杜一帆 閆華超

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069；2.聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252059)

Pb2+對黑斑蛙早期生長發(fā)育影響的研究①

杜一帆1閆華超2

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069；2.聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252059)

研究了Pb2+質(zhì)量濃度在10，20，30，40和50 mg/L時對黑斑蛙(Rananigromaculata)胚胎期及Pb2+質(zhì)量濃度在0.07，0.30，1.00 mg/L時對黑斑蛙蝌蚪期生長發(fā)育的影響.結(jié)果表明，Pb2+對胚胎期的毒性于孵化期和開口期表現(xiàn)顯著，其余各期毒性不如這兩期明顯. Pb2+能影響黑斑蛙胚胎期和蝌蚪期的生存率，對蝌蚪的生長發(fā)育具有明顯的抑制作用(P<0.01)，但組間差異均不顯著(P>0.05)；同時質(zhì)量濃度為30，40，50 mg/L時會導(dǎo)致孵化期胚胎畸形，致畸率50 mg/L質(zhì)量濃度水平最高(4.41%)，40 mg/L水平次之(3.33%)，30 mg/L水平最低(2.39%).各質(zhì)量濃度水平均導(dǎo)致蝌蚪頭部泡狀膨大、“S”型尾和形體較小(為正常體長的0.50-0.67)等，致畸率1.00 mg/L質(zhì)量濃度水平最高(2.25%)，0.30 mg/L水平次之(2.00%)，0.07 mg/L水平最低(0.50%).并對致毒原因進行了初步分析.

Pb2+，黑斑蛙，早期發(fā)育，胚胎期，蝌蚪期

目前中國由于在重金屬的開采、加工、冶煉過程中，造成一些重金屬如鉛、汞、鈷、鎘等進入大氣、水、土壤引起嚴重的環(huán)境污染.隨著廢水的排放，水域污染日益嚴重.其中鉛是最常見的重金屬之一，當鉛離子濃度超過國家規(guī)定的農(nóng)田水質(zhì)標準時，就會對水生生物產(chǎn)生一定的毒害作用[1,2]，進而對位于食物鏈上層的哺乳動物造成毒害[3,4].國內(nèi)外對重金屬致淡水魚類的毒害進行了大量研究[1-5]，而有關(guān)重金屬對兩棲類影響的報道不多[6,7]：李萬江[8]做了重金屬鉛、汞對花背蟾蜍蝌蚪毒性作用的初步研究；Lefcort[2]等研究了重金屬對青蛙生長發(fā)育的影響；蔡垚等[9]研究了重金屬鎘和鉛對黑斑蛙肝臟過氧化氫酶活性的影響；陽增[10]研究了 Hg2+、Pb2+對牛蛙坐骨神經(jīng)干動作電位閾值及傳導(dǎo)速度的影響；賈秀英[11-13]等研究了鎘、鉛對黑斑蛙臟器組織的亞慢性毒性效應(yīng)及對雄性黑斑蛙生殖毒性. 為此，本文選擇了聊城市區(qū)黑斑蛙的受精卵為研究對象，用染毒法研究了Pb2+對黑斑蛙胚胎期及蝌蚪期生長發(fā)育的影響，以此探討Pb2+影響兩棲類生長發(fā)育的機制，為進一步探討重金屬污染對水生動物的毒害機理積累科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試劑

Pb(Ac)2為國產(chǎn)分析純，取Pb(Ac)2用蒸餾水配成含Pb2+為100 mg/L的母液并滴入幾滴冰乙酸以防止鉛離子水解，再用蒸餾水連續(xù)稀釋至實驗濃度.

1.2 材料

實驗材料采自徒駭河聊城區(qū)段，于4月底至5月中旬取河水中未發(fā)育的黑斑蛙卵塊，放入清潔的容器內(nèi)帶回實驗室鏡檢，剔除未受精的卵，將受精卵養(yǎng)在大魚缸中.一部分直接供胚胎期毒性試驗用，另一部分待其孵化至蝌蚪期，供蝌蚪期的毒性試驗用.胚胎發(fā)育分期參照朱治平[14]的方法.

