宋 凌， 周 強(qiáng)， 李 娜， 余 潔， 李 陽， 張 翅

(1商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 河南 商丘 476100； 2鄭州市兒童醫(yī)院， 河南 鄭州 450052)

沉默Smo基因?qū)θ藢m頸癌HeLa細(xì)胞活力及凋亡的影響*

宋 凌1△， 周 強(qiáng)2， 李 娜1， 余 潔1， 李 陽1， 張 翅1

(1商丘醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校， 河南 商丘 476100；2鄭州市兒童醫(yī)院， 河南 鄭州 450052)

目的使用RNA干擾技術(shù)沉默Smoothened(Smo)基因，探討其對宮頸癌HeLa細(xì)胞活力和凋亡的影響。方法采用SmoshRNA轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞；采用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測各組HeLa細(xì)胞Smo和轉(zhuǎn)錄因子Gli1的mRNA和蛋白表達(dá)；采用MTT比色法測定沉默Smo后細(xì)胞生長的情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測SmoshRNA對細(xì)胞周期和凋亡的影響。結(jié)果與對照組比較，SmoshRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后，Smo和Gli1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。Smo基因沉默后，HeLa細(xì)胞的活力明顯降低，細(xì)胞明顯阻滯于G0/G1期，細(xì)胞凋亡率顯著升高。結(jié)論沉默Smo基因可有效抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長，并誘導(dǎo)其凋亡。

Smo基因； 宮頸癌； RNA干擾； 細(xì)胞凋亡

在世界范圍內(nèi)，宮頸癌是婦女第二常見的惡性腫瘤，也是婦女發(fā)病和死亡的主要原因之一[1]。診斷為IIB期～I(xiàn)VA期宮頸癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是基于順鉑的化療和放療， 然而，5年生存率只有66%[2]。目前對復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性疾病患者的治療方法仍有限，這些宮頸癌患者總生存期<12個月[3-5]。迄今為止，生物治療雖能夠有限地提高患者的生存率[6-7]，但是仍然需要尋找潛在的新靶點(diǎn)和新的治療策略。

Hedgehog (Hh)是高度保守的信號通路。它在人的胚胎發(fā)育、器官形成、組織分化以及組織修復(fù)中起重要作用。Smoothened(Smo)蛋白是Hh信號通路上的膜蛋白，也是Hh信號通路的轉(zhuǎn)化分子，它可以將細(xì)胞外的Sonic hedgehog(Shh)信號轉(zhuǎn)化成細(xì)胞內(nèi)的Gli信號，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號，激活轉(zhuǎn)錄因子Gli1，并能激活Shh信號通路[8-9]。當(dāng)Smo基因過表達(dá)時，可異常激活Hedgehog通路，產(chǎn)生大量促癌因子[10]，使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化和惡變。許多研究發(fā)現(xiàn)，由Smo介導(dǎo)的Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常激活，與許多惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，例如黑素瘤、胰腺癌、胃癌、 前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌和宮頸癌等[11]。本研究旨在利用SmoshRNA轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞，進(jìn)一步探討Smo基因?qū)m頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為宮頸癌基因治療提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

HeLa細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection， ATCC)；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000及TRIzol試劑盒購自Invitrogen；抗Smo、β-actin及Gli1 抗體購自Santa Cruz。陰性對照質(zhì)粒(pRS-scrambled)和Smo干擾質(zhì)粒(pRS-shSmo)購自O(shè)riGene；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Invitrogen；MTT細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自江蘇碧云天公司。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將HeLa細(xì)胞于RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，每2～3 d進(jìn)行細(xì)胞換液，培養(yǎng)3～4 d后用胰酶消化，傳代培養(yǎng)。

2.2轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 將質(zhì)粒pRS-scrambled和pRS-shSmo分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine 2000操作說明書進(jìn)行。在6孔板中每孔加入3×108個細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待次日細(xì)胞融合度達(dá)到50%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體步驟如下：加入50 μL dH2O至含有表達(dá)質(zhì)粒的試管中，渦旋試管混勻質(zhì)粒，溶液濃度為100 mg/L。得到2組細(xì)胞：(1) 陰性對照(scrambled)組：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pRS-scrambled的HeLa細(xì)胞；(2) 實(shí)驗(yàn)(shSmo)組：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pRS-shSmo的HeLa細(xì)胞；空白對照(blank control)組由等量培養(yǎng)基替代。

2.3MTT法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)期生長的細(xì)胞，每孔種(3～6)×103個細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置空白對照孔。分別轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h。隨后加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min 溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀檢測492 nm波長吸光度(A)值。每組設(shè) 5 個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。計(jì)算細(xì)胞生長抑制率：細(xì)胞生長抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對照組)×100%。

