陳小鳳 曾奇峰 鄧旭 曾光堯 周應(yīng)軍

（中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013）

一種大量提取紅豆杉中總RNA的方法研究

陳小鳳 曾奇峰 鄧旭 曾光堯 周應(yīng)軍

（中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013）

旨在確定高質(zhì)量紅豆杉中總RNA的提取和純化工藝條件。以湖南長(zhǎng)沙紅豆杉葉為材料，以Trizol和CATB兩種植物RNA通用提取方法為基礎(chǔ)，以RNA的濃度、OD260/OD280及OD260/OD230的比值為標(biāo)準(zhǔn)，考察提取方法、提取試劑、提取時(shí)間等因素對(duì)RNA提取率的影響，優(yōu)化了紅豆杉葉中總RNA的提取方法；通過(guò)對(duì)比PVP法、β-巰基乙醇法、高鹽沉淀法、低濃度乙醇沉淀法、凝膠柱層析法五種不同純化方法來(lái)探討對(duì)紅豆杉RNA的影響?？紤]到成本的問(wèn)題，選擇使用Trizol法提取紅豆杉總RNA，確定了較優(yōu)的提取條件：紅豆杉葉與Trizol提取液的作用體積確定為3∶40；裂解時(shí)間確定為5 min；氯仿與水液的作用體積確定為1∶5。實(shí)驗(yàn)表明凝膠柱層析法能顯著的提高紅豆杉總RNA的純度并能得到富含miRNA的小分子RNA。最終可得到濃度約為1 000 μg/mL，OD260/OD280在2.00-2.20之間及OD260/OD230大于1.7的高質(zhì)量RNA樣品。與現(xiàn)有的提取方法相比，本方法提取的紅豆杉總RNA具有很高的質(zhì)量和純度，且大大降低了提取成本，并首次實(shí)現(xiàn)了植物總RNA的大量提取。

紅豆杉；總RNA提取；Trizol法；CATB法；凝膠柱層析法

紅豆杉（Taxus chinensis R.）別名紫杉，系紅豆杉科紅豆杉屬常綠喬木，根據(jù)其生長(zhǎng)地域性和生物學(xué)特征型，在全世界可分為至少14個(gè)品種［1-2］。對(duì)紅豆杉的研究熱點(diǎn)起源于1971年美國(guó)化學(xué)家Wani等［3］從短枝紅豆杉的樹(shù)皮中分離出具有強(qiáng)抗癌活性的紫杉烷二萜類化合物紫杉醇。隨后，1979年Horwitz和Schiff等［4］發(fā)現(xiàn)紫杉醇具有強(qiáng)效的抗腫瘤作用，其作用機(jī)制獨(dú)特，是通過(guò)與微管蛋白質(zhì)結(jié)合，使細(xì)胞有絲分裂受阻，從而對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。1992年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)紫杉醇上市。目前，紫杉醇是治療乳腺癌和轉(zhuǎn)移性卵巢癌的最好藥物之一，同時(shí)紫杉醇對(duì)肺癌、食道癌也有顯著療效，對(duì)腎炎及細(xì)小病毒炎癥也有顯著的治療效果［5］。除紫杉醇外，紅豆杉中還有很多其他的生物活性成分［6］。由此可見(jiàn)，紅豆杉作為世界上瀕臨滅絕的天然珍稀植物，不但有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，更具有重要的的藥用價(jià)值。如今紅豆杉主要應(yīng)用于紫杉醇提取，但由于紅豆杉樹(shù)中紫杉醇的低含量，導(dǎo)致紅豆杉在被大量需求的同時(shí)也造成大量浪費(fèi)，影響紅豆杉的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)等分子生物學(xué)手段的迅速發(fā)展，包括miRNA在內(nèi)的紅豆杉轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究也取得了一定的成就［7-11］。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼的小分子單鏈RNA，長(zhǎng)度在19-24個(gè)核苷酸（nt）之間，在動(dòng)植物發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著復(fù)雜且重要的作用。紅豆杉中存在著大量的miRNA，并對(duì)紅豆杉植株本身生長(zhǎng)發(fā)育以及紫杉醇生物合成具有重要作用［12］，但由于紅豆杉基因組信息的缺乏，阻礙了紅豆杉miRNA的研究，而獲取高質(zhì)量總RNA是進(jìn)行miRNA研究的重要前提。