1.3 方法

1.3.1 Pb2+對胚胎期發(fā)育的影響.以國家農(nóng)田水質(zhì)標準[15]中的鉛離子濃度為最低濃度，依次設(shè)計5個濃度梯度，各濃度水平依次為10，20，30，40，50 mg/L.先預(yù)實驗，找出藥劑作用的大致濃度范圍(即出現(xiàn)死亡的濃度到全部死亡的最低濃度).然后分組實驗，每組取受精卵30粒，置于高為2 cm、直徑為12cm的培養(yǎng)皿中，分別放入上述各濃度梯度的溶液，設(shè)3個平行組，1個對照組，實驗在培養(yǎng)箱內(nèi)進行(水溫23℃-26℃).按胚胎發(fā)育的各個時期進行連續(xù)觀察，記錄畸形數(shù)和死亡數(shù)，死亡的胚胎予以剔除，并統(tǒng)計其平均值，最后計算出各期畸形率(各期畸形率=各期畸形尾數(shù)/實驗總尾數(shù)×100%)和各期死亡率(各期死亡率=各期死亡尾數(shù)/實驗總尾數(shù)×100%).結(jié)果采用t檢驗(P<0.05差異顯著，P<0.01差異極顯著).

1.3.2 Pb2+對蝌蚪期發(fā)育的影響

(1) Pb2+對蝌蚪24、48 h的半致死濃度獲得：先預(yù)試，找出24、48 h 半致死濃度范圍(29-31 mg/L).設(shè)置9個濃度梯度(質(zhì)量濃度水平依次為29.00，29.25，29.50，29.75，30.00，30.25，30.50，30.75 ，31.00 mg/L)設(shè)3個平行組.在高為9 cm、直徑為20 cm的玻璃水槽中，放入供試濃度的藥液500 mL.每個水槽中放入正常發(fā)育的蝌蚪30尾，試驗開始后分別于24、48 h，檢查其死亡率，統(tǒng)計并計算出LC50值.

(2) Pb2+對蝌蚪生長發(fā)育的影響：實驗設(shè)計鉛離子梯度濃度分別為0.07，0.30，1.00 mg/L的3個實驗組和1個對照組，實驗用水為蒸餾水，每個梯度濃度做2個平行，于每個水族玻璃缸中分別放入200尾進行觀察.記錄各缸畸形數(shù)和死亡數(shù)，統(tǒng)計畸形率.為保持培養(yǎng)液的清潔和濃度的穩(wěn)定，每3天換一次染毒水，每5天用毫米方格紙測量一次蝌蚪的尾長、尾寬和頭長，每缸每次隨機測量10尾蝌蚪，取其平均值.畸形率=[各時期畸形尾數(shù)總和/400(每缸總尾數(shù)200×2個平行)]×100%.結(jié)果采用t檢驗，P<0.05差異顯著，P<0.01差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb2+對黑斑蛙50%出膜時間及孵化率的影響

圖1 鉛離子濃渡對黑斑蛙受卵的孵化影響

在黑斑蛙受精卵的孵化過程中隨著Pb2+的濃度的增加，50%出膜時間明顯縮短(表1，圖1)，其原因估計是鉛離子增加了黑斑蛙受精卵角質(zhì)保護膜的通透性，從而使胚胎能從外界更快獲得氧氣而加快發(fā)育的速度，也可能是保護膜受損，使蝌蚪更容易出膜，所以表現(xiàn)為出膜時間縮短.從圖1上我們還可以看出，鉛離子達到一定濃度時，50%出膜時間從24.4 h迅速縮短為18.8 h，但隨著鉛離子濃度的梯度提高，50%出膜時間的趨近一固定值，這說明鉛離子對受精卵角質(zhì)膜的通透作用是有一個極限濃度的，當超過該濃度時，高出的濃度對50%出膜時間不再有明顯影響.

表1 鉛離子各濃度組50%出膜時間及孵化率

另外通過對實驗數(shù)據(jù)的分析還發(fā)現(xiàn)，鉛離子的濃度對孵化期的孵化率基本沒有影響，主要原因是在孵化期以前，蝌蚪的孵化完全靠卵黃儲備的營養(yǎng)，而鉛離子的滲透在短時間內(nèi)通過卵膜進入胚胎內(nèi)的量極小，對胚胎發(fā)育不會產(chǎn)生明顯影響(表1).

