陳少秀，余靜，馮萍，秦本露，杜曉

[湖北省十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院），十堰442000]

郁金銀屑片對Balb/c裸鼠銀屑病模型的實驗研究

陳少秀，余靜，馮萍，秦本露，杜曉

[湖北省十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院），十堰442000]

目的觀察郁金銀屑片對Balb/c裸鼠銀屑病模型皮損組織中角質細胞生長因子（Keratinocyte growth factor,KGF）和雙調蛋白（Amphiregulin，AREG）及兩者基因表達的影響。方法將36只Balb/c裸鼠隨機分為空白對照組、模型組和郁金銀屑組，除空白對照組外，另2組裸鼠均用10%普萘洛爾涂于背部皮膚，2次/d，連續(xù)1周的方法造銀屑病模型。成模后郁金銀屑組按0.25 g/kg劑量灌郁金銀屑片混懸液治療2周，空白對照組和模型組灌等量生理鹽水。對裸鼠背部皮損進行銀屑病皮損面積及嚴重程度指數(shù)（PASI）評分；以酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）定量檢測皮損組織均漿液KGF和AREG的蛋白量，實時定量反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測KGF mRNA和AREG mRNA的表達。結果模型組和郁金銀屑組造模后PASI評分、勻漿液中KGF和AREG明顯升高，KGF mRNA和AREG mRNA高表達，與空白對照組比較，P＜0.05。在治療2周后，模型組與同組治療前比較，P＞0.05；郁金銀屑組PASI評分、勻漿液中KGF和AREG降低，KGF mRNA和AREG mRNA低表達，與同組治療前和模型組治療后比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。結論郁金銀屑片治療銀屑病機制與降低表皮組織勻漿液中KGF和AREG、下調兩者基因表達密切相關。

郁金銀屑片；銀屑病模型；角質形成細胞生長因子；雙調蛋白

郁金銀屑片為臨床常用治療銀屑病的中藥制劑，為研究其作用機制，本研究采用Balb/c裸鼠銀屑病模型，觀察郁金銀屑片對其皮損組織KGF、AREG表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 Balb/c品系裸鼠36只，體質量21～24 g，隨機分為空白對照組、模型組和郁金銀屑組，每組12只，動物實驗在湖北醫(yī)藥學院動物中心實驗室完成，實驗室許可證為SYXK（鄂）2011－0031。

1.2 藥品及試劑 郁金銀屑片（陜西香菊藥業(yè)集團有限公司，規(guī)格：0．24 g/片，批號：20151020914）；普萘洛爾片（江蘇常州亞邦制藥有限公司，批號：A20161223）；AREG和KGF的ELISA試劑盒（上海高創(chuàng)化學科技有限公司，批號：CSB－E04497，cyt－041）。

1.3 動物造模和治療 按文獻造模[1]，造模時先將普萘洛爾研碎并配成10%混懸液，然后用棉簽均勻涂于模型組和郁金銀屑組裸鼠背部皮膚，涂抹的厚度以1 mm、直徑1 cm為宜，連續(xù)涂抹1周，2次/d[4]。成模判斷標準：第8天觀察裸鼠背部涂藥處皮膚，以皮膚出現(xiàn)鱗屑、脫屑、紅斑，病理檢查有淋巴細胞浸潤、乳頭瘤樣增生、棘層肥厚、角化過度或局灶性角化不良等銀屑病樣病變[2]。由于本實驗選用的Balb/c無免疫力，對普萘洛爾高度敏感，故成功率達100%。治療方法：治療前先將郁金銀屑片研碎、稱重，然后用生理鹽水將其配制成10%的混懸液。郁金銀屑組按0．25 g/kg的劑量灌胃，2次/d，灌胃治療2周，空白對照組、模型組按10 mL/kg灌生理鹽水對照，療程同前。

1.4 皮損組織KGF和AREG的ELISA定量檢測3組裸鼠在治療前和治療2周時，每組各取6只處死，取背部皮損處皮膚（厚1 mm、直徑1 cm），編號后放在－30℃低溫冰箱保存，用于AREG和KGF蛋白檢測。檢測時，分別取出標本，研磨，勻漿，然后3 000轉離心10 min，取勻漿液上清液，按試劑盒說明書進行操作，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定勻漿液中AREG和KGF蛋白含量[3]。

1.5 組織 KGF和 AREG實時定量 RT－PCR分析 按文獻[4]，將以上方法提取的勻漿液上清液取100 μL，對各組標本進行總RNA提取，采用反轉錄－聚合酶鏈反應（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT－PCR） 逆轉錄酶合成 cDNA，用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取表皮組織總RNA，用紫外分光光度計定量，測定KGF mRNA和AREG mRNA表達。KGF、AREG及內(nèi)參引物序列見表1，通過標準曲線確定樣本含量，KGF和AREG表達水平均經(jīng)相應的基因拷貝數(shù)校正后，以相對值表示。

