎng)至3-4 葉齡時(shí)移栽到直徑為13 cm 的花盆中，每盆1-2株。4-5葉期時(shí)用于配方篩選試驗(yàn)，5-7葉期用于抗藥性試驗(yàn)。

1.1.2 TMV-GFP［5］TMV-GFP 病毒是將綠色熒光蛋白（GFP）插入TMV病毒的外殼蛋白（CP）與開(kāi)放閱讀框（ORF）之間所構(gòu)成的重組病毒，重組病毒的侵染和移動(dòng)不受影響［6］。TMV-GFP病毒在UV燈的照射下會(huì)發(fā)出綠色熒光以便觀察［7］，在可見(jiàn)光的照射下沒(méi)有明顯枯斑反應(yīng)。攜帶TMV-GFP的農(nóng)桿菌由清華大學(xué)劉玉樂(lè)教授饋贈(zèng)。

1.1.3 供試藥劑 井岡霉素（60%，浙江龍游東方農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)）、蛋白激發(fā)子PeaT1可濕性粉劑（3%，河南普綠通生物科技有限公司生產(chǎn)）、蛋白激發(fā)子PeaT1-井岡霉素復(fù)合制劑（自行配制）。

1.2 方法

1.2.1 TMV-GFP的制備與接種 在LB培養(yǎng)基（含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平）中發(fā)酵培養(yǎng)攜帶TMV-GFP的農(nóng)桿菌GV3101，28℃、200 r/min、36 h；將發(fā)酵液離心，加少量ddH2O重懸，獲得TMV-GFP懸浮液。將少量的金剛砂撒在待接種葉片上，取10 μL TMV-GFP懸液點(diǎn)滴在葉片上［8］，用棉棒在葉片上輕輕摩擦接種。接種后的葉片用水輕輕沖洗，置于25℃黑暗培養(yǎng)12 h后放回溫室培養(yǎng)。3-5 d后觀察葉片在UV燈照射下可見(jiàn)大面積熒光時(shí)，將葉片在液氮中研磨成粉。按1∶3體積比加ddH2O，4℃、8 000 r/min離心10 min，上清液冰浴備用。為保證病毒活性，農(nóng)桿菌侵染的葉片暫時(shí)不用的情況下應(yīng)于-80℃冰箱保存，病毒上清液應(yīng)在使用前配制。

1.2.2 復(fù)合制劑配方的篩選 將蛋白激發(fā)子PeaT1和井岡霉素按質(zhì)量比為（3∶1、3∶2、3∶3、3∶4、3∶5）稱(chēng)取后均勻混合，備用。參照殺菌劑農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則（農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) NY/T1156.14-2008）和創(chuàng)制生物農(nóng)藥活性評(píng)價(jià)SOP（殺菌劑卷），采用噴霧法處理煙草。試驗(yàn)煙草幼苗分別用不同的混配藥劑，采用1 000 mL手動(dòng)噴霧器對(duì)煙草全株進(jìn)行均勻噴霧處理，以清水為對(duì)照，與蛋白激發(fā)子PeaT1或井岡霉素的單劑處理分別進(jìn)行對(duì)比。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，在施藥后5 d接種煙草花葉病毒、接種后10 d調(diào)查不同處理對(duì)煙草花葉病毒的防治效果。使用孫文沛的共毒系數(shù)法［9］計(jì)算共毒系數(shù)：

理論混用毒力指數(shù)（TTI）=A的毒力指數(shù)A在混用中的含量（%）+B的毒力指數(shù)B在混用中的含量（%）

共毒系數(shù)大于120為增效作用；若小于80為拮抗作用；若大于80小于120，表明為相加作用。

1.2.3 復(fù)合制劑誘導(dǎo)煙草系統(tǒng)抗性試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：清水CK、井岡霉素、蛋白激發(fā)子PeaT1、蛋白激發(fā)子PeaT1-井岡霉素復(fù)合制劑（3∶4配方）。將5-7片葉的煙草苗用紙袋套住上三片葉，用各處理的1 000倍稀釋液噴施植株。48 h后在套袋葉片上摩擦接種TMV-GFP病毒。在接種TMV-GFP病毒后，從72 h開(kāi)始每隔24 h調(diào)查一次，每次每處理調(diào)查15片葉，連續(xù)調(diào)查4次。將調(diào)查得到的病斑數(shù)據(jù)用 SPSS Statistics 19進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD、Duncan多重比較，計(jì)算相對(duì)防效。

2 結(jié)果

2.1 蛋白激發(fā)子PeaT1-井岡霉素復(fù)合制劑配方篩選

單劑生物活性測(cè)定結(jié)果表明，蛋白激發(fā)子PeaT1對(duì)煙草花葉病毒病的防效達(dá)到47.0%-57.0%，井岡霉素單劑對(duì)煙草花葉病毒病的防效達(dá)到27.0%-32.0%。蛋白激發(fā)子PeaT1·井岡霉素5個(gè)配比的生物活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

毒力指數(shù)和共毒系數(shù)分析結(jié)果（表2）表明，蛋白激發(fā)子PeaT1和井岡霉素質(zhì)量比為（3∶1、3∶2、3∶3、3∶4、3∶5）時(shí)均表現(xiàn)為控制煙草花葉病毒病具有增效作用，其中蛋白激發(fā)子PeaT1和井岡霉素質(zhì)量比為3∶4時(shí)增效作用的性?xún)r(jià)比為最好。