2.2 Pb2+對黑斑蛙胚胎發(fā)育的毒性影響

在胚胎發(fā)育的25個時期中，鉛離子在有效濃度下(30-50 mg/L)對孵化期及開口期毒性影響較為明顯，其余各期影響不顯著，原因可能是孵化后胚胎失去了卵角質(zhì)膜的保護，鉛離子更易進入，致使胚胎內(nèi)鉛離子的沉積量增大，毒性增大，從而出現(xiàn)了死亡的第一個高峰期；又由于蝌蚪攝食活動的出現(xiàn)、呼吸活動的加強，使鉛離子進入胚胎體內(nèi)的機會進一步增多，使胚胎內(nèi)鉛離子的濃度增大，出現(xiàn)了死亡的第二個高峰期.其中第二個高峰期的死亡率略大于第一個高峰期，顯然與鉛離子隨著機體生命活動的加強而進入體內(nèi)的量增多有關(guān).

黑斑蛙在自然環(huán)境中，畸形個體極少被發(fā)現(xiàn)，因而有關(guān)畸形現(xiàn)象的報道和研究資料也很少.除極少數(shù)未受精卵外，黑斑蛙胚胎都能發(fā)育到出水孔完成期.按國家農(nóng)田水質(zhì)標準，鉛離子對黑斑蛙胚胎的毒性影響不明著.隨著鉛離子濃度的增大，死亡率逐漸升高.由實驗所測得的鉛離子有效作用濃度范圍(表2)可知，鉛離子對黑斑蛙胚胎的影響在高濃度下較顯著.

表2 鉛離子對黑斑蛙胚胎發(fā)育的影響

注：*P>0.05 差異不顯著；**P<0.05 差異顯著；***P<0.01 差異極顯著(與對照組比較)

圖2 鉛離子濃度對黑斑蛙胚胎的影響

黑斑蛙孵化期的鉛離子致毒畸形主要表現(xiàn)為腹部膨大(見圖3、4)和泡狀炎癥(見圖5、6)，主要原因可能是鉛離子進入黑斑蛙胚胎內(nèi)后影響了它們的正常生理活動從而導(dǎo)致內(nèi)臟器官發(fā)炎，雖能存活一段時間，但其發(fā)育停滯于肌效期，最后腹部破裂死亡.開口期的致毒畸形主要表現(xiàn)為尾部側(cè)彎及上翹(見圖7、8)，分析原因可能是鉛離子對黑斑蛙胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒害作用所致，但胚體能繼續(xù)發(fā)育.可見鉛離子對胚胎的畸形發(fā)生有一定的影響.

圖3 畸形的蝌蚪(腹部膨大)與正常蝌蚪比較 圖4 腹部膨大破裂的蝌蚪

圖5 頭部出現(xiàn)泡狀炎癥的蝌蚪 圖6 腹部出現(xiàn)泡狀炎癥的蝌蚪

圖7 尾部側(cè)彎的蝌蚪 圖8 尾部彎曲上翹的蝌蚪

2.3 Pb2+對蝌蚪期發(fā)育的影響

表3鉛離子對蝌蚪24、48 h的半致死濃度

平均體長/cm平均體重/gLC50/mg/L24h48h10．550．01330．4530．18

2.3.1 Pb2+對蝌蚪24、48 h的半致死濃度.根據(jù)3個平行組中蝌蚪的死亡率，統(tǒng)計得出24、48 h 的LC50值(表3).通過分析LC50數(shù)據(jù)可以得出這樣的結(jié)論：蝌蚪對鉛離子的耐受性較強，只有在較高濃度下(30 mg/L)，鉛離子對蝌蚪的死亡率才有明顯的影響.

2.3.2 Pb2+對蝌蚪生長發(fā)育的影響

(1) 蝌蚪致畸現(xiàn)象的觀察：黑斑蛙蝌蚪鉛離子染毒畸形主要表現(xiàn)為頭部和腹部出現(xiàn)泡狀炎癥，呈膨大透明狀，在0.07，0.30和1.00 mg/L濃度水平畸形率分別為0.25%，0.75%和0.25%；個體生長緩慢(不及正常個體大小的60%)，尾巴呈“S”型的在0.07，0.30和1.00 mg/L濃度水平畸形率分別為0.25%，1.25%和2.00%.結(jié)果顯示：1.00 mg/L質(zhì)量濃度水平的畸形率最高，為2.25%；0.30 mg/L質(zhì)量濃度水平次之，為2.00%；0.07 mg/L質(zhì)量濃度水平最低，為0.50%.