表1 引物序列表

1.6 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計分析軟件使用SPSS 19．0，以±s表示實驗數(shù)據(jù)，組間均數(shù)檢驗采用多因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 治療前后裸鼠皮損觀察 造模前3組裸鼠表皮正常，模型組和郁金銀屑組在治療前，背部表皮均出現(xiàn)出現(xiàn)鱗屑、脫屑、紅斑，病理檢查有淋巴細胞浸潤、乳頭瘤樣增生、棘層肥厚、角化過度或局灶性角化不良等銀屑病樣病變，說明用普萘洛爾造模可行。在治療2周，空白對照組由于沒用普萘洛爾造模，故治療前后表皮正常，無銀屑病樣病變。模型組有4只裸鼠表皮病變加重，有嚴重的脫屑；郁金銀屑組表皮釘突完全消退，表皮無角化、鱗屑、脫屑、紅斑現(xiàn)象。

2.2 郁金銀屑片對裸鼠AREG、KGF含量和銀屑病皮損面積及嚴重程度指數(shù)（PASI）評分的影響 空白對照組裸鼠AREG、KGF含量和PASI評分治療前后無明顯變化；經(jīng)2周治療，模型組裸鼠AREG、KGF含量保持不變，PASI評分較高，與空白對照組比較，P＜0．05，同組治療前比較，P＞0．05；郁金銀屑組治療2周后AREG、KGF含量和PASI評分明顯降低，與模型組和同組治療比較，P＜0．05，差異有統(tǒng)計學意義，見表2。

2.3 郁金銀屑片對裸鼠AREG mRNA和KGF mRNA表達的影響 如表3，空白對照組裸鼠AREG mRNA和KGF mRNA表達治療前后無明顯變化；經(jīng)2周治療，模型組裸鼠AREG mRNA和KGF mRNA高表達，與空白對照組比較，P＜0.05；郁金銀屑組治療2周后AREG mRNA和KGF mRNA低表達，與模型組和同組治療比較，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

表2 裸鼠AREG、KGF含量和PASI評分比較（±s）

表2 裸鼠AREG、KGF含量和PASI評分比較（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，bP＜0.05；與同組治療前比較，cP＜0.05。

組別空白對照組模型組郁金銀屑組n 6 6 6 6 6 6時間 KGF（pg/mL） AREG（ng/mL） PASI治療前 19.20±2.17 37.03± 5.59 2.87±0.45治療第 2 周 21.11±2.42 35.79± 2.24 3.02±0.27治療前 79.02±5.56a 104.74± 7.16a 5.97±0.41a治療第 2 周 81.43±7.15a 107.48± 9.37a 6.11±0.52a治療前 78.66±8.01a 106.29±10.25a 5.78±0.34a治療第 2 周 19.15±2.18bc 40.35± 6.01bc 3.13±0.29bc

表3 裸鼠AREG mRNA和KGF mRNA表達比較 （±s）

表3 裸鼠AREG mRNA和KGF mRNA表達比較 （±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較 ，bP＜0.05；與同組治療前比較，cP＜0.05。

組別 AREG mRNA KGF mRNA空白對照組 21.32±1.87 17.56±0.89 20.28±1.50 18.14±1.02模型組 52.90±6.01a 45.42±3.71a 55.02±7.01a 43.24±2.95a郁金銀屑組 55.94±5.42a 46.13±5.02a 23.25±3.12bc 19.71±0.92bc n 6 6 6時間治療前治療第2周治療前治療第2周治療前治療第2周

3 討論

研究表明，表皮發(fā)育基因KGF在皮膚表皮細胞的發(fā)育過程具有促進表皮細胞分化的作用，同時，其對抑制上皮細胞的有絲分裂和維持表皮功能具有重要作用[5]。KGF保持相對穩(wěn)定，但在銀屑病皮損組織中，KGF會出現(xiàn)過度分泌現(xiàn)象而導致表皮過度角化或角化不全[6]。AREG分子C端有與表皮生長因子（Epidermal growth factor,EGF）相似的穿膜糖蛋白結構，該蛋白具有促進表皮細胞生長的作為，這種細胞生長因子可刺激成纖維細胞和腫瘤細胞的增殖[7-8]。AREG可在正常上皮細胞中表達，但保持在較低水平，而在銀屑病皮損組織中會異常的高表達[9]。

