陳 迪 ，劉楠囡 ，林 雯 ，陳 哲 ，林 峰 ，馬 艷 ，李秀華 ，

（1.福州出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建福州 350001；2.福建師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，福建福州 350108；3.漳州出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建漳州 350006；4.閩江師范高等?？茖W(xué)?；瘜W(xué)與生物工程系，福建 福州 350000）

紫外分光光度計(jì)法測(cè)定茶葉中鄰苯基苯酚的含量

陳 迪1，劉楠囡2，林 雯3，陳 哲4，林 峰1，馬 艷1，李秀華2，1

（1.福州出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建福州 350001；2.福建師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，福建福州 350108；3.漳州出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建漳州 350006；4.閩江師范高等?？茖W(xué)?；瘜W(xué)與生物工程系，福建 福州 350000）

為建立茶葉中的鄰苯基苯酚含量的測(cè)定方法，利用甲醇:水(7:3)作為萃取劑,萃取方法選擇超聲波萃取法，萃取出茶葉中的鄰苯基苯酚，采用紫外分光光度法，建立鄰苯基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。對(duì)萃取劑，緩沖液，最適宜pH值等條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的鄰苯基苯酚濃度與吸光度具有良好線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.994，加標(biāo)回收率在90.1%～91.2%之間，證明該方法切實(shí)可行。該研究為通過(guò)超聲波萃取結(jié)合紫外分光光度法能夠測(cè)定茶葉中鄰苯基苯酚，并且該方法具有準(zhǔn)確度高，反應(yīng)靈敏，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

茶葉；超聲波提取法；鄰苯基苯酚；紫外分光；標(biāo)準(zhǔn)曲線

食品的三大機(jī)能：營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性、嗜好性感官品質(zhì)特征、對(duì)人體的調(diào)節(jié)技能或保健機(jī)能。茶葉是為數(shù)不多的同時(shí)具備這三大機(jī)能要求的完美食品。茶不僅能夠帶給人們味覺(jué)的享受，還能夠促進(jìn)人們的身體健康，種種好處使得茶受到越來(lái)越多人的歡迎。飲茶、品茶已經(jīng)成為人們生活中不可缺少的一部分。隨著茶葉風(fēng)靡全球，越來(lái)越多人開始重視茶葉的質(zhì)量和安全問(wèn)題。但是在茶葉的生長(zhǎng)過(guò)程中，為了殺蟲除菌、提高增產(chǎn)率，不可避免的會(huì)使用到農(nóng)藥，農(nóng)藥會(huì)殘留在茶葉上極難清除，也不可避免的會(huì)對(duì)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生危害或者有潛在的威脅。有資料顯示，中國(guó)的茶樹除了有機(jī)茶被限制不能噴灑農(nóng)藥，99%的茶樹都或多或少的噴撒了農(nóng)藥?，F(xiàn)在世界上有近30億人飲用茶，世界各地都有種植茶葉和茶葉進(jìn)出口貿(mào)易，在如此大的需求面前，許多國(guó)家制定的農(nóng)藥殘留相關(guān)法規(guī)并沒(méi)有那么完善，大部分國(guó)家只標(biāo)明了茶葉中農(nóng)藥殘留的最大標(biāo)準(zhǔn)，而并不是禁止農(nóng)藥殘留的存在。同時(shí)各個(gè)國(guó)家對(duì)茶葉的農(nóng)藥殘留相關(guān)的法律法規(guī)也不統(tǒng)一，例如，歐洲因?yàn)榈赜驓夂蜿P(guān)系不適合種植茶葉，同時(shí)對(duì)食品的安全衛(wèi)生要求更高，因此它對(duì)茶葉農(nóng)藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)最嚴(yán)格，而中國(guó)的產(chǎn)茶量和出口量居世界領(lǐng)先，但由于國(guó)外貿(mào)易壁壘日趨嚴(yán)格，導(dǎo)致了中國(guó)茶葉的出口量減少[1]，主要原因是因?yàn)橹袊?guó)關(guān)于茶葉農(nóng)藥殘留量的指標(biāo)還未完善[2]。這幾年茶葉農(nóng)殘相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)不斷更新出臺(tái)，可見(jiàn)茶葉中農(nóng)藥殘留問(wèn)題越來(lái)越受到重視[3]。

