杜一帆 閆華超

(1.首都醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，北京 100069；2.聊城大學 生命科學學院，山東 聊城 252059)

Pb2+對黑斑蛙早期生長發(fā)育影響的研究①

杜一帆1閆華超2

(1.首都醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，北京 100069；2.聊城大學 生命科學學院，山東 聊城 252059)

研究了Pb2+質量濃度在10，20，30，40和50 mg/L時對黑斑蛙(Rananigromaculata)胚胎期及Pb2+質量濃度在0.07，0.30，1.00 mg/L時對黑斑蛙蝌蚪期生長發(fā)育的影響.結果表明，Pb2+對胚胎期的毒性于孵化期和開口期表現(xiàn)顯著，其余各期毒性不如這兩期明顯. Pb2+能影響黑斑蛙胚胎期和蝌蚪期的生存率，對蝌蚪的生長發(fā)育具有明顯的抑制作用(P<0.01)，但組間差異均不顯著(P>0.05)；同時質量濃度為30，40，50 mg/L時會導致孵化期胚胎畸形，致畸率50 mg/L質量濃度水平最高(4.41%)，40 mg/L水平次之(3.33%)，30 mg/L水平最低(2.39%).各質量濃度水平均導致蝌蚪頭部泡狀膨大、“S”型尾和形體較小(為正常體長的0.50-0.67)等，致畸率1.00 mg/L質量濃度水平最高(2.25%)，0.30 mg/L水平次之(2.00%)，0.07 mg/L水平最低(0.50%).并對致毒原因進行了初步分析.

Pb2+，黑斑蛙，早期發(fā)育，胚胎期，蝌蚪期

目前中國由于在重金屬的開采、加工、冶煉過程中，造成一些重金屬如鉛、汞、鈷、鎘等進入大氣、水、土壤引起嚴重的環(huán)境污染.隨著廢水的排放，水域污染日益嚴重.其中鉛是最常見的重金屬之一，當鉛離子濃度超過國家規(guī)定的農(nóng)田水質標準時，就會對水生生物產(chǎn)生一定的毒害作用[1,2]，進而對位于食物鏈上層的哺乳動物造成毒害[3,4].國內外對重金屬致淡水魚類的毒害進行了大量研究[1-5]，而有關重金屬對兩棲類影響的報道不多[6,7]：李萬江[8]做了重金屬鉛、汞對花背蟾蜍蝌蚪毒性作用的初步研究；Lefcort[2]等研究了重金屬對青蛙生長發(fā)育的影響；蔡垚等[9]研究了重金屬鎘和鉛對黑斑蛙肝臟過氧化氫酶活性的影響；陽增[10]研究了 Hg2+、Pb2+對牛蛙坐骨神經(jīng)干動作電位閾值及傳導速度的影響；賈秀英[11-13]等研究了鎘、鉛對黑斑蛙臟器組織的亞慢性毒性效應及對雄性黑斑蛙生殖毒性. 為此，本文選擇了聊城市區(qū)黑斑蛙的受精卵為研究對象，用染毒法研究了Pb2+對黑斑蛙胚胎期及蝌蚪期生長發(fā)育的影響，以此探討Pb2+影響兩棲類生長發(fā)育的機制，為進一步探討重金屬污染對水生動物的毒害機理積累科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試劑

Pb(Ac)2為國產(chǎn)分析純，取Pb(Ac)2用蒸餾水配成含Pb2+為100 mg/L的母液并滴入幾滴冰乙酸以防止鉛離子水解，再用蒸餾水連續(xù)稀釋至實驗濃度.

1.2 材料

實驗材料采自徒駭河聊城區(qū)段，于4月底至5月中旬取河水中未發(fā)育的黑斑蛙卵塊，放入清潔的容器內帶回實驗室鏡檢，剔除未受精的卵，將受精卵養(yǎng)在大魚缸中.一部分直接供胚胎期毒性試驗用，另一部分待其孵化至蝌蚪期，供蝌蚪期的毒性試驗用.胚胎發(fā)育分期參照朱治平[14]的方法.

1.3 方法

1.3.1 Pb2+對胚胎期發(fā)育的影響.以國家農(nóng)田水質標準[15]中的鉛離子濃度為最低濃度，依次設計5個濃度梯度，各濃度水平依次為10，20，30，40，50 mg/L.先預實驗，找出藥劑作用的大致濃度范圍(即出現(xiàn)死亡的濃度到全部死亡的最低濃度).然后分組實驗，每組取受精卵30粒，置于高為2 cm、直徑為12cm的培養(yǎng)皿中，分別放入上述各濃度梯度的溶液，設3個平行組，1個對照組，實驗在培養(yǎng)箱內進行(水溫23℃-26℃).按胚胎發(fā)育的各個時期進行連續(xù)觀察，記錄畸形數(shù)和死亡數(shù)，死亡的胚胎予以剔除，并統(tǒng)計其平均值，最后計算出各期畸形率(各期畸形率=各期畸形尾數(shù)/實驗總尾數(shù)×100%)和各期死亡率(各期死亡率=各期死亡尾數(shù)/實驗總尾數(shù)×100%).結果采用t檢驗(P<0.05差異顯著，P<0.01差異極顯著).