植物組織中RNA提取比較困難，由于植物中多酚、多糖等對(duì)RNA提取的干擾和RNA酶對(duì)RNA的降解，導(dǎo)致難以有效地分離純化植物組織中的RNA。到目前為止，提取植物總RNA的方法已有不少［13，14］，其中最常見(jiàn)的是 Trizol法、CATB 法及試劑盒。Trizol法快速、高效，用時(shí)較短，但得到的RNA往往雜質(zhì)較多，需要進(jìn)一步純化。CATB法獲得的RNA純度高、完整性較好，但操作較復(fù)雜、提取時(shí)間較長(zhǎng)，缺乏有效的RNA酶抑制劑，容易被RNA酶降解。使用試劑盒提取植物總RNA速度快、用時(shí)短，并含有有效的抑制RNase的活性成分，但一般價(jià)格昂貴，一次提取量很少。此外，現(xiàn)有的提取方法均不能實(shí)現(xiàn)植物RNA的大量提取，無(wú)法滿足后續(xù)試驗(yàn)需要。因此在現(xiàn)有的方法上進(jìn)行改良，進(jìn)而得到大量高質(zhì)量的RNA是非常有必要的?？紤]成本問(wèn)題，本研究在已有的植物總RNA提取方法Trizol法和CATB法［15］的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，初步實(shí)現(xiàn)了高質(zhì)量RNA的大量制備，通過(guò)凝膠柱層析法顯著提高紅豆杉總RNA的純度并能得到了富含miRNA的小分子RNA。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 紅豆杉葉，采自湖南長(zhǎng)沙麓溪峪休閑度假山莊，取新鮮葉液氮保存；擬南芥miR156對(duì)照品，購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司，純度為98%；尿嘧啶核苷酸對(duì)照品，購(gòu)自上?？笊锛夹g(shù)有限公司，純度 ≥ 98%；RNase A，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；其他的試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 恒溫加熱水浴鍋，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；電子天平，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；閃式提取器，河南智晶生物科技股份有限公司；低溫高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；高效液相色譜儀，LC-2010A，Shimadzu corporation Kyoto Japan；BioSpec-nano 紫外分光光度計(jì)，Shimadzu corporation Kyoto Japan；數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Pre-HPLC 北京創(chuàng)新通恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CATB法

1.2.1.1 焦碳酸二乙酯（Diethy pyrocarbonate，DEPC）水溶液的配制 焦碳酸二乙酯2mL，加入1 000 mL蒸餾水，室溫?cái)嚢? h后靜置12 h以上，使用前121℃高壓滅菌30 min。

1.2.1.2 CTAB提取液的配制 CTAB 10 g，PVP 10 g，NaCl 93.6 g，EDTA 7.306 g，加入已滅菌的DEPC水溶液400 mL，置于65℃水浴鍋水浴1 h，趁熱使用。

1.2.1.3 總RNA提取 （1）稱取新鮮紅豆杉葉片100 g，加入400 mL CTAB提取液，β-巰基乙醇10 mL，閃式提取器高速渦旋15 min后，置于65℃水浴鍋水浴30 min。（2）渦旋液轉(zhuǎn)入500 mL離心瓶中，3 500 r/min離心10 min。（3）上清液中加入等體積氯仿：異戊醇（24∶1，V/V），在4℃，10 000 r/min離心10 min。（4）將上清移至新離心管中，加入1/4體積10 mol/L LiCl，混勻，4℃沉淀過(guò)夜。（5）4℃，10 000 r/min離心10 min，沉淀用75%乙醇洗滌兩次，4℃，10 000 r/min離心5 min，獲取沉淀，-20℃保存?zhèn)溆?。?）沉淀用N2吹干至無(wú)乙醇味，加入2 mL已滅菌的DEPC水溶液至沉淀恰好溶解。取少量樣品進(jìn)行HPLC分析和紫外分光光度測(cè)定。