本研究觀察了BALB/c銀屑病模型裸鼠在使用郁金銀屑片治療后皮損的情況，對裸鼠背部皮損情況進行了PASI評分，并檢測了AREG和KGF蛋白及兩者基因表達。觀察發(fā)現(xiàn)，郁金銀屑組裸鼠在經(jīng)2周治療后，皮損消失，無角化、紅斑、鱗屑、乳頭瘤樣增生現(xiàn)象，表皮釘突完全消退，PASI評分到空白對照組水平。ELISA法定量檢測顯示裸鼠皮膚組織AREG和KGF蛋白明顯降低，實時定量RT-PCR分析顯示AREG mRNA和KGF mRNA低表達。

本實驗通過對銀屑病裸鼠模型皮膚組織ELISA法定量檢測AREG和KGF蛋白，并通過實時定量RT-PCR分析AREG mRNA和KGF mRNA的表達。在實驗中，模型組和郁金銀屑組在治療前，背部表皮均出現(xiàn)出現(xiàn)鱗屑、脫屑、紅斑，病理檢查有淋巴細胞浸潤、乳頭瘤樣增生、棘層肥厚、角化過度或局灶性角化不良等銀屑病樣病變，說明用普萘洛爾造模可行，完全模擬了銀屑病的病理改變。在治療2周后，空白對照組由于沒用普萘洛爾造模，故治療前后表皮正常，無銀屑病樣病變。模型組和郁金銀屑組在治療前，AREG和KGF蛋白、AREG mRNA和KGF mRNA在皮膚組織存在明顯的異常升高現(xiàn)象，而在治療2周后，郁金銀屑組這些指標明顯降低，此結果提示郁金銀屑片抑制AREG、KGF表達可能是治療銀屑病的機制之一。

中醫(yī)在治療銀屑病以涼血養(yǎng)陰為主，兼顧活血解毒為輔，郁金銀屑片就是基于這一理論和治療原則研制而成。郁金銀屑片由郁金、紅花、秦艽、莪術、玄明粉、土鱉蟲、皂角刺、雄黃、石菖蒲、關黃柏等多味中草藥組成，具有清熱解毒、疏通氣血、涼血養(yǎng)陰、軟堅消積、燥濕殺蟲之功效[10-12]。中藥從病機入手，通過辨證分型，治療當以清熱解毒、涼血散瘀、祛風止癢、養(yǎng)血潤膚為主[13-15]。郁金銀屑片就是基于這一理論研制而成，吸收后可使表皮細胞AREG、KGF蛋白合成降低，AREG mRNA和KGF mRNA低表達，這有利于細胞正常角化，使KGF介導的表皮細胞過度角化或角化不全現(xiàn)象減輕，且表皮組織的血管新生處于正常水平，從而達到治療銀屑病的目的。

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Experimental Study of Yujin Yinxie Pill on Balb/c Nude Mice Models of Psoriasis

Chen Shaoxiu,Yu Jing,Feng Ping,Qin Benlu,Du Xiao
Shiyan Taihe Hospital in Hubei Province（Affiliated Hospital of Hubei Medical College）,Shiyan 442000,China

ObjectiveIn order to observe the effects of Yujin yinxie pill on keratinocyte growth factor（KGF）and amphiregulin（AREG） in the Balb/c nude mice models of psoriasis as well as the expression levels of the two genes.MethodsAll of 36 Balb/c mice were randomly divided into control group,model group and Yujin Yinxie group,and the two treatment groups were coated on the back skin with 10%propranolol two times a day for one week to build psoriasis models.One of the model groups was treated with Yujin Yinxie pill in dose of 0.25 g/kg for two weeks;another two groups were given normal saline.Psoriasis area and severity index（PASI） score of the nude mice skin were analyzed.The protein expression level of KGF and AREG were detected in skin lesions by enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA）,and the mRNA expression of two genes were detected by real time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）method.ResultsCompared with the blank control group,the PASI score and the expression level of KGF and AREG increased significantly in the two model groups （P<0.05）.After treatment for two weeks,the saline model group （P>0.05）;but in the Yujin Yinxie pill group，PASI score and the expression level of KGF and AREG were lower than other groups（P<0.05）.The difference was statistically significant.ConclusionThe mechanism of Yujin Yinxie pill for psoriasis is closely related with reduction of gene expression of KGF and AREG.

Yujin Yinxie pill;Psoriasis models;Keratinocyte growth factor;Amphiregulin

R758.63

A

1672－0709（2017）05-0402－04

十堰市太和醫(yī)院院級項目（2016JJXM041）

杜曉，E-mail:csxchensaoxuo@163.com

2016-10-06）