1.3.2 Pb2+對蝌蚪期發(fā)育的影響

(1) Pb2+對蝌蚪24、48 h的半致死濃度獲得：先預試，找出24、48 h 半致死濃度范圍(29-31 mg/L).設置9個濃度梯度(質量濃度水平依次為29.00，29.25，29.50，29.75，30.00，30.25，30.50，30.75 ，31.00 mg/L)設3個平行組.在高為9 cm、直徑為20 cm的玻璃水槽中，放入供試濃度的藥液500 mL.每個水槽中放入正常發(fā)育的蝌蚪30尾，試驗開始后分別于24、48 h，檢查其死亡率，統(tǒng)計并計算出LC50值.

(2) Pb2+對蝌蚪生長發(fā)育的影響：實驗設計鉛離子梯度濃度分別為0.07，0.30，1.00 mg/L的3個實驗組和1個對照組，實驗用水為蒸餾水，每個梯度濃度做2個平行，于每個水族玻璃缸中分別放入200尾進行觀察.記錄各缸畸形數(shù)和死亡數(shù)，統(tǒng)計畸形率.為保持培養(yǎng)液的清潔和濃度的穩(wěn)定，每3天換一次染毒水，每5天用毫米方格紙測量一次蝌蚪的尾長、尾寬和頭長，每缸每次隨機測量10尾蝌蚪，取其平均值.畸形率=[各時期畸形尾數(shù)總和/400(每缸總尾數(shù)200×2個平行)]×100%.結果采用t檢驗，P<0.05差異顯著，P<0.01差異極顯著.

2 結果與分析

2.1 Pb2+對黑斑蛙50%出膜時間及孵化率的影響

圖1 鉛離子濃渡對黑斑蛙受卵的孵化影響

在黑斑蛙受精卵的孵化過程中隨著Pb2+的濃度的增加，50%出膜時間明顯縮短(表1，圖1)，其原因估計是鉛離子增加了黑斑蛙受精卵角質保護膜的通透性，從而使胚胎能從外界更快獲得氧氣而加快發(fā)育的速度，也可能是保護膜受損，使蝌蚪更容易出膜，所以表現(xiàn)為出膜時間縮短.從圖1上我們還可以看出，鉛離子達到一定濃度時，50%出膜時間從24.4 h迅速縮短為18.8 h，但隨著鉛離子濃度的梯度提高，50%出膜時間的趨近一固定值，這說明鉛離子對受精卵角質膜的通透作用是有一個極限濃度的，當超過該濃度時，高出的濃度對50%出膜時間不再有明顯影響.

表1 鉛離子各濃度組50%出膜時間及孵化率

另外通過對實驗數(shù)據(jù)的分析還發(fā)現(xiàn)，鉛離子的濃度對孵化期的孵化率基本沒有影響，主要原因是在孵化期以前，蝌蚪的孵化完全靠卵黃儲備的營養(yǎng)，而鉛離子的滲透在短時間內通過卵膜進入胚胎內的量極小，對胚胎發(fā)育不會產(chǎn)生明顯影響(表1).

2.2 Pb2+對黑斑蛙胚胎發(fā)育的毒性影響

在胚胎發(fā)育的25個時期中，鉛離子在有效濃度下(30-50 mg/L)對孵化期及開口期毒性影響較為明顯，其余各期影響不顯著，原因可能是孵化后胚胎失去了卵角質膜的保護，鉛離子更易進入，致使胚胎內鉛離子的沉積量增大，毒性增大，從而出現(xiàn)了死亡的第一個高峰期；又由于蝌蚪攝食活動的出現(xiàn)、呼吸活動的加強，使鉛離子進入胚胎體內的機會進一步增多，使胚胎內鉛離子的濃度增大，出現(xiàn)了死亡的第二個高峰期.其中第二個高峰期的死亡率略大于第一個高峰期，顯然與鉛離子隨著機體生命活動的加強而進入體內的量增多有關.

