郝瑞敏， 謝書陽， 韓婉虹， 閻云飛， 孫允霄， 岳 真， 馬 穎， 李有杰

(濱州醫(yī)學院山東省高校腫瘤分子生物學重點實驗室， 生物化學與分子生物學教研室, 山東 煙臺 264003)

千金藤素通過調節(jié)miR-150和miR-182促進A549細胞凋亡*

郝瑞敏， 謝書陽， 韓婉虹， 閻云飛， 孫允霄， 岳 真， 馬 穎， 李有杰△

(濱州醫(yī)學院山東省高校腫瘤分子生物學重點實驗室， 生物化學與分子生物學教研室, 山東 煙臺 264003)

目的探討千金藤素對人肺癌A549細胞生長的影響及可能機制。方法千金藤素處理A549細胞后，采用MTT法檢測細胞生長抑制率；倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化；流式細胞術檢測細胞凋亡；real-time PCR檢測微小RNA(miR)-150、miR-182、p53 mRNA和FOXO1 mRNA的表達變化；通過軟件預測miR-150和miR-182的下游靶基因；采用Western blot法分析細胞中p53和FOXO1蛋白表達的變化。結果在千金藤素作用下，A549細胞生長受到抑制，凋亡率明顯增加；千金藤素作用后，細胞內miR-150和miR-182的表達水平顯著下降；在10 μmol/L的千金藤素作用后，細胞內p53和FOXO1的表達水平升高，而在30 μmol/L時，細胞內p53和FOXO1的表達水平降低；在細胞內轉染miR-150后，p53表達明顯減少，而轉染miR-182后，FOXO1表達顯著降低。結論千金藤素能夠抑制A549細胞生長，促進A549細胞凋亡，可能是通過抑制miR-150和miR-182表達發(fā)揮作用；而miR-150和miR-182可能分別通過下調p53和FOXO1的表達發(fā)揮作用。

千金藤素； 微小RNA-150； 微小RNA-182； p53； FOXO1

千金藤素(cepharanthine，CEP)是從千金藤屬植物千金藤、地不容和白藥子中提取出的一種雙芐基異喹啉類生物堿。千金藤素通過刺激動物網狀內皮系統、活化造血組織和促進骨髓組織增生，起到促進白細胞升高的作用，在臨床上主要用于治療矽肺和癌癥患者化療后白細胞減少[1]。也有研究結果表明，千金藤素可以通過衰減炎癥、脂質過氧化和細胞遷移和增殖，發(fā)揮有效的抗動脈粥樣硬化作用[2]。此外，還可通過克服P糖蛋白介導的藥物外排，逆轉惡性腫瘤細胞的抗藥性，從而提高治療效果[3]。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類短小的非編碼小RNA，長約18～25個堿基[4]。它可以通過與相應mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region，3′UTR)完全或不完全結合，導致mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯，起到轉錄后調控基因表達的作用。真核生物內源性的miRNA是高度保守的，對細胞增殖、分化和凋亡等基本生命活動的過程具有重要調控作用[5]。一種miRNA可以調控多個基因的表達，而多個miRNA也可以調控同一個基因的表達[6]。本研究觀察千金藤素對肺癌A549細胞的生長影響，通過檢測細胞內miRNA的表達情況，探討千金藤素能否通過調節(jié)miRNA的表達，進一步影響肺癌細胞生長。

材 料 和 方 法

1材料

千金藤素、胰蛋白酶、MTT和DMSO購自Sigma；肺癌細胞株A549購自中科院上海細胞生物學研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；Lipofectamine 2000購自Invitrogen；miRNA提取試劑盒和real-time PCR試劑購自TaKaRa；Annexin V-FITC/PI 購自南京凱基生物公司；反轉錄試劑盒購自Fermentas；兔抗人單克隆抗體購自BioWorld；羊抗兔IgG購自北京中杉金橋公司；miR-150和miR-182 mimics由上海吉瑪公司合成；其它試劑為國產分析純。

2主要方法

2.1細胞培養(yǎng) 將凍存的A549細胞復蘇后，接種于培養(yǎng)瓶中，加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，2 d傳代 1 次，取對數生長期細胞進行實驗。

