江 麗，李朵姣，胡新榮，祝澤剛，樓宇濤，孔向軍，鄭寨生，袁名安

(金華市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 金華 321017)

培養(yǎng)基組分、模擬降水及溫度對茶樹花粉特性的影響

江 麗，李朵姣，胡新榮，祝澤剛，樓宇濤，孔向軍，鄭寨生，袁名安*

(金華市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 金華 321017)

以茶樹品種‘金茶1號’花粉為試驗材料，采用離體萌發(fā)法研究不同培養(yǎng)基組分對金茶1號花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響，明確花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)條件，并用25/10℃、15/10℃、有水和無水 4 種條件交互處理觀察金茶1號的開花進程。研究表明：金茶1號花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基是5%蔗糖 + 0.001%硼酸 + 0.005%氯化鈣；花粉萌發(fā)率和花粉管長度達到最大值為 4～6 h；15/10℃處理的金茶1號花瓣明顯比25/10℃的大；有水處理的金茶1號花瓣比無水處理的花瓣干重大；金茶1號花藥開裂散粉需在干燥環(huán)境下進行。15/10℃與25/10℃條件下花粉萌發(fā)率沒顯著性差異，影響花粉萌發(fā)的是有無降水。

金茶1號；花粉活力；單花；溫度；降水

茶樹為山茶科(Theacea)山茶屬(Camellia L.)木本植物，主要生長在低山丘陵地帶，喜光，喜溫暖、濕潤氣候，在酸性、微酸性土壤上均能生長，對土層厚度要求不嚴[1-2]。溫度、濕度、光照等會極大影響茶樹開花時間，在一定程度上，導致花芽分化開花時間提早或者推遲。一般情況下茶樹每年1月開始花芽分化，每年9～12月陸續(xù)開放。10月中下旬至11月中旬為盛花期[3-4]。由于茶花開花時外界溫度較低，雨水較多，使茶花花期延長，開花多而不結果[5]，極大降低了茶樹的結實率，從而影響有性繁殖，育種效率降低[6]。

在植物發(fā)育生物學領域中，植株開花進程探究和花粉萌發(fā)生物學特性是重要的研究內(nèi)容[7-9]。外界環(huán)境條件差異直接影響植物有性繁殖能力及育種價值的評價[10]。多種植物研究結果表明溫度，雨水等外界環(huán)境影響茶樹開花進程及花粉萌發(fā)力。花粉離體萌發(fā)的基本條件為：糖源、礦物質(zhì)元素(如外源Ca2+等)及硼酸。適宜的酸堿環(huán)境，充足的糖源、礦物質(zhì)元素以及硼酸，才能使花粉正常萌發(fā)、生長。濃度或高或低，導致滲透壓不平衡，從而導致細胞代謝的紊亂[11-12]。本試驗研究以‘金茶1號’為材料，研究茶樹花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基各組分(蔗糖、硼酸、氯化鈣)最適的濃度，最適培養(yǎng)時間及降水，溫度對開花進程花粉活力的影響，從而為提高金茶1號座果率等提供理論依據(jù)，對茶樹繁殖育種具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料均采自金華農(nóng)業(yè)科學院，栽培在肥沃土壤中的金茶1號花及花粉。挑選開花多年，樹齡為7年，無病蟲害，健康的植株技條，枝條選取南向樹冠中部。

1.2 試驗方法

1.2.1 花的生物學特性 試驗根據(jù)花的開放及花粉開裂散粉與否，把花分為未開放、微開放、開放而花藥未開裂及開放且花藥開裂4種情形。在晴朗的天氣，隨機摘取開放但花藥未開裂5朵金茶1號花朵。分成花瓣、雌蕊和雄蕊 3 個部分測量其生物學特性，包括各部分鮮重，花瓣面積、柱頭長度、花藥長度寬度等，再放入培養(yǎng)皿中在干燥箱55℃烘干至恒重，用天平稱出各部分的干重。

1.2.2 花粉活力的離體萌發(fā)法測定 取8 g瓊脂溶解在500 mL的水，用5%NaOH或5%HC1溶液調(diào)pH為中性，在121℃ 20 min條件下滅菌制成培養(yǎng)基。把培養(yǎng)基置于培養(yǎng)皿中，添加單因子并用解剖針挑取花粉，置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，在25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，用膠頭滴管吸取培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，制成臨時切片，在電子顯微鏡下拍照，用軟件ImageJ[14]測量花粉管的長度，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