1.2.2 Trizol法

1.2.2.1 Trizol提取液的配制 異硫氰酸胍125 g，8-羥基喹啉0.1 g，加入滅菌后DEPC水溶液149 mL，0.75 mol/L檸檬酸鈉溶液8.8 mL，10%十二烷基肌氨酸鈉溶液13.2 mL，2 mol/L NaAc溶液25 mL，重蒸酚250 mL，混合均勻，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 總RNA提取 （1）稱取新鮮紅豆杉葉片24 g，加入240 mL Trizol提取液，閃式提取器高速渦旋2 min。（2）渦旋液室溫放置30 min，使樣品充分裂解后，轉(zhuǎn)入500 mL離心瓶中，3 500 r/min離心5 min。（3）上清液中加入1/5體積氯仿，振搖混勻后于4℃，10 000 r/min離心15 min。（4）上清液加入等體積異丙醇，室溫放置20 min，于4℃，10 000 r/min離心10 min，去上清，獲取沉淀。（5）沉淀用適量75% 乙醇洗滌2-3次，4℃，10 000 r/min離心5 min，取沉淀，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＃?）沉淀用N2吹干至無(wú)乙醇味，加入2 mL已滅菌的DEPC水溶液使沉淀恰好溶解。取少量樣品進(jìn)行HPLC分析和紫外分光光度測(cè)定。

1.2.3 Trizol法的條件優(yōu)化

1.2.3.1 Trizol提取液作用體積的優(yōu)化 以1.2.2.2的RNA提取方法為基本條件，稱取新鮮紅豆杉葉6 g，按葉液比（m/V）3∶20、3∶30、3∶40、3∶50、3∶60，分別加入Trizol提取液，其余操作相同，得到用同樣體積的DEPC水溶液溶解的紅豆杉總RNA樣品，HPLC和紫外分光光度測(cè)定，計(jì)算樣品的濃度與純度，以確定最佳的Trizol提取液作用體積。

1.2.3.2 裂解時(shí)間的優(yōu)化 以1.2.2.2的RNA提取方法為基本條件，將渦旋液分別在室溫中放置5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，其余操作相同，得到用同樣體積的DEPC水溶液溶解的紅豆杉總RNA樣品，HPLC和紫外分光光度測(cè)定，計(jì)算樣品的濃度與純度，以確定最佳的樣品裂解時(shí)間。

1.2.3.3 氯仿作用量的優(yōu)化 以1.2.2.2的RNA提取方法為基本條件，按上清液與氯仿比（V/V）1∶1/5、1∶1/4、1∶1/3、1∶1/1、1∶1，加入氯仿，其余操作相同，得到用同樣體積的DEPC水溶液溶解的紅豆杉總RNA樣品，HPLC和紫外分光光度測(cè)定，計(jì)算樣品的濃度與純度，以確定最佳的氯仿作用量。

1.2.4 紅豆杉RNA檢測(cè)

1.2.4.1 高效液相色譜法分析 色譜條件：Shodex OHpak SB-804 HQ凝 膠 柱（8.0 mm×300 mm；10 μm），流動(dòng)相：0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液—0.1‰疊氮鈉；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

擬南芥miR156對(duì)照品溶液的配制：取擬南芥miR156 雙鏈對(duì)照品 5 nmol（約 100 μg），置于 1.5 mL離心管內(nèi)，加入500 μL滅菌后DEPC水溶液溶解，搖勻即得，過(guò)0.45 μm濾膜，置于4℃冰箱冷藏，備用。