(2) 鉛離子對蝌蚪尾長、尾寬和頭長的影響：分別于第5、15、25、35和45 d時，每缸中各測量8尾黑斑蛙蝌蚪，測量指標有尾長、尾寬和頭長，取其平均值(表3).由于5 d前各濃度梯度組蝌蚪尾長和頭長相差很小，故各濃度組的平均增長量以45 d時的長度減去第5 d時的長度來計算；而尾寬在第5 d時都在1 mm以內(nèi)(難以測量)，其平均增長量以第45 d時的長度減去第15 d時的長度來計算.結(jié)果顯示除0.07 mg/L組的尾寬增長量與對照組差異顯著外，其余各項指標差異均極顯著(表4).

表4 鉛離子對蝌蚪尾長、尾寬和頭長的影響

表5 鉛離子對蝌蚪尾長、尾寬和頭長平均增長量的影響

注：*P<0.05差異顯著；**P<0.01差異極顯著(與對照組比較)

3 討論

3.1 Pb2+對黑斑蛙孵化期及開口期的毒性

從表1和表2可以看出：在胚胎發(fā)育的25個時期中，鉛離子在有效濃度下(大于30 mg/L)對孵化期及開口期的蝌蚪毒性影響較顯著，其余各期影響不明顯.各實驗組的死亡率都比對照組高，且隨鉛離子質(zhì)量濃度的增大而升高.作者認為這是因為孵化后的胚胎失去了卵角質(zhì)膜的保護，鉛離子更易進入胚胎，致使胚胎內(nèi)鉛離子的沉積量增多，毒性增大，出現(xiàn)了死亡的第一個高峰期；隨著攝食活動的出現(xiàn)、呼吸活動的加強，使鉛離子進入胚胎體內(nèi)的機會進一步增多，使胚胎內(nèi)鉛離子的濃度增大，出現(xiàn)了死亡的第二個高峰期.其中第二個高峰期的死亡率略大于第一個高峰期，顯然與鉛離子隨著機體生命活動的加強而進入體內(nèi)的量增多有關(guān).

3.2 Pb2+對黑斑蛙蝌蚪期的毒性

從表2可以看出：黑斑蛙蝌蚪對鉛離子的耐受性較強，只有在30 mg/L濃度以上時，鉛離子對蝌蚪的死亡率才表現(xiàn)出明顯的影響.作者認為這是因為隨著蝌蚪的發(fā)育，蝌蚪各生理功能趨于完善和對污染環(huán)境的適應(yīng)，表現(xiàn)出對逆境危害的調(diào)節(jié)能力增強.

蝌蚪畸形觀察結(jié)果顯示：0.07 mg/L質(zhì)量濃度水平的畸形率最低(0.50%)；0.30 mg/L質(zhì)量濃度水平的畸形率次之(2.00%)；1.00 mg/L質(zhì)量濃度水平的畸形率最高(2.25%).這說明鉛離子隨著質(zhì)量濃度的升高對蝌蚪致毒、致畸作用增強.

從黑斑蛙的尾長、尾寬及頭長的發(fā)育來看，各梯度濃度鉛離子對蝌蚪的生長發(fā)育均有抑制作用(與對照組相比差異顯著，P<0.05)；但染毒組之間差異并不顯著(P>0.05).說明當鉛離子質(zhì)量濃度繼續(xù)升高時，由于鉛對鉛的拮抗作用，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)其毒性作用將不會有明顯差異.

總之，Pb2+對黑斑蛙的早期發(fā)育具有明顯的影響.這種影響主要表現(xiàn)為能使處于孵化期和開口期的胚胎致死(致死率隨濃度的升高而升高)以及影響蝌蚪的正常發(fā)育(發(fā)育緩慢及畸形).隨著我國化工業(yè)的迅猛發(fā)展，化工業(yè)廢料所造成的環(huán)境污染也愈來愈嚴重.某些廢料中含有大量的鉛離子，如果對這些廢料不加處理直接排入水中，將會對包括黑斑蛙在內(nèi)的所有水生生物產(chǎn)生影響.這不僅不利于漁業(yè)發(fā)展，并且鉛離子通過生物鏈的級聯(lián)放大作用逐級傳遞并逐漸累計，最終將會對最高級消費者——人，產(chǎn)生致命的危害.因此各級政府及環(huán)保部門應(yīng)加大檢查執(zhí)法力度，防止農(nóng)業(yè)用水中鉛離子濃度超標，在保護環(huán)境的同時也保護了我們自己.

[1] 羅其勇，閆玉蓮，李健，等.水體中鉛暴露對南方鲇silurusmeridionalis胚胎發(fā)育和仔魚存活的影響[J]. 西南師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2015,40(5):67-74.