黑斑蛙在自然環(huán)境中，畸形個體極少被發(fā)現(xiàn)，因而有關畸形現(xiàn)象的報道和研究資料也很少.除極少數(shù)未受精卵外，黑斑蛙胚胎都能發(fā)育到出水孔完成期.按國家農(nóng)田水質標準，鉛離子對黑斑蛙胚胎的毒性影響不明著.隨著鉛離子濃度的增大，死亡率逐漸升高.由實驗所測得的鉛離子有效作用濃度范圍(表2)可知，鉛離子對黑斑蛙胚胎的影響在高濃度下較顯著.

表2 鉛離子對黑斑蛙胚胎發(fā)育的影響

注：*P>0.05 差異不顯著；**P<0.05 差異顯著；***P<0.01 差異極顯著(與對照組比較)

圖2 鉛離子濃度對黑斑蛙胚胎的影響

黑斑蛙孵化期的鉛離子致毒畸形主要表現(xiàn)為腹部膨大(見圖3、4)和泡狀炎癥(見圖5、6)，主要原因可能是鉛離子進入黑斑蛙胚胎內后影響了它們的正常生理活動從而導致內臟器官發(fā)炎，雖能存活一段時間，但其發(fā)育停滯于肌效期，最后腹部破裂死亡.開口期的致毒畸形主要表現(xiàn)為尾部側彎及上翹(見圖7、8)，分析原因可能是鉛離子對黑斑蛙胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒害作用所致，但胚體能繼續(xù)發(fā)育.可見鉛離子對胚胎的畸形發(fā)生有一定的影響.

圖3 畸形的蝌蚪(腹部膨大)與正常蝌蚪比較 圖4 腹部膨大破裂的蝌蚪

圖5 頭部出現(xiàn)泡狀炎癥的蝌蚪 圖6 腹部出現(xiàn)泡狀炎癥的蝌蚪

圖7 尾部側彎的蝌蚪 圖8 尾部彎曲上翹的蝌蚪

2.3 Pb2+對蝌蚪期發(fā)育的影響

表3鉛離子對蝌蚪24、48 h的半致死濃度

平均體長/cm平均體重/gLC50/mg/L24h48h10．550．01330．4530．18

2.3.1 Pb2+對蝌蚪24、48 h的半致死濃度.根據(jù)3個平行組中蝌蚪的死亡率，統(tǒng)計得出24、48 h 的LC50值(表3).通過分析LC50數(shù)據(jù)可以得出這樣的結論：蝌蚪對鉛離子的耐受性較強，只有在較高濃度下(30 mg/L)，鉛離子對蝌蚪的死亡率才有明顯的影響.

2.3.2 Pb2+對蝌蚪生長發(fā)育的影響

(1) 蝌蚪致畸現(xiàn)象的觀察：黑斑蛙蝌蚪鉛離子染毒畸形主要表現(xiàn)為頭部和腹部出現(xiàn)泡狀炎癥，呈膨大透明狀，在0.07，0.30和1.00 mg/L濃度水平畸形率分別為0.25%，0.75%和0.25%；個體生長緩慢(不及正常個體大小的60%)，尾巴呈“S”型的在0.07，0.30和1.00 mg/L濃度水平畸形率分別為0.25%，1.25%和2.00%.結果顯示：1.00 mg/L質量濃度水平的畸形率最高，為2.25%；0.30 mg/L質量濃度水平次之，為2.00%；0.07 mg/L質量濃度水平最低，為0.50%.

(2) 鉛離子對蝌蚪尾長、尾寬和頭長的影響：分別于第5、15、25、35和45 d時，每缸中各測量8尾黑斑蛙蝌蚪，測量指標有尾長、尾寬和頭長，取其平均值(表3).由于5 d前各濃度梯度組蝌蚪尾長和頭長相差很小，故各濃度組的平均增長量以45 d時的長度減去第5 d時的長度來計算；而尾寬在第5 d時都在1 mm以內(難以測量)，其平均增長量以第45 d時的長度減去第15 d時的長度來計算.結果顯示除0.07 mg/L組的尾寬增長量與對照組差異顯著外，其余各項指標差異均極顯著(表4).

表4 鉛離子對蝌蚪尾長、尾寬和頭長的影響

表5 鉛離子對蝌蚪尾長、尾寬和頭長平均增長量的影響

注：*P<0.05差異顯著；**P<0.01差異極顯著(與對照組比較)

3 討論

3.1 Pb2+對黑斑蛙孵化期及開口期的毒性

從表1和表2可以看出：在胚胎發(fā)育的25個時期中，鉛離子在有效濃度下(大于30 mg/L)對孵化期及開口期的蝌蚪毒性影響較顯著，其余各期影響不明顯.各實驗組的死亡率都比對照組高，且隨鉛離子質量濃度的增大而升高.作者認為這是因為孵化后的胚胎失去了卵角質膜的保護，鉛離子更易進入胚胎，致使胚胎內鉛離子的沉積量增多，毒性增大，出現(xiàn)了死亡的第一個高峰期；隨著攝食活動的出現(xiàn)、呼吸活動的加強，使鉛離子進入胚胎體內的機會進一步增多，使胚胎內鉛離子的濃度增大，出現(xiàn)了死亡的第二個高峰期.其中第二個高峰期的死亡率略大于第一個高峰期，顯然與鉛離子隨著機體生命活動的加強而進入體內的量增多有關.