近五年，歐盟對(duì)茶葉相關(guān)法規(guī)進(jìn)行了多達(dá)69次修訂，茶葉農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)限制對(duì)象已經(jīng)從茶園中使用的一般農(nóng)藥擴(kuò)展到草甘膦等除草劑，再到蒽醌、多氯酸鹽等環(huán)境污染物。最近出口歐盟的茶葉中又查出鄰苯基苯酚這一防腐殺菌劑，鄰苯基苯酚是一種能夠致癌的物質(zhì)，對(duì)腎臟會(huì)產(chǎn)生毒副作用，危害人體健康，因此迫切需要建立一種高效，快捷的方法來(lái)測(cè)定茶葉中鄰苯基苯酚。鄰苯基苯酚，又叫做2-羥基聯(lián)苯(ortho-phenylpheno，簡(jiǎn)稱OPP)，一般為白色片狀或塊狀，具有一定生物毒性。鄰苯基苯酚具備良好的殺菌殺毒能力，是常用的防腐劑之一，一般都用在對(duì)果蔬類的防腐和保鮮，或者是用于紡織品、橡膠制品、化妝品等當(dāng)中的消毒劑和防腐劑。目前，OPP殘留檢測(cè)的主要方法有液相色譜法[4-7]、氣相色譜法或氣相色譜-質(zhì)譜法[8-10]。色譜法分析成本高，色譜儀價(jià)格及日常維護(hù)費(fèi)用貴，分析時(shí)間一般比較長(zhǎng)。而紫外檢測(cè)器是最普遍的檢測(cè)途徑，大部分物質(zhì)在液體狀態(tài)下都有紫外檢測(cè)光譜，其吸光值和其濃度呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，且不同的物質(zhì)的紫外峰基本都是唯一峰，并且紫外分光光光度法適合大眾能夠做到的檢測(cè)方法，它還擁有分析成本低、紫外檢測(cè)儀價(jià)格及日常維護(hù)費(fèi)用低、準(zhǔn)確度高、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。

茶葉中因含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和化合物，增加了茶葉前處理的難度。而茶葉的前處理是整個(gè)分析過(guò)程的重要步驟，高效快速的提取方法更是茶葉中農(nóng)藥殘留分析的核心，直接影響后期檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度。因此農(nóng)藥殘留分析茶葉的前處理要求提取率高，盡量少用或不用有機(jī)溶劑[11]，以減少污染。常見(jiàn)的樣品前處理方法主要有干法灰化法、固相萃取法、超聲波提取法等[12-14]，通過(guò)查閱文獻(xiàn)[15-20]，本實(shí)驗(yàn)采用超聲波萃取法作為茶葉的前處理方法。超聲波提取法是利用超聲波強(qiáng)化提取作用，即媒質(zhì)產(chǎn)生獨(dú)特的機(jī)械振動(dòng)作用和空化作用，機(jī)械振動(dòng)作用將超聲波的能量傳遞給樣品，使組分脫附和溶解加快；空化作用使分子運(yùn)動(dòng)加快[21]。超聲波提取法操作簡(jiǎn)單，并且它擁有操作簡(jiǎn)便、提取效率高，可克服常規(guī)方法的被測(cè)成分在多次轉(zhuǎn)移中損失，從而影響檢測(cè)準(zhǔn)確性的缺點(diǎn)。近年來(lái)超聲波提取法在茶葉的前處理中有著廣泛應(yīng)用[19-21]。

本文將專門講述先用甲醇：水，甲醇，乙醇溶液分別為提取試劑，并采用超聲波萃取來(lái)提取茶葉中的鄰苯基苯酚，結(jié)合紫外分光光度計(jì)分析在不同緩沖液中，不同pH值下鄰苯基苯酚的最大吸收峰并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)計(jì)算加標(biāo)回收率確定方法的準(zhǔn)確性。從而建立了一種快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)茶葉中鄰苯基苯酚含量的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