2.2 不同藥劑誘導(dǎo)本生煙的局部抗性比較

從表3中可以看出，在接病毒后72 h、96 h、120 h的計(jì)數(shù)結(jié)果，蛋白激發(fā)子PeaT1-井岡霉素、井岡霉素、蛋白激發(fā)子PeaT1與清水對(duì)照差異性極顯著，井岡霉素和蛋白激發(fā)子PeaT1單劑間沒(méi)有顯著性差異；在144 h時(shí)4者之間差異性極顯著（圖1）。蛋白激發(fā)子PeaT1-井岡霉素復(fù)合制劑（3∶4）相對(duì)防效最佳，達(dá)到了73.39%。

表1 蛋白激發(fā)子PeaT1與井岡霉素不同質(zhì)量配比制劑對(duì)煙草花葉病毒病作用的測(cè)定

表2 蛋白激發(fā)子PeaT1與井岡霉素不同質(zhì)量配比制劑對(duì)煙草花葉病毒病的毒力指數(shù)和共毒系數(shù)分析

表3 不同藥劑誘導(dǎo)本生煙幼苗抗TMV病毒的效果測(cè)定

3 討論

圖1 各處理對(duì)本生煙抗TMV-GFP病毒能力

煙草病毒病是嚴(yán)重影響我國(guó)農(nóng)作物生產(chǎn)的主要病毒病害之一，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。目前生產(chǎn)上防治煙草病毒病主要通過(guò)土壤消毒、隔離毒源等方法進(jìn)行控制，沒(méi)有直接作用于作物本身的有效藥物。趙秀云［10］等研究發(fā)現(xiàn)一種青霉蛋白激發(fā)子EPTP可以誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性，能夠引起煙草葉片抗性基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，并誘導(dǎo)水楊酸茉莉酸途徑相關(guān)抗性基因的表達(dá)。廖建松等［11］研究表明蛋白激發(fā)子PeaT1與氨基寡糖素的復(fù)合制劑對(duì)煙草花葉病防效達(dá)到了88.73%。李宏光等［12］研究表明7%井岡霉素·極細(xì)鏈格孢蛋白激發(fā)子PeaT1可濕性粉劑對(duì)煙草病毒病的防治效果在60%以上。蛋白激發(fā)子PeaT1主要是通過(guò)提高植物自身的免疫系統(tǒng)從而增強(qiáng)煙草對(duì)于煙草花葉病毒病的抗性［13］。井岡霉素是一類(lèi)開(kāi)發(fā)較早的抗生素，它能夠進(jìn)入煙草植株體內(nèi)對(duì)感染植物的菌類(lèi)進(jìn)行抑制而達(dá)到殺菌效果［14］。井岡霉素作為抗生素類(lèi)內(nèi)吸性殺菌劑，在抗病毒病上一直鮮有報(bào)道，而蛋白激發(fā)子PeaT1在誘導(dǎo)植物自身抗病能力上一直是本實(shí)驗(yàn)室研究的方向。蛋白激發(fā)子PeaT1誘導(dǎo)煙草對(duì)病毒病的抗性，井岡霉素也可進(jìn)入煙草體內(nèi)殺菌，本研究基于二者對(duì)煙草病害的防治機(jī)理不同，通過(guò)將二者結(jié)合，篩選出了蛋白激發(fā)子PeaT1與井岡霉素3∶4的最佳復(fù)配比例。

本研究將蛋白激發(fā)子PeaT1與井岡霉素科學(xué)配伍，充分利用兩種成分的相互增效作用，提高作物對(duì)煙草病毒病的抗性，減輕煙草病毒病的發(fā)生程度，有效地控制病毒病的發(fā)生，為蛋白激發(fā)子PeaT1的應(yīng)用提供了一個(gè)新的復(fù)配方案。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)篩選蛋白激發(fā)子PeaT1與井岡霉素不同配比的復(fù)配制劑，發(fā)現(xiàn)在蛋白激發(fā)子PeaT1與井岡霉素的比例為3∶4時(shí)增效性?xún)r(jià)比最高，共毒系數(shù)達(dá)到157.64。將此復(fù)配制劑噴施于煙草葉片上，與蛋白激發(fā)子PeaT1、井岡霉素和清水進(jìn)行比較，結(jié)果表明復(fù)配制劑與其他處理相比差異極顯著，相對(duì)防效在72 h達(dá)到73.39%。

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Research On the Induced Resistance of Protein Elicitor PeaT1 with Jinggangmycin in Tobacco Against TMV

PENG Zhi-chao TONG Zan-hua QIU De-wen
（Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Tobacco virus infects tobacco，tomatoes，peppers，potatoes，and other crops，causing a variety of crop diseases that are difficult to control during production. To explore the optimal mixed proportion of protein elicitor PeaT1 and Jinggangmycin to defense tobacco virus disease，this study chosen Nicotiana benthamiana cv. Huangmiaoyu having 3 to 7 leaves，respectively by spraying water，Jinggangmycin，and combination of PeaT1 and PeaT1-Jinggangmycin. Virus TMV-GFP was inoculated by the way of friction，and viral infection situation was observed under UV light. The results showed that the combination of Jinggangmycin mixed with PeaT1 had better synergism than using single one；PeaT1：Jinggangmycin at 3：4 mixed ratio had the most cost-efficient，and cotoxicity coefficient reached 157.64，the relative control effect reached 73.39%. Therefore，we thought that Jinggangmycin and PeaT1 both generated tobacco resistance against TMV，and their combination had synergetic effect.

protein elicitor；Jinggangmycin；induced resistance；TMV-GFP

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0454

2017-06-02

北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目（D151100003915003）

彭智超，男，碩士研究生，研究方向：誘導(dǎo)植物抗性的新型蛋白生物農(nóng)藥；E-mail：14105789@qq.com

邱德文，男，博士，研究員，研究方向：蛋白質(zhì)生物農(nóng)藥；E-mail：qiudewen@caas.cn

（責(zé)任編輯 朱琳峰）