尿嘧啶核苷酸對(duì)照品溶液的配制：精密稱取尿嘧啶核苷酸對(duì)照品5.03 mg，置于1.5 mL離心管內(nèi)，加入1 mL滅菌后DEPC水溶液溶解，搖勻即得，過(guò)0.45 μm濾膜，置于4℃冰箱冷藏，備用。

紅豆杉總RNA供試品溶液的配制：經(jīng)不同方法提取的紅豆杉總RNA沉淀，按紅豆杉葉：DEPC水溶液（m/V = 25∶2）的比例加入已滅菌的DEPC水溶液使沉淀溶解，渦旋混勻，過(guò)0.45 μm濾膜，即得。

紅豆杉RNA酶解溶液的配制：經(jīng)Trizol法提取的紅豆杉RNA沉淀，加入滅菌后DEPC水溶液溶解至濃度為100 μg/mL，經(jīng)檢測(cè)無(wú)RNA降解后，按每9 μg樣品量加入10 μL RNase A的比例加入RNase A，于37℃中保溫60 min，即得。

1.2.4.2 紫外分光光度測(cè)定 經(jīng)不同方法提取的紅豆杉總RNA沉淀，加入已滅菌的DEPC水溶液至沉淀恰好溶解，渦旋混勻，吸取2 μL，檢測(cè)樣品在260 nm下的吸光度與濃度，測(cè)定樣品的OD260/280與OD260/230的比值。

1.2.5 紅豆杉總RNA的純化

1.2.5.1 PVP法 以1.2.2.2的RNA提取方法為基本條件，按物料比（m/m）1∶0.1在Trizol提取液中加入PVP，其余操作相同，得到DEPC水溶液恰好溶解的紅豆杉總RNA樣品，HPLC和紫外分光光度測(cè)定，計(jì)算樣品的濃度與純度。

1.2.5.2 β-巰基乙醇法 以1.2.2.2的RNA提取方法為基本條件，按物料比（m/V）2∶1在Trizol提取液中加入β-巰基乙醇，其余操作相同，得到DEPC水溶液恰好溶解的紅豆杉總RNA樣品，HPLC和紫外分光光度測(cè)定，計(jì)算樣品的濃度與純度。

1.2.5.3 高鹽沉淀法 以1.2.2.2的RNA提取方法為基本條件，上清液加入1/2體積異丙醇和1/2體積高鹽溶液（1.2 mol/L NaCl）共同沉淀，室溫放置20 min，于4℃，10 000 r/min離心10 min，棄去上清液，獲取沉淀，其余操作相同，沉淀用DEPC水溶液恰好溶解，HPLC和紫外分光光度測(cè)定，計(jì)算樣品的濃度與純度。

1.2.5.4 低濃度乙醇沉淀法 以 1.2.2.2 的RNA提取方法為基本條件，氯仿抽提后，上清液加入1/15體積3 mol/L NaAc（pH 5.2）和1/5體積的無(wú)水乙醇，振蕩混勻，冰浴靜置1 h，促進(jìn)多糖沉淀，于4℃，10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入等體積異丙醇，其余操作相同，得到DEPC水溶液恰好溶解的紅豆杉總RNA樣品，HPLC和紫外分光光度測(cè)定，計(jì)算樣品濃度與純度。

1.2.5.5 凝膠柱層析法 稱取新鮮紅豆杉葉25 g，以1.2.2.2的RNA提取方法為基本條件提取紅豆杉總RNA，獲得沉淀用4 mL滅菌后DEPC水溶液溶解，Sephadex G-100型凝膠裝柱（15 mm×60 cm），濕法上樣，流速約為0.35 mL/min，滅菌后DEPC水溶液洗脫約一個(gè)柱體積后接取流分，合并，凍干后加入500 μL滅菌后DEPC水溶液溶解，HPLC分析和紫外分光光度測(cè)定，計(jì)算樣品濃度與純度。