3.2 Pb2+對黑斑蛙蝌蚪期的毒性

從表2可以看出：黑斑蛙蝌蚪對鉛離子的耐受性較強，只有在30 mg/L濃度以上時，鉛離子對蝌蚪的死亡率才表現(xiàn)出明顯的影響.作者認為這是因為隨著蝌蚪的發(fā)育，蝌蚪各生理功能趨于完善和對污染環(huán)境的適應，表現(xiàn)出對逆境危害的調節(jié)能力增強.

蝌蚪畸形觀察結果顯示：0.07 mg/L質量濃度水平的畸形率最低(0.50%)；0.30 mg/L質量濃度水平的畸形率次之(2.00%)；1.00 mg/L質量濃度水平的畸形率最高(2.25%).這說明鉛離子隨著質量濃度的升高對蝌蚪致毒、致畸作用增強.

從黑斑蛙的尾長、尾寬及頭長的發(fā)育來看，各梯度濃度鉛離子對蝌蚪的生長發(fā)育均有抑制作用(與對照組相比差異顯著，P<0.05)；但染毒組之間差異并不顯著(P>0.05).說明當鉛離子質量濃度繼續(xù)升高時，由于鉛對鉛的拮抗作用，在一定質量濃度范圍內其毒性作用將不會有明顯差異.

總之，Pb2+對黑斑蛙的早期發(fā)育具有明顯的影響.這種影響主要表現(xiàn)為能使處于孵化期和開口期的胚胎致死(致死率隨濃度的升高而升高)以及影響蝌蚪的正常發(fā)育(發(fā)育緩慢及畸形).隨著我國化工業(yè)的迅猛發(fā)展，化工業(yè)廢料所造成的環(huán)境污染也愈來愈嚴重.某些廢料中含有大量的鉛離子，如果對這些廢料不加處理直接排入水中，將會對包括黑斑蛙在內的所有水生生物產(chǎn)生影響.這不僅不利于漁業(yè)發(fā)展，并且鉛離子通過生物鏈的級聯(lián)放大作用逐級傳遞并逐漸累計，最終將會對最高級消費者——人，產(chǎn)生致命的危害.因此各級政府及環(huán)保部門應加大檢查執(zhí)法力度，防止農(nóng)業(yè)用水中鉛離子濃度超標，在保護環(huán)境的同時也保護了我們自己.

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StudingonToxicityofPb2+toEarlyDevelopmentofRanaNigromaculata

DU Yi-fan1YAN Hua-chao2

(1.School of Basic Medicine,Capital Medical University, Beijing 100069，China; 2.School of Life Science,Liaocheng University, Liaocheng 252059，China)

Study on toxicity of Pb2+(at 10,20,30,40 and 50 mg/L) to embryos ofRananigromaculata. and Pb2+at 0.07,0.30,1.00 mg/L to larvae ofrananigromaculatafor show to their growth influence. The result showed that the toxicity of Pb2+is higher to embryos during hatching and mouth open stages, while it is lower to other stages. In addition, therananigromaculataembryonic period and the tadpole time survival rate is effected by Pb2+, the embryo and tadpole’s growth is inhibitory action obviously (P<0.01), but group difference not remarkable (P>0.05); Simultaneously the mass concentration at 30,40,50 mg/L causes the hatching period embryo to be abnormal, the unbalanced rate at 50 mg/L mass concentration level is highest (4.41%),at 40 mg/L is lower(3.33%), at 30 mg/L is lowest (2.39%). Various mass concentration water causes the tadpole forehead to soak the shape equally to expand, “S” the tail and the physique is small (for normal body long 0.50-0.67) and so on, the unbalanced rate at 1.00 mg/L is highest (2.25%),0.30 mg/L is lower (2.00%), 0.07 mg/L is lowest (0.50%). Finally, the cause of toxice effect of Pb2+to early development is analyzed in the paper.

Pb2+,Rananigromaculata, early development, embryos stages, larvae stages.

2017-05-28

國家自然科學基金項目(31272383)；聊城大學校計劃項目(318011504)資助

閆華超，E-mail:yanhuachao@lcu.edu.cn.

Q959.5; X503

A

1672-6634(2017)03-0041-06