2.2MTT法檢測細胞活力 將生長狀況良好處于對數生長期的A549細胞接種到96孔板中，每孔接種5.0×103個細胞，加入100 μL培養(yǎng)液，周圍孔用無菌PBS填充。培養(yǎng)24 h后用不同濃度(10、20和30 μmol/L)的千金藤素處理細胞。藥物作用24 h后，用含0.5% MTT的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL DMSO，置酶標儀中振蕩5 min，使結晶物充分溶解，于570 nm波長處測量各孔吸光度(A)值，按照下述公式計算細胞活力抑制率：細胞活力抑制率(%)=(A對照組-A實驗組)/A對照組。

2.3倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài) 用不同濃度(10、20和30 μmol/L)千金藤素作用細胞24 h后，使用倒置顯微鏡觀察A549細胞的形態(tài)變化。

2.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 將生長狀況良好處于對數生長期的A549細胞接種到6孔板中，每孔接種2.0×105細胞，加入2 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后用0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和30 μmol/L的千金藤素處理細胞，藥物作用24 h后，收集細胞。用不含EDTA的胰酶消化6孔板細胞，1 500 r/min離心5 min，用無菌PBS洗滌2次，1 500 r/min離心5 min。加入400 μL 1×Binding Buffer重懸細胞；加入4 μL AnnexinⅤ-FITC混勻后，再加入4 μL propidium iodide混勻。室溫下避光反應5～15 min。1 h內上機檢測細胞凋亡情況。

2.5Real-time PCR檢測細胞內miR-150和miR-182的表達 收集細胞，應用miRNA提取試劑盒提取miRNA；通過瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的miRNA的純度，加尾并反轉錄得到cDNA，反轉錄引物為5’-AACATGTACAGTCCATGGATGT30- 3’；通過real-time PCR檢測細胞內miR-150和miR-182的表達水平。miR-150的上游引物為5’-TCCCAACCCTTATACCAGT-3’；miR-182的上游引物為5’-GGCAATGGTAGAACTCACACT-3’； 人 5S rRNA 的上游引物為5’-GCCATACCACCCTGAACG-3’；共同下游引物為5’-AACATGTACAGTCCATGGATG-3’。PCR 的擴增條件為 94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，各擴增40個循環(huán)，在每個循環(huán)的 72 ℃時測定熒光量。

2.6Real-time PCR檢測細胞內p53和FOXO1的表達 收集細胞，提取總RNA；通過瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA的純度，反轉錄得到cDNA；通過實時定量PCR檢測細胞內p53和FOXO1的表達水平，引物及擴增長度見表1。

表1 引物序列

2.7miR-150和miR-182轉染A549細胞 將生長狀況良好處于對數生長期的A549細胞接種到6孔板中，用Lipofectamine 2000轉染miR-150、miR-182和negative control mimics入細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.8Western blot檢測細胞內p53和FOXO1蛋白的表達 轉染miR-150、miR-182和negative control mimics 24 h后收集細胞，加入適量裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解20～30 min，12 000 r/min離心10 min。吸上清液于新的EP管中，加入5×SDS上樣緩沖液，90 ℃煮10 min；電泳結束后，用轉膜儀將蛋白轉至PVDF膜；用5%的奶粉將膜封閉2 h；洗膜后加 I 抗，4 ℃過夜；洗膜，加 II 抗，4 ℃ 2 h；加化學發(fā)光反應混合液，反應后進行曝光。

3統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件進行結果分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1光鏡下觀察A549細胞的形態(tài)學變化

光鏡下觀察發(fā)現，不同濃度千金藤素作用于A549細胞24 h后，隨著藥物濃度的升高，細胞體積變小，數目減少，細胞皺縮變圓，貼壁不牢，死細胞增多，見圖1。

Figure 1. The morphology of A549 cells treated with different concentrations of CEP under inverted microscope (×100).