1.1.1 試劑

2-苯基苯酚，Rd，Nanqiao Twon，F(xiàn)engxian Shanghai，China；甲醇，AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇，AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；茶葉，西湖龍井，浙江省杭州市1.1.2 儀器設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，UV1901PC，上海棱光技術(shù)有限公司；電子天平，ML104/02，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超聲波清洗器，KQ3200E，昆山市超聲儀器有限公司

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳溶劑（萃取劑）的選擇

鄰苯基苯酚微溶于水，因此選擇了三種不同極性的溶劑[22-23]（甲醇：水，甲醇，乙醇）來(lái)進(jìn)行比較選出最佳溶劑。

稱取鄰苯基苯酚，在其他制備條件保持不變的前提下，使用三種不同溶劑：甲醇：水（7:3）、甲醇、乙醇分別配制6 μg/mL，分別以不同溶劑作為空白進(jìn)行基線的確定，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)多次進(jìn)行光譜的連續(xù)掃描，并作出紫外峰來(lái)進(jìn)行比較?？芍状迹核?:3）紫外吸收峰最好，并采用其作為溶液的溶劑（萃取劑）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，甲醇：水（7:3），甲醇，乙醇三種萃取劑的標(biāo)準(zhǔn)溶劑吸收曲線峰形一致，在其他條件不變的是情況下，甲醇：水（7:3）溶劑的紫外峰最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值最好，更故采用甲醇：水（7:3）作為樣品的萃取劑。

2.2 OPP紫外檢測(cè)方法優(yōu)化

2.2.1 OPP最大吸收波長(zhǎng)的選擇

吸取2 μg/mL的OPP溶液于比色皿中，以甲醇：水（7:3）溶劑作為空白進(jìn)行基線的確定，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)多次進(jìn)行光譜的連續(xù)掃描，如圖（1），以確定OPP的最大吸收波長(zhǎng)。

圖（1） 最大吸收波長(zhǎng)的確定

由圖（1）可知，鄰苯基苯酚在190～400 nm范圍內(nèi)，在201.0、283.5 nm波長(zhǎng)處均有吸收峰，其中以201.0 nm處的吸收峰最強(qiáng)，無(wú)雜峰干擾且較為穩(wěn)定，適合作為最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 OPP適宜緩沖液的選擇

在三組6 μg/mL的OPP溶液分別加入pH=8.5的不同的緩沖液（BR緩沖液，PBS緩沖液，醋酸緩沖液），分別加入于比色皿中，以甲醇：水（7:3）溶劑作為空白進(jìn)行基線的確定，在其他制備條件保持不變的前提下，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)多次進(jìn)行光譜的連續(xù)掃描，通過(guò)其紫外峰的最大吸收峰來(lái)確定最適宜的緩沖液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，三種不同緩沖液（BR緩沖液，PBS緩沖液，醋酸緩沖液）對(duì)于OPP標(biāo)準(zhǔn)液的影響的不同程度，其中醋酸緩沖液所得吸光值最大，但因其最大吸收波長(zhǎng)處也導(dǎo)致偏離，故選用BR緩沖液作為OPP溶液的適宜緩沖液。

2.2.3 OPP最適宜緩沖液pH值的選擇

通過(guò)查閱文獻(xiàn)可知[24]，在酸性條件下,pH對(duì)OPP的紫外吸收影響不大，故在 6μg/mL 的 OPP 溶液中加入 pH 值為 6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10 的 BR 緩沖液，并測(cè)其最大吸收峰。根據(jù)不同pH值測(cè)得的吸光度繪制pH值與吸光度的變化關(guān)系。得出6 μg/mL OPP標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同pH值下BR緩沖液的吸光值，可知OPP標(biāo)準(zhǔn)溶液在pH=7.5下的吸光值最好。

2.3 OPP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

從上述 OPP 儲(chǔ)備液（200.0 μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)溶液中精確吸取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、1mL 定容于 10mL 容量瓶，配制 2、4、6、8、10、12、20 μg/mL 質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。從2 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取5mL定容于10mL容量瓶中配制1μg/mL溶液。從20μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取 0.1、0.25、0.75mL定容至 10mL容量瓶中配制 0.2、0.5、1.5μg/mL 溶液。從1μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2mL 定容至 10mL 容量瓶中配制 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12μg/mL溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液均用甲醇：水（7:3）定容，采用最佳緩沖液的pH值，并在最大吸收波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外掃描得出OPP標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出線性相關(guān)系方程如圖（2）。