在探討每個培養(yǎng)基因子時，以不加該因子作為參照，設置不同的濃度。蔗糖設置6個濃度梯度0%、1%、3%、5%、10%和15%，硼酸設置6個濃度梯度：0.000%、0.001%、0.003%、0.01%、0.02%及0.03%，氯化鈣設置5個濃度梯度：0.000%、0.005%、0.01%、0.02%及0.03%，分別進行單因子篩選。

以上述試驗蔗糖，硼酸，氯化鈣的最適宜濃度配制成培養(yǎng)基，離體培養(yǎng)花粉，得到花粉最適萌發(fā)時間。以花粉管長度大于花粉粒直徑視為萌發(fā)。

1.2.3 模擬降水及溫度對金茶1號開花特性的影響 在晴朗的天氣，收集20個未開放的花蕾，且均連帶5 cm的枝條，用配制好的營養(yǎng)液[15]置于錐形瓶中在培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，分成A、B、C、D組，將A、B組放在25/10℃的培養(yǎng)箱中，A組每天進行水處理，B組不做水處理；將C、D組放在15/10℃的培養(yǎng)箱中，C組每天進行水處理，D組不做水處理。4個培養(yǎng)箱(規(guī)格為60 cm×60 cm×160 cm)用于本試驗，且均能控制溫度、光照、濕度。培養(yǎng)箱晝夜時長設置分別為10 h和14 h，白天光照強度均為(150±10)μmol·m-2·s-1，相對濕度為(85±5)%。水處理的每個試驗組每隔0.5 h噴施蒸餾水0.1 L。觀察金茶1號單花的開花特性，觀察花瓣狀態(tài)，開花順序以及花藥開裂等情況[16]。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗均設置3次重復。用Microsoft Excel2007進行數(shù)據(jù)管理；用IBM spss statistics 20中的Duncan復極差法進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 花的形態(tài)特征

金茶1號單花開放的4個階段的圖片如圖1所示，隨著花朵的開放花瓣面積增大，花瓣由青白色向粉白色轉(zhuǎn)變。第ⅰ時期未見花粉，花瓣面積、花瓣鮮重、花瓣干重、雄蕊鮮重、雌蕊干重、雄蕊鮮重及雄蕊干重均較小，第ⅱ時期至第ⅲ時期花粉逐漸增多并達到最大值，第ⅲ時期花瓣面積2.72 cm2、花瓣鮮重137 mg、花瓣干重23.71 mg、雌蕊鮮重90.27 mg、雌蕊干重15.32 mg、雄蕊鮮重19.42 mg、雄蕊干重1.91 mg、花藥長度0.6 cm及柱頭長度0.9 cm。第ⅳ時期花完全開放花粉減少，花瓣面積、花瓣鮮重及雌蕊鮮重等均減少。

2.2 單因素試驗確定培養(yǎng)基各組分最佳濃度

2.2.1 蔗糖濃度 蔗糖濃度或高或低，均影響花粉萌發(fā)的特性，如圖2所示，隨著蔗糖濃度的增加，金茶1號花粉萌發(fā)率呈上升趨勢，且花粉管長度伸長。當培養(yǎng)基里蔗糖濃度為5%時，金茶1號花粉萌發(fā)率最高以及花粉管最長(96.78%，247.18 μm)，當蔗糖濃度大于5%時，花粉的萌發(fā)受到抑制作用。金茶1號花粉培養(yǎng)培養(yǎng)基里最佳蔗糖濃度為5%。

2.2.1 硼酸濃度 金茶1號花粉萌發(fā)率以及花粉管長度都會受到硼酸影響，在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著硼酸濃度的升高而增加。當硼酸濃度為0.001%時，花粉的萌發(fā)率和花粉管長度最大(分別為91.01%和233.96 μm)，大于0.001%時，導致滲透壓不平衡，對花粉萌發(fā)起抑制作用，從花粉萌發(fā)率和花粉管長度的結果看，金茶1號花粉萌發(fā)培養(yǎng)基最佳硼酸濃度為0.001%。