圖1倒置顯微鏡下觀察A549細胞的形態(tài)

2千金藤素可使A549細胞活力抑制率升高

不同濃度千金藤素作用于A549細胞24 h后，細胞生長受到抑制(P<0.01)，并且隨藥物濃度的升高，抑制作用更明顯，見圖2。

3千金藤素可使A549細胞凋亡率增高

千金藤素作用于A549細胞24 h后，隨著藥物濃度的升高，胞凋亡率升高。表明千金藤素可以誘導A549細胞凋亡，見圖3。

4千金藤素可下調A549細胞內miR-150和miR-182的表達

在千金藤素作用后，與對照組相比，細胞內miR-150和miR-182的表達水平均顯著下降(P<0.01)。這一結果提示miR-150和miR-182這2種miRNA均具有癌基因的功能，千金藤素使A549細胞凋亡增多可能是通過降低miR-150和miR-182的表達而發(fā)揮作用的，見圖4。

Figure 2. The effect of CEP on A549 cell growth detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖2MTT法檢測千金藤素對A549細胞活力的影響

Figure 3. The effect of CEP on the apoptotic rate of A549 cells detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖3流式細胞術檢測千金藤素對A549細胞凋亡率的影響

Figure 4. The effect of CEP on the expression of miR-150 and miR-182 in the A549 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖4千金藤素對A549細胞中miR-150和miR-182表達的影響

5低濃度千金藤素上調A549細胞內p53和FOXO1的mRNA表達

在10 μmol/L千金藤素作用后，與對照組相比，細胞內p53和FOXO1的表達水平升高(P<0.01)；而在30 μmol/L時，細胞內p53和FOXO1的表達水平降低(P<0.01)。這一結果提示千金藤素在低濃度時可能通過上調細胞內p53和FOXO1的表達而發(fā)揮作用；藥物濃度升高到30 μmol/L后，細胞內p53和FOXO1的表達反而降低，其機制有待進一步探討，見圖5。

6miR-150可抑制p53蛋白表達，miR-182可抑制FOXO1蛋白表達

通過TargetScan (http://www.targetscan.org/)microRNA.org (http://www.microrna.org/)和 miRBase(http://www.mirbase.org/)等預測軟件分析發(fā)現p53和FOXO1的3′UTR區(qū)分別存在miR-150和miR-182的調節(jié)位點，見圖6。在轉染miR-150后，檢測到細胞內p53蛋白的表達降低；而轉染miR-182后，細胞內FOXO1蛋白的表達降低，提示miR-150和miR-182可能分別通過調控抑癌基因p53和FOXO1的表達而促進細胞的生長，見圖7。

Figure 5. The effect of CEP on the mRNA expression of p53 and FOXO1 in the A549 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖5千金藤素對A549細胞中p53和FOXO1表達的影響

Figure 6. The results of bioinformatic analysis to predict the target genes of miR-150 and miR-182 by the software searching.

圖6生物信息學軟件預測miR-150和miR-182的靶基因

討 論

千金藤素具有抗腫瘤和抗炎等功能，研究發(fā)現，千金藤素可以刺激巨噬細胞產生IL-1從而發(fā)揮抗腫瘤的功能[7-8]。本研究表明，千金藤素可以抑制肺癌A549細胞生長，促進其凋亡。miRNA 是一段由 18～25 個核苷酸組成的小片段RNA，廣泛存在于真核生物中，在基因表達調控中發(fā)揮重要作用，為疾病的生物學防治提供一個新的方向。miR-1284在胃癌細胞中發(fā)揮抑癌基因的功能，其機制可能通過調控其靶基因JAG1的表達以發(fā)揮作用[9]。胡明等[10]研究發(fā)現過表達 miR-486-5p可促進氧化應激引起的人骨髓間充質干細胞凋亡，進一步研究發(fā)現它可能參與調控 Akt 通路。

Figure 7. The related protein levels in the A549 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank or negative control group.