圖（2） OPP標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)定不同濃度鄰苯基苯酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（2），可知鄰苯基苯酚濃度與吸光度沒(méi)有呈直線關(guān)系，通過(guò)分析，取lgC為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)，并擬合得到回歸方程：y=0.3x+1.505，線性相關(guān)系數(shù)為0.994。由圖（2）可以看出當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度在0.02～12μg/mL范圍內(nèi)，鄰苯基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好。說(shuō)明使用該曲線測(cè)定待測(cè)樣品的鄰苯基苯酚含量具有較高的準(zhǔn)確性。

2.4 樣品的預(yù)處理與測(cè)定

2.4.1 樣品的預(yù)處理

稱取0.1g茶葉樣品，碾碎于離心瓶中加入甲醇：水（7：3）萃取劑10mL，在超聲波清洗器中超聲提取20分鐘，將萃取劑倒出在10mL燒杯中備用。

2.4.2 樣品的測(cè)定和樣品加標(biāo)回收率的測(cè)定

提取超聲后的萃取劑0.1 mL稀釋至10 mL,加入BR緩沖液，以甲醇：水（7:3）溶劑作為空白進(jìn)行基線的確定，作出樣品的紫外峰與OPP標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外峰圖進(jìn)行比較。

量取上述稀釋后樣品溶液均勻液體試樣5 mL，裝入比色皿中在最大波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外掃描，確定空白樣品中OPP的含量。然后分別量取3份均勻液體試樣5mL，加入5 mL質(zhì)量濃度為 0.5、2、8 μg/mL的OPP溶液。以甲醇：水（7:3）溶劑作為空白進(jìn)行基線的確定，采用最佳緩沖液的PH值，在最大波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外掃描。每組回收率測(cè)定3次，取平均值進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算結(jié)果如表1所示，由此可見(jiàn)，其加標(biāo)回收率范圍在90.1%～91.2%，回收率在正常范圍內(nèi)，符合加標(biāo)回收率的標(biāo)準(zhǔn)，證明方法是可行的。

表一 OPP加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

1.3.4 干擾物實(shí)驗(yàn)的測(cè)定

為確定茶葉中是否有其他物質(zhì)干擾影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測(cè)定，分別配制兒茶素、咖啡因、維生素C 6μg/mL，取1mL裝入比色皿中，作出三種物質(zhì)的紫外吸收峰，和OPP標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外峰圖進(jìn)行比較，觀察是否對(duì)最大波長(zhǎng)處的吸收峰有影響。實(shí)驗(yàn)證明上述物質(zhì)對(duì)該檢測(cè)方法均無(wú)干擾。

3 總結(jié)

本實(shí)驗(yàn)建立了茶葉中的鄰苯基苯酚含量的測(cè)定方法，具有準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。利用甲醇:水（7:3）作為萃取劑，萃取方法選擇超聲波萃取法，萃取出茶葉中的鄰苯基苯酚，并采用紫外分光光度法，建立鄰苯基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的萃取劑，緩沖液，最適宜pH值等條件進(jìn)行優(yōu)化。在在0.02～12μg/mL范圍內(nèi)，鄰苯基苯酚濃度與吸光度具有良好線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)為0.994，加標(biāo)回收率在90.1%～91.2%之間，符合加標(biāo)回收率的標(biāo)準(zhǔn)，證明方法是可行的。結(jié)論為通過(guò)超聲波萃取結(jié)合紫外分光光度法能夠測(cè)定茶葉中鄰苯基苯酚，并且該方法具有準(zhǔn)確度高，反應(yīng)靈敏，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

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福州市科技局項(xiàng)目（No.2015-s-160,2015-G-72），福建省科技廳項(xiàng)目（2017J01620；2016J05026）

陳 迪（1982-），女，江蘇人，農(nóng)業(yè)推廣碩士，工程師，研究方向進(jìn)出口茶葉貿(mào)易與檢驗(yàn)。