2 結(jié)果

2.1 紅豆杉RNA的HPLC分析

圖1是紅豆杉RNA的HPLC分析圖譜，16 min至17 min出峰的主要是富含miRNA的小分子RNA成分，而18 min至22 min出峰的則是紅豆杉RNA降解產(chǎn)生的碎片和核苷酸類成分。

2.2 不同提取條件的優(yōu)化

2.2.1 Trizol提取液作用體積對(duì)紅豆杉總RNA的影響 HPLC結(jié)果顯示，不同量Trizol提取液作用下，紅豆杉總RNA沒(méi)有出現(xiàn)明顯的降解現(xiàn)象，可以用于進(jìn)一步考察分析。由圖2可知，隨著Trizol提取液作用體積的增加，紅豆杉總RNA的OD260/OD230比值和OD260/OD280比值沒(méi)有顯著差別，但濃度逐漸增大，達(dá)到3∶40時(shí)轉(zhuǎn)向平穩(wěn)。因?yàn)門rizol提取液能迅速破碎細(xì)胞，使核蛋白復(fù)合體中的蛋白質(zhì)變性沉淀并釋放出RNA，作用體積過(guò)小，RNA釋放不完全，作用體積過(guò)大，會(huì)增加反應(yīng)成本，并導(dǎo)致提取時(shí)間延長(zhǎng)，增大RNA的降解可能。因此綜合考慮，紅豆杉葉與Trizol提取液的作用體積比可以控制為3∶40。

圖2 Trizol提取液作用體積對(duì)紅豆杉總RNA的影響

2.2.2 裂解時(shí)間對(duì)紅豆杉總RNA的影響 HPLC結(jié)果顯示，在不同裂解時(shí)間的作用下，紅豆杉總RNA沒(méi)有出現(xiàn)明顯的降解現(xiàn)象，可以用于進(jìn)一步考察分析。由圖3可知，隨著裂解時(shí)間的增加，紅豆杉總RNA的OD260/OD230比值、OD260/OD280比值均沒(méi)有顯著差別，而濃度在20 min時(shí)有小幅度的下降，當(dāng)延長(zhǎng)至30 min時(shí)又回升，但影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這是由于閃式提取器的高速渦旋作用和Trizol提取液的強(qiáng)裂解性，能迅速破碎植物細(xì)胞并釋放出RNA，因此裂解時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)紅豆杉RNA的提取量基本沒(méi)有影響。考慮時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)增加紅豆杉RNA降解的可能性，可以將裂解時(shí)間控制為5 min。

圖3 裂解時(shí)間對(duì)紅豆杉RNA的影響

2.2.3 氯仿作用量對(duì)紅豆杉總RNA的影響 HPLC結(jié)果顯示，在不同氯仿量的作用下，紅豆杉總RNA沒(méi)有出現(xiàn)明顯的降解現(xiàn)象，可以用于進(jìn)一步考察分析。由圖4可知，隨著氯仿作用體積的增加，紅豆杉總RNA的OD260/OD230比值和OD260/OD280比值沒(méi)有顯著差別，但濃度逐漸降低，達(dá)到1∶1時(shí)有小幅度回升。產(chǎn)生濃度降低的原因可能是氯仿作用體積過(guò)高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生大量迅速的變性沉淀，同時(shí)裹攜RNA共同沉淀，致使紅豆杉RNA的提取量減少。但氯仿作用量過(guò)小，可能造成蛋白質(zhì)沉降不完全，影響RNA的純度。因此，綜合考慮，確定氯仿與水液的作用體積比為1∶5。