圖1 金茶1號花瓣形態(tài)Fig.1 The morphological of Jincha 1 (Camellia sinensis)

圖2 蔗糖濃度對花粉萌發(fā)率(A)及花粉管生長(B)的影響Fig.2 Effects of sucrose concentration on pollen germination rate (A) and tube length (B) of Camellia sinensis-Jincha 1

圖3 硼酸濃度對花粉萌發(fā)率(A)及花粉管生長(B)的影響Fig.3 Effects of boric acid concentration on pollen germination rate (A) and tube length (B) of Camellia sinensis-Jincha 1

2.2.3 鈣離子濃度 由于花粉中本身含有一定量的Ca2+，在培養(yǎng)基中鈣離子含量為0時，金茶1號花粉仍有部分萌發(fā)。在0～0.005%范圍內(nèi)，鈣對金茶1號花粉萌發(fā)起促進作用(圖 4)，鈣離子濃度為0.005%時，花粉萌發(fā)率最大，即94.99%；花粉管長度最長，即235.29 μm。鈣離子濃度大于0.005%時，花粉的萌發(fā)率以及花粉管的長度降低，所以金茶1號花粉萌發(fā)最適鈣離子濃度為 0.005%。

圖4 氯化鈣濃度對花粉萌發(fā)率(A)及花粉管生長(B)的影響Fig.4 Effects of calcium chloride concentration on pollen germination rate (A) and tube length (B) of Camellia sinensis-Jincha 1

2.3 最適培養(yǎng)時間

在最適的培養(yǎng)基培養(yǎng)下，隨著培養(yǎng)時間的延長，金茶1號花粉萌發(fā)率和花粉管長度會不斷增加。如圖5所示。但≥6 h時，花粉管長度會稍微增加。隨著培養(yǎng)時間的增加，微生物量增加，影響試驗的觀察效果，本試驗得到金茶1號花粉萌發(fā)最佳培養(yǎng)時間為4～6 h。

圖5 培養(yǎng)時間對花粉萌發(fā)率(A)及花粉管生長(B)的影響Fig.5 Effects of culture time on pollen germination rate (A) and tube length (B) of Camellia sinensis-Jincha1

2.4 模擬降水、溫度對金茶1號開花的影響

2.4.1 模擬降水、溫度對其開花影響 本研究中有水處理的金茶1號，較早開花，花瓣面積較大，花瓣飽滿，但花粉較少，花瓣有腐爛并伴隨花瓣的掉落。無水處理的金茶1號，早開花，花藥開裂散粉，但花瓣小。25/10℃有水處理的的金茶1號比15/10℃有水處理的早開花2 d，但花瓣較小。

2.4.2 模擬降水、溫度對花粉萌發(fā)的影響 由圖6可以得到，當處理條件為(25/10)℃無水處理時，花粉萌發(fā)率最高，其次(15/10)℃無水處理的花朵，但不存在明顯的差異，而(15/10)℃無水處理的花粉管較長。當有水處理時，花朵的花粉萌發(fā)率以及花粉管長度無明顯差異。綜上所述，可以得出結論：無水條件下，花粉萌發(fā)率提高而且花粉管長度較長；有水條件下，花粉萌發(fā)率降低，花粉管長度較短。綜上所述溫度對花粉萌發(fā)率影響不大。

3 結論與討論

研究茶樹開花特性是培育茶樹新品種以及提高結實率的重要途徑之一。茶樹是典型的蟲媒花，而且是異花授粉的冬季開花植物。由于開花期間溫度低、昆蟲少有活動，從而導致茶樹天然結實率較低[17]。金茶1號花的開放的過程中隨著花的生長，花瓣、花藥等均變大?；ㄩ_放后，花藥開裂散粉導致雄蕊的干重和鮮重呈先增大后減少。溫度、光照、水分等對花的開放影響很大，如光照不足，會導致花蕾、花瓣萎蔫與脫落[18]。

圖6 溫度和降水對花粉萌發(fā)率(A)及花粉管生長(B)的影響Fig.6 Effects of temperature and precipitation on pollen germination rate (A) an tube length (B) of Camellia sinensis-Jincha1