[2] Lefcort H,Meguire R A,Wilson L H,et al.Heavy metals alter the survival, growth, metamorphosis, and antipredatory behavior of columbia spotted frog(ranaluteiventris)tadpoLes[J].Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 1998, 35: 447-456.

[3] 高晶.膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白在生長發(fā)育期鉛暴露致仔鼠鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)的實驗研究[D].唐山：華北理工大學(xué),2015.

[4] 蘇鵬，張建彬，徐焰，等.孕期鉛暴露對生長發(fā)育期大鼠腎功能及Claudin-2的影響[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2014, 2:18-22.

[5] 劉紅陽，茆廣華，許海，等.鉛和鄰苯二甲酸二丁酯聯(lián)合暴露對斑馬魚胚胎的影響[J].生物技術(shù)進展,2016,4:249-254.

[6] 閆華超，劉小強，陳美娟，等. Zn2+對黑斑蛙早期發(fā)育的影響[J].聊城大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，20(1)：45-48.

[7] 黃德軍,張迎梅,趙東芹，等.重金屬鎘對花背蟾蜍蝌蚪生長發(fā)育的影響[J].蘭州大學(xué)學(xué)報，2004，2：81-83.

[8] 李萬江.重金屬鉛、汞對花背蟾蜍蝌蚪毒性作用的初步研究[D].蘭州：西北師范大學(xué)，2015.

[9] 蔡垚. 重金屬鎘和鉛對黑斑蛙肝臟過氧化氫酶活性的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,48(12):3 103-3 104，3 112.

[10] 陽增. Hg2+、Pb2+對牛蛙坐骨神經(jīng)干動作電位閾值及傳導(dǎo)速度的影響[J]. 養(yǎng)生保健指南, 2017,9: 1 218-1 212.

[11] 汪學(xué)英，盧祥云，李春梅，等. 重金屬離子對黑斑蛙胚胎及蝌蚪的毒性影響[J].四川動物，2001,3：59-61.

[12] 汪美貞，賈秀英.低劑量長期鉛暴露對雄性黑斑蛙精巢組織關(guān)鍵酶活性的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2012, 32(3):751-756.

[13] 賈秀英,汪美貞.亞急性鎘暴露對雄性黑斑蛙生殖毒性的研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2007,27(9):1 512-1 516.

[14] 朱治平，施履吉.黑斑蛙(rajanigromaculata)正常發(fā)育表[J].解剖學(xué)報，1957, 2:59-64.

[15] 吳旦定，劉秀英.環(huán)境監(jiān)測[M].北京：高等教育出版社，1987.

StudingonToxicityofPb2+toEarlyDevelopmentofRanaNigromaculata

DU Yi-fan1YAN Hua-chao2

(1.School of Basic Medicine,Capital Medical University, Beijing 100069，China; 2.School of Life Science,Liaocheng University, Liaocheng 252059，China)

Study on toxicity of Pb2+(at 10,20,30,40 and 50 mg/L) to embryos ofRananigromaculata. and Pb2+at 0.07,0.30,1.00 mg/L to larvae ofrananigromaculatafor show to their growth influence. The result showed that the toxicity of Pb2+is higher to embryos during hatching and mouth open stages, while it is lower to other stages. In addition, therananigromaculataembryonic period and the tadpole time survival rate is effected by Pb2+, the embryo and tadpole’s growth is inhibitory action obviously (P<0.01), but group difference not remarkable (P>0.05); Simultaneously the mass concentration at 30,40,50 mg/L causes the hatching period embryo to be abnormal, the unbalanced rate at 50 mg/L mass concentration level is highest (4.41%),at 40 mg/L is lower(3.33%), at 30 mg/L is lowest (2.39%). Various mass concentration water causes the tadpole forehead to soak the shape equally to expand, “S” the tail and the physique is small (for normal body long 0.50-0.67) and so on, the unbalanced rate at 1.00 mg/L is highest (2.25%),0.30 mg/L is lower (2.00%), 0.07 mg/L is lowest (0.50%). Finally, the cause of toxice effect of Pb2+to early development is analyzed in the paper.

Pb2+,Rananigromaculata, early development, embryos stages, larvae stages.

2017-05-28

國家自然科學(xué)基金項目(31272383)；聊城大學(xué)校計劃項目(318011504)資助

閆華超，E-mail:yanhuachao@lcu.edu.cn.

Q959.5; X503

A

1672-6634(2017)03-0041-06