圖7各組A549細胞相關蛋白表達的比較

本研究嘗試從miRNA角度探討千金藤素在促A549細胞凋亡中的機制，發(fā)現miR-150和miR-182在千金藤素作用后表達降低，推測可能是通過影響具有癌基因功能的miRNA而發(fā)揮作用的。為明確機制，研究進一步通過生物信息學軟件預測到miR-150可能調控的靶基因包括p53等，miR-182的下游基因包括FOXO1等。

miR-150與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關，Wu等[11]研究發(fā)現miR-150可以負性調控凋亡相關基因EGR2，從而促進胃癌細胞的增殖。還有研究發(fā)現，miR-150的表達升高是腫瘤浸潤深度的危險因素，此外，miR-150的表達水平與直腸腫瘤患者的總生存期和對化療的反應有關[12]。本研究發(fā)現，A549細胞內過表達miR-150可以促進細胞的增殖，其機制是通過下調p53蛋白而發(fā)揮作用。

miR-182在多種腫瘤中作為癌基因存在，Li等[13]在結腸癌中的研究發(fā)現miR-182在腫瘤組織中的表達水平顯著高于臨近正常組織，且miR-182可以降低FOXO1的表達。無論在乳腺癌還是結腸癌中miR-182均促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[14-15]。Wallis等[16]研究發(fā)現miR-182在侵襲性前列腺癌中表達升高，miR-182表達導致腫瘤細胞體外增殖、遷移和侵襲增加，進一步的機制研究發(fā)現，miR-182可能通過抑制FOXO1發(fā)揮作用。本研究首次在A549細胞中探討了miR-182對FOXO1的表達調控作用，結果與其它腫瘤中的研究結論一致。

綜上所述，千金藤素促進肺癌細胞A549凋亡可能是通過抑制miR-150和miR-182的表達實現的；miR-150可抑制靶基因p53的表達，而miR-182可下調靶基因FOXO1的表達，在A549細胞中，二者均具有癌基因的功能。這些研究結果的發(fā)現，為肺腺癌的生物學防治提供了一個新的潛在靶點，值得深入研究。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Cepharanthine promotes A549 cell apoptosis by regulating miR-150 and miR-182

HAO Rui-min, XIE Shu-yang, HAN Wan-hong, YAN Yun-fei, SUN Yun-xiao, YUE Zhen, MA Ying, LI You-jie

(KeyLaboratoryofTumourMolecularBiologyinShandongProvincialUniversities，DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BinzhouMedicalUniversity,Yantai264003,China.E-mail:youjie1979@163.com)

AIM: To investigate the effect of cepharanthine on the growth of human lung carcinoma A549 cells and the underlying mechanism.METHODSAfter A549 cells were treated with cepharanthine, the growth inhibitory rate was detected by MTT assay. The cell morphological changes were observed under light microscope. The apoptosis of the A549 cells was analyzed by flow cytometry. The expression of microRNA (miR)-150, miR-182, p53 mRNA and FOXO1 mRNA were detected by real-time PCR. The downstream target genes were predicted by software, and the expression of p53 and FOXO1 was determined by Western blot.RESULTSAfter cepharanthine treatment, the growth of A549 cells was inhibited, the apoptosis rate was significantly increased, and the expression levels of miR-150 and miR-182 were significantly decreased. With cepharanthine treatment at 10 μmol/L, the expression levels of p53 and FOXO1 were elevated; however, with cepharanthine at 30 μmol/L, the expression levels of p53 and FOXO1 were decreased. After transfection with miR-150, the expression of p53 was significantly decreased, while the expression of FOXO1 was significantly decreased after transfection with miR-182.CONCLUSIONCepharanthine inhibits the growth of A549 cells and promotes the apoptosis of A549 cells by inhibiting the expression of miR-150 and miR-182. miR-150 and miR-182 may down-regulate the expression of p53 and FOXO1， respectively.

Cepharanthine; MicroRNA-150; MicroRNA-182; p53; FOXO1

1000- 4718(2017)11- 1987- 06

2017- 04- 24

2017- 06- 13

國家自然科學基金資助項目(No. 31371321)；山東省自然科學基金資助項目(No. ZR2014HQ079； No. ZR2013HL003； No. ZR2014HL056)；山東省高?？萍加媱?No. J13LE11)

△通訊作者 Tel: 0535-6913211; E-mail: youjie1979@163.com

R363； R285.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.011