蔗糖是在花粉萌發(fā)過程中提供了碳源，參與花粉萌發(fā)及花粉管壁合成，并對滲透壓的調(diào)節(jié)起重要的作用[19]；蔗糖濃度的高低都會影響花粉萌發(fā)[20]，過高或過低都會導致花粉內(nèi)外滲透壓失衡，從而使細胞失水或者膨脹。結果表明，金茶1號內(nèi)外的滲透壓平衡最適蔗糖濃度為5%。硼酸離子與蔗糖之間相互作用，形成絡合物在細胞質(zhì)膜中運輸，從而利于物質(zhì)的吸收與代謝[21]。當缺硼培養(yǎng)后，酯化果膠含量則明顯減少，降低了花粉管壁的延展性[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，0.001%的硼酸濃度為促進金茶1號花粉萌發(fā)的最佳濃度，與臺茶12號以及福鼎大白茶一致[24]。鈣離子參與花粉管的萌發(fā)是在蔗糖和硼的主導作用下起輔助作用的一個必需的生理生化過程[25]。金茶1號花粉萌發(fā)和花粉管伸長的最佳氯化鈣濃度為0.005%。本研究得到金茶1號最適時間為4～6 h。金茶1號花粉的最佳培養(yǎng)基為5%蔗糖+0.001%硼酸+0.005%氯化鈣。

花期和氣象因子如溫度、濕度及降水相關性較大[26-26]。本研究表明溫度、降水的處理影響金茶1號開花進程。在15/10℃下，金茶1號開花較晚，生長到一定程度開花，從而積累較多的有機物。降水處理，花瓣掉落、少許花瓣腐爛，導致花期縮短，影響花瓣的美觀，且無水條件下，花藥開裂散粉，花粉萌發(fā)率提高，而且花粉管長度較長，說明金茶1號花藥的開裂散粉需要一定的干燥環(huán)境；有水條件下，花粉萌發(fā)率降低，花粉管長度較短。本研究通過不同降水以及溫度對花的開放以及花粉萌發(fā)率的影響，為金茶1號育種提供重要的依據(jù)。

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EffectsofMediumComponents,SimulatedPrecipitationandTemperatureonPollenCharacteristicsofTea(Camelliasinensis)

JIANG Li, LI Duo-jiao, HU Xin-rong, ZHU Ze-gang, LOU Yu-tao,KONG Xiang-jun, ZHENG Zhai-sheng, YUAN Min-gan*

(JinhuaAcademyofAgriculturalSciences,Jinhua,Zhejiang321017,China)

The effects of medium components on pollen germination and pollen tube growth ofCamelliasinensis- Jincha 1 that took as test materials were studied using in vitro culture to clarify the optimal culture condition. Jincha 1 was subjected to four environmental /treatments (25/10℃, 15/10℃, with water or without water) to observe the flowering process. The results showed that the best medium for pollen germination was 5% sucrose, 0.001% boric acid plus 0.005% calcium chloride. The optimum time was 4-6 h for pollen germination and pollen tube growth. The petals were obviously bigger in the 15/10℃ treatment than that in the 25/10℃ treatment. The dry weight of petals was higher in the water treatment than that of the water-free treatment. Anther dehiscence required a dry environment. There is no significant difference in pollen germination in the temperature in the15/10℃ and 25/10℃, and the effect of pollen germination is the presence of precipitation. This research shows significance for improving the ornamental value and facilitating cross breeding of Camellia sinensis- Jincha 1 with extended blooming period and enlarged petals.

Jincha 1(Camelliasinensis); pollen viability; single flower; temperature; precipitation

S685.15

A

2096-0220(2017)03-0127-06

2017-03-23初稿；2017-08-11修改稿

浙江省公益技術研究計劃項目(GN18C160030)。

江麗(1989-)，女，碩士，初級農(nóng)藝師，主要從事特色茶樹品種選育，茶葉籽高效栽培與綜合利用技術研究。

E-mail: 992858598@qq.com

*通訊作者：袁名安(1983-)，男，碩士，高級農(nóng)藝師，主要從事特色茶樹品種選育、茶葉籽高產(chǎn)栽培與綜合利用技術研究。

E-mail: 33067988@qq.com