通過(guò)考察Trizol提取液作用體積、裂解時(shí)間及氯仿作用量對(duì)紅豆杉總RNA的影響，得到紅豆杉葉中總RNA的較優(yōu)提取條件為：紅豆杉葉與Trizol提取液的作用體積比為3∶40；裂解時(shí)間為5 min；氯仿與水液的體積比為1∶5。經(jīng)該條件提取后，可得到濃度約為1 100 μg/mL，OD260/OD280在1.6左右及OD260/OD230在0.5左右的紅豆杉總RNA樣品。

圖4 氯仿作用量對(duì)紅豆杉總RNA的影響

2.3 紅豆杉總RNA的純化結(jié)果

結(jié)果如表1所示，在同樣的提取條件下，PVP法和β-巰基乙醇法雖然能提高紅豆杉總RNA的提取濃度，并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的純化效果，酚類物質(zhì)沒(méi)有很好的去除。低濃度乙醇沉淀法有一定的純化效果，但在去除多糖的同時(shí)裹攜部分RNA一同沉降，大幅度降低了總RNA的提取濃度。凝膠柱層析法能顯著的提高紅豆杉總RNA的純度，除去其中的酚類、多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。通過(guò)對(duì)不同的紅豆杉總RNA的純化方法的考察，確定使用凝膠柱層析法純化總RNA，最終可以得到濃度約為1 000 μg/mL OD260/OD280在2.00-2.20之間及OD260/OD230大于1.70的高質(zhì)量RNA樣品。

2.4 紅豆杉miRNA的分離結(jié)果

取經(jīng)過(guò)Sephadex G-100型凝膠柱純化后的凍干粉，加入500 μL滅菌后DEPC水溶解。應(yīng)用Agilent 2100 Bioanalyzer測(cè)定分離得到的小分子RNA的純度及完整性，由圖5可知，所得的小分子RNA分離干凈，純度較好，無(wú)顯著的降解現(xiàn)象（OD260/OD280=2.15，OD260/OD230= 1.81）。達(dá)到 sRNA 文庫(kù)構(gòu)建的要求，后續(xù)可以進(jìn)行HiSeq測(cè)序及miRNA的鑒定。

表1 不同純化方法對(duì)紅豆杉RNA的影響

圖5 紅豆杉miRNA的分離結(jié)果

3 討論

由于植物中富含多酚、多糖類次級(jí)代謝物質(zhì)，嚴(yán)重干擾植物總RNA的提取，并會(huì)影響逆轉(zhuǎn)錄，基因擴(kuò)增，文庫(kù)構(gòu)建等下續(xù)操作。CTAB法和Trizol法均能提取得到紅豆杉總RNA，但前者在提取過(guò)程中更容易產(chǎn)生較大程度的降解，形成大量的RNA碎片與核苷酸。防止RNA大量降解是RNA提取過(guò)程中首先要注意的問(wèn)題，植物組織破碎瞬間釋放的內(nèi)源性RNA酶及提取過(guò)程中所用器材等攜帶的外源性RNA酶都有可能將RNA降解，因此抑制RNA酶的活性至關(guān)重要。Trizol法中使用的異硫氰酸胍是有效的RNA酶抑制劑，在裂解組織的同時(shí)能對(duì)RNA酶產(chǎn)生強(qiáng)烈的變性作用，此外8-羥基喹啉及重蒸酚也可以造成一定的抑制作用，減少紅豆杉RNA降解，得到比較完全的紅豆杉RNA。而CTAB法中所用的提取試劑缺乏強(qiáng)有力的RNA酶抑制劑，使得RNA在提取過(guò)程中容易被RNA酶降解，若額外再加入RNA酶抑制劑，則導(dǎo)致提取成本提高，不利于紅豆杉RNA的大量制備。而市場(chǎng)上研制的一些專門用于提取植物總RNA的試劑盒，雖然提取總RNA速度快，用時(shí)短，但價(jià)格昂貴，一次提取量很少，不能滿足后續(xù)的需求。因此，綜合考慮，選擇使用Trizol法提取紅豆杉總RNA。PVP能與酚類化合物形成螯合物，使之不能成為多酚氧化酶的底物而抑制酚類的氧化［16］；β-巰基乙醇法具有強(qiáng)還原性，能抑制酚類物質(zhì)氧化成醌類［17］；低濃度乙醇和高鹽能沉淀多糖，分離多糖與RNA［18-20］。但PVP法、β-巰基乙醇、低濃度乙醇和高鹽沉淀法不能得到明顯的純化效果。而凝膠柱層析法能顯著的提高紅豆杉總RNA的純度，除去其中的酚類、多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，這為以后純化高質(zhì)量的RNA提供一個(gè)有效快速的方法。