2.4RT-PCR檢測細(xì)胞中Smo和Gil1的mRNA表達(dá) 收集經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h的細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說明書合成cDNA，用cDNA為模板進(jìn)行PCR。Smo上游引物序列為5’-CGCTACCCTGCTGTTATTCTCT-3’，下游序列引物為5’-CAGGTGGAAGTAGGAGGTCTTG-3’，產(chǎn)物大小為306 bp；Gli1上游引物序列為5’-TTGGAGAAGCCGAGCCGAGTATC-3’, 下游序列引物為5’-GAGTACAGAGGTTGGGAGGTAAGG-3’，產(chǎn)物大小為201 bp[12]；GAPDH上游引物序列為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’， 下游序列引物為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’， 產(chǎn)物大小為226 bp。擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性30 s； 95 ℃變性30 s， 63 ℃退火45 s， 72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)； 72 ℃終止延伸5 min。 將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳。采用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。運(yùn)用ImageJ軟件測定各條帶灰度值。

2.5細(xì)胞中Smo和Gli1蛋白的Western blot法檢測 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h后，裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA法定量，進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。封閉液封閉1 h，加入稀釋過的 I 抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜 3 次，加入稀釋過的 II 抗，室溫下孵育 1 h，TBST洗膜 3 次，加入ECL 進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，壓片、顯影、定影，觀察蛋白印跡。運(yùn)用ImageJ軟件測定各條帶灰度值。

2.6細(xì)胞凋亡檢測 收集shSmo轉(zhuǎn)染 72 h 組、scrambled組和未轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞。PBS洗滌3遍，用100 μL預(yù)冷的Binding Baffer重懸細(xì)胞，加入5 μL FITC 標(biāo)記的Annexin V 和 5 μL PI 混勻避光孵育15 min，再加入400 μL 緩沖液混勻，上流式細(xì)胞儀檢測。

2.7細(xì)胞周期檢測 收集shSmo轉(zhuǎn)染 72 h 組、scrambled組、未轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞。PBS洗滌3遍，加入1 mL 70%的冰乙醇，4 ℃孵育過夜，離心去除乙醇，PBS洗滌2遍，加入1 mL PI (50 mg/L)溶液，4 ℃避光30 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組平均數(shù)之間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1SmoshRNA抑制HeLa細(xì)胞的活力

MTT法觀察HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48和72 h后的細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞生長緩慢。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞抑制率明顯高于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)；陰性對照組和空白對照組細(xì)胞抑制率無明顯差異，SmoshRNA可有效地抑制HeLa細(xì)胞的活力，轉(zhuǎn)染72 h的抑制效果最顯著，各組細(xì)胞生長抑制率見圖1。

Figure 1. The effect ofSmogene silencing on the cell activity of human cervical cancer HeLa cells detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshSmo group.

圖1MTT法檢測沉默Smo基因?qū)eLa細(xì)胞活力的影響

2Smo和Gli1在HeLa細(xì)胞中的mRNA水平

在HeLa細(xì)胞中檢測沉默Smo基因后Smo 和Gli1的mRNA表達(dá)情況。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48 h和72 h后細(xì)胞Smo和Gli1的mRNA水平低于陰性對照組及空白對照組(P<0.05)，見圖2。

3Smo和Gli1蛋白在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h和72 h后細(xì)胞Smo和Gli1蛋白的表達(dá)水平較空白對照組和陰性對照組明顯降低(P<0.05)，見圖3。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。

Figure 2. The mRNA expression of Smo and Gli1 in human cervical cancer HeLa cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsscrambled group.

圖2轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后Smo和Gli1的mRNA表達(dá)

Figure 3. The protein expression of Smo and Gli1 in human cervical cancer HeLa cells after transfection was analyzed by Western blot. Each lane contains 30 μg protein extract from the cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsscrambled group.

圖3轉(zhuǎn)染后HeLa細(xì)胞Smo和Gli1蛋白的表達(dá)

4沉默Smo基因?qū)eLa細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染72 h后shSmo組的G0/G1期細(xì)胞比例顯著高于scrambled組(P<0.05),S期和G2/M期的細(xì)胞比例，均顯著低于scrambled組(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The effect ofSmogene silencing on cell cycle of HeLa cells analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsscrambled group.

圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默Smo基因?qū)eLa細(xì)胞周期的影響

5沉默Smo基因?qū)eLa細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染SmoshRNA 72 h 后凋亡率為20.31%，顯著高于scrambled組(P<0.01)。證實(shí)轉(zhuǎn)染SmoshRNA 72 h可以促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡，見圖5。

Figure 5. The effect ofSmogene silencing on the apoptosis of HeLa cells analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsscrambled group.

圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默Smo基因?qū)eLa細(xì)胞凋亡的影響

討 論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素作用、多基因參與和多階段調(diào)控的過程，同時也是細(xì)胞增殖分化與細(xì)胞凋亡平衡失調(diào)的過程。癌基因的激活或者抑癌基因的失活以及其它相關(guān)調(diào)節(jié)基因的突變均在蛋白水平上起作用。Hedgehog信號通路是人類胚胎發(fā)育過程中調(diào)控細(xì)胞增殖和組織分化的重要信號通路，近來研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號通路在腫瘤的發(fā)生過程中同樣發(fā)揮著重要作用[13]。Smo蛋白是由1 024個氨基酸組成，起著G蛋白偶聯(lián)受體的作用[14]。Smo蛋白具有1個細(xì)胞內(nèi)羧基末端結(jié)構(gòu)域、1個細(xì)胞外氨基末端結(jié)構(gòu)域和7個疏水跨膜結(jié)構(gòu)域[15-16]。當(dāng)沒有Hh蛋白時，受體蛋白Ptch抑制Smo蛋白的活性，從而阻斷Hh信號通路；當(dāng)有Hh蛋白時，Hh與Ptch蛋白結(jié)合，除去Smo蛋白的抑制，甚至激活的Smo蛋白可以將細(xì)胞外Hh信號轉(zhuǎn)化成細(xì)胞內(nèi)Gli信號，然后激活Hh相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括Hhip、Ptch、Gli1、cyclin D、Myc、Bmi1、Bcl-2和VEGF等[17]。 Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑近年來在惡性腫瘤的基因治療研究中得到關(guān)注。相關(guān)研究結(jié)果表明，采用siRNA抑制胃癌MGC803細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞、肝癌Huh-7細(xì)胞和胰腺癌PANC-1細(xì)胞的Smo和Gli1表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18-19]，并提高細(xì)胞對化療藥物的敏感性，因此Smo可能是腫瘤基因治療的有效靶點(diǎn)[20-21]。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)SmoshRNA作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞可降低其下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1的蛋白和mRNA表達(dá)水平。SmoshRNA可有效抑制HeLa細(xì)胞的活力并誘導(dǎo)其凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在Sonic hedgehog信號通路中，Smo蛋白作為激動因子激活Gli1蛋白，Gli1蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子啟動下游相關(guān)基因，共同促進(jìn)該通路的活化。通過對這2種蛋白相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn)Smo蛋白和Gli1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，推測癌癥發(fā)生過程中的Sonic hedgehog信號通路異常激活可能是通過Smo蛋白高表達(dá)上調(diào)下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1蛋白的表達(dá)參與癌癥發(fā)生的[16]。目前關(guān)于在宮頸癌中Smo蛋白和Gli1蛋白表達(dá)之間是否存在調(diào)節(jié)機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，因此我們在研究Smo的同時檢測了Gli1蛋白在宮頸癌HeLa細(xì)胞中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，運(yùn)用Smo特異性shRNA轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞能有效降低Smo的表達(dá)，同時Gli1的表達(dá)也隨之降低，提示Smo可能通過Sonic hedgehog信號通路調(diào)控Gli1的表達(dá)。Smo在宮頸癌細(xì)胞的生長和凋亡中起重要作用，檢測Smo和Gli1蛋白表達(dá)可能為臨床診斷和治療宮頸癌提供參考依據(jù)。目前針對Hh信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究還很局限，下一步我們將將針對Hh在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的功能以及與其它信號通路如Notch、WNT和TGF-β等的聯(lián)系方面做進(jìn)一步研究[22]。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effects of Smo gene silencing on cell activity and apoptosis of human cervical carcinoma HeLa cells

SONG Ling1, ZHOU Qiang2, LI Na1, YU Jie1, LI Yang1， ZHANG Chi1

(1ShangqiuMedicalCollege,Shangqiu476100,China;2ZhengzhouChildren’sHospital,Zhengzhou450052,China.E-mail: 13937095548@163.com)

AIM: To investigate the effect of Hedgehog (Hh) signaling pathway on the viability and apoptosis of cervical carcinoma cells by shRNA technique to knock downSmoothened(Smo) gene.METHODSSmoshRNA was used to transfect the cervical carcinoma HeLa cells. The expression of Smo and Gli1 at mRNA and protein levels in the HeLa cells was determined by RT-PCR and Western blot， respectively. The effect ofSmogene silencing on the growth of the cells was measured by MTT assay. The apoptosis and cell cycle were determined by flow cytometry.RESULTSCompared with control group, the mRNA and protein expression of Smo and Gli1 were evenly reduced obviously after transfected withSmoshRNA for 72 h (P<0.05). The viability of HeLa cells transfected withSmoshRNA was significantly inhibited. The percentages of the cells in G0/G1phase and early apoptosis rate were obviously higher inSmoshRNA transfection group than those in control group.CONCLUSIONSmogene silencing effectively inhibits the cell growth and induces the apoptosis of human cervical carcinoma cells.

Smogene; Cervical carcinoma; RNA interference; Apoptosis

1000- 4718(2017)11- 2015- 05

2017- 05- 02

2017- 07- 17

商丘市科技發(fā)展計(jì)劃(No. 143008)

△通訊作者 Tel: 0370-3251978; E-mail: 13937095548@163.com

R737.9； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.015