本研究方法與現(xiàn)有的提取方法相比雖然轉(zhuǎn)移率略有降低，但大大降低了成本，并首次實(shí)現(xiàn)了植物RNA的大量提取，為其后續(xù)試驗(yàn)研究提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)，便于進(jìn)一步植物miRNA的研究。整個(gè)提取過(guò)程，具有簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，可為其他植物總RNA的提取提供參考。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以湖南長(zhǎng)沙紅豆杉葉為材料，建立以Trizol法提取RNA，用閃式提取器快速大量提取植物總RNA的方法。從紅豆杉葉總RNA的提取到純化，考慮降解因素、提取效率、樣品純度等因素，確定了較優(yōu)提取條件：紅豆杉葉與Trizol提取液的作用體積確定為3∶40；裂解時(shí)間確定為5 min；氯仿與水液的作用體積確定為1∶5；在總RNA的研究基礎(chǔ)上使用凝膠柱層析法對(duì)紅豆杉miRNA進(jìn)行分離純化，得到富含miRNA的小分子RNA，且凝膠柱層析法能顯著的提高紅豆杉總RNA的純度，除去其中的酚類、多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，確定了高質(zhì)量紅豆杉總RNA提取純化方案。最終平均每25 g紅豆杉葉中可提取得到總RNA樣品2 200 μg左右，轉(zhuǎn)移率約十萬(wàn)分之八，首次實(shí)現(xiàn)了植物總RNA的大量提取。

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A Method for Extracting Total RNA of Taxus chinensis at Large-scale

CHEN Xiao-feng ZENG Qi-feng DENG Xu ZENG Guang-yao ZHOU Ying-jun
（Xiangya School of Pharmaceutical Science，Central South University，Changsha 410013）

This study was directed to develop the optimal method for the extraction and purification of total RNA in Taxus chinensis R.First，we investigated the effects of extraction reagent，time，and method on the yield of total RNA from T. chinensis R. using Trizol and CATB extraction methods in respect of RNA concentration and the ratios of OD260/OD280and OD260/OD230. Furthermore，we compared the effects of PVP，β-mercaptoethanol，high salt precipitation，low concentration ethanol precipitation and gel column chromatography on the purification of total RNA. The optimal extraction method was determined as follows：treatment of taxus leaves with Trizol by the action volume of 3：40 in 5 minutes using chloroform and water（1 ：5）as solvent. It’s also found that column chromatography significantly improved the purity of total RNA of taxus and obtained small molecular RNA with rich miRNA. Finally，the high-quality RNA in concentration of 1000μg/mL with 2.00 - 2.20 of OD260/OD280and 1.7 of OD260/OD230was acquired. Compared with previous methods，this method provides taxus RNA in large-scale with high quality and purity as well as with low cost，which guarantees sufficient materials.

Taxus chinensis R.；total RNA extraction；Trizol method；CATB method；gel column chromatography

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0319

2017-04-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81573314）

陳小鳳，女，碩士研究生，研究方向：天然藥物化學(xué)成分提取與分離；E-mail：929506981@qq.com

周應(yīng)軍，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：天然藥化研發(fā)與開(kāi)發(fā)；E-mail：yingjunzhou@hotmail.com

（責(zé)任編輯 李楠）