馬立文 ，尹智 ，周炳榮 ，駱丹

（1．南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，南京210008；2．南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京210029）

大豆低聚肽對UVB誘導(dǎo)的光老化小鼠皮膚中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的影響

馬立文1，尹智2，周炳榮2，駱丹2

（1．南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，南京210008；2．南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京210029）

目的觀察大豆低聚肽（SOP）對中波紫外線（UVB）誘導(dǎo)的BALB/c光老化小鼠皮膚中的Ⅰ型和Ⅲ型膠原的作用。方法BALB/c小鼠背部皮膚剃毛后予UVB照射，構(gòu)建小鼠皮膚光老化模型。隨機(jī)分組行UVB照射后分別外用不同濃度的SOP。組織切片、Masson染色觀察膠原纖維改變并測定其膠原含量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT－PCR）檢測MMP1、MMP3、COL1a1、COL3a1 mRNA。結(jié)果與對照組比較各濃度SOP組的膠原含量及COL1a1、COL3a1 mRNA表達(dá)增加（P＜0．05），MMP1、MMP3 mRNA 的表達(dá)減少（P＜0．05），且 SOP 中濃度組效果最顯著（P＜0．05）。結(jié)論SOP 能有效對抗UVB所致BALB/c光老化小鼠皮膚中的Ⅰ型和Ⅲ型膠原的降解，對小鼠皮膚具有光保護(hù)作用。

大豆低聚肽；中波紫外線；Ⅰ型膠原；Ⅲ型膠原；基質(zhì)金屬蛋白酶－1；基質(zhì)金屬蛋白酶－3

中波紫外線是皮膚光老化的最主要的因素[1]，膠原纖維是人體皮膚中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，UVB長期照射可以減少膠原纖維的合成，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix mtalloproteinases，MMPs）降解真皮層膠原纖維[2]。使用UVB反復(fù)照射可誘導(dǎo)出動物皮膚光老化[3]。大豆低聚肽（Soybean oligopeptide，SOP）是大豆蛋白經(jīng)過蛋白質(zhì)水解酶水解等處理后得到的300～700 kDa的范圍內(nèi)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，其有降壓、降脂、抗氧化等多方面的功效。本研究觀察了UVB所致慢性光損傷中小鼠皮膚中Ⅰ型和Ⅲ型膠原及MMP1、MMP3的影響及外用SOP對此影響的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 UVB輻射儀（美國Spectronic公司，并以配套的探測儀測定UVB劑量）、Leica采集圖像信號系統(tǒng)（德國Leica公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，引物由南京金斯瑞科技有限公司合成。大豆低聚肽凍干粉由無限極（中國）有限公司提供。

1.2 大豆低聚肽溶液配制 將大豆低聚肽凍干粉溶解于蒸餾水中，配成低濃度（2．5 IU/mL）、中濃度（5 IU/mL）、高濃度（10 IU/mL）、更高濃度（20 IU/mL）大豆低聚肽溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物分組 南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購雌性BALB/c小鼠35只，月齡3周，體質(zhì)量18～22 g。小鼠隨機(jī)分為7組，每組5只，為UVB照射組（A）、空白對照組（B）、UVB+基質(zhì)組（C）、UVB+SOP 低濃度組（D）、UVB+SOP中濃度組（E）、UVB+SOP高濃度組（F）、UVB+SOP更高濃度組（G）。

1.4 照光及用藥 將所有小鼠在實(shí)驗(yàn)前1 d用松香石蠟拔毛法除去小鼠背部毛發(fā)，范圍為2 cm×3 cm，A組及C-G組小鼠按如下方案[4]行UVB照射：照射5次/周，總計(jì) 8周；第 1～2周：60 mJ/cm2劑量照射；第3周：120 mJ/cm2劑量照射；第4周：180 mJ/cm2劑量照射；第5～8周：240 mJ/cm2劑量照射；照射總劑量6.9 J/cm2，UVB照射儀距小鼠約15 cm處。C組小鼠照光后于剃毛區(qū)皮膚1次/d，外用基質(zhì)溶液1mL，D-G組小鼠照光后于脫毛區(qū)皮膚1次/d，分別外用相應(yīng)不同濃度的SOP溶液1 mL，涂后以保鮮膜覆蓋給藥區(qū)1 h。

1.5 組織取材 照光結(jié)束后用斷頸法處死小鼠，立即取下背部脫毛區(qū)全層皮膚，將皮膚分為2部分，一部分以10%福爾馬林溶液固定，制作病理組織切片；另一部分皮膚去除皮下脂肪，在冰凍的生理鹽水中漂洗，冷凍于-80℃冰箱以制備組織勻漿。

1.6 Masson染色 組織于10%福爾馬林溶液中固定12 h后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，進(jìn)行Masson染色。每只小鼠皮膚Masson染色標(biāo)本隨機(jī)選擇5個(gè)視野，以Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司開發(fā)）計(jì)算出染成藍(lán)色的膠原纖維的光密度值，取其均值，用此種半定量的方法代表膠原纖維含量[5]。

1.7 Real-TimePCR法檢測MMP1、MMP3和COL1a1、COL3a1基因的表達(dá) 凍存狀態(tài)下，取小鼠皮膚組織研磨至粉末狀，加入1 mL TRIzol試劑裂解細(xì)胞提取總RNA，純化后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋10倍后按20 μL反應(yīng)體系擴(kuò)增，引物序列由Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，見表1。95℃預(yù)變性5 min，隨后95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸10 min。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，根據(jù)循環(huán)（2-△△Ct）值計(jì)算MMP1、MMP3、COL1a1和COL3a1 mRNA的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0軟件進(jìn)行處理，各組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外用SOP對光老化小鼠皮膚真皮膠原的影響B(tài)組膠原纖維深染、排列致密、分布均勻；A、C-G組膠原纖維則不同程度淡染，排列稀疏，見圖1。與B組比較，所有組光密度值均不同程度減?。≒<0.05），即膠原纖維含量不同程度減少；與A組比較，E-G組光密度值均不同程度增加（P<0.05），且E組最明顯（P<0.05），說明E組膠原纖維降解程度最輕，見表2。

2.3 外用SOP對光老化小鼠皮膚中MMP1、MMP3、COL1a1、COL3a1 mRNA的影響 UVB照射組與空白對照組比較，MMP1和MMP3的基因表達(dá)有明顯增高，而COL1a1、COL3a1 mRNA則出現(xiàn)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），UVB+各濃度SOP組分別與UVB照射組比較，MMP1、MMP3 mRNA有不同程度降低，COL1a1和COL3a1 mRNA則不同程度升高，且UVB+中濃度SOP組變化最明顯（P<0.05），UVB各濃度SOP組的MMP1、MMP3、COL1a1、COL3a1 mRNA表達(dá)和UVB+中濃度SOP組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表 2。

表1 MMP1、MMP3、collagenⅠ和collagenⅢ基因和內(nèi)參照物的引物序列

圖1 各組小鼠真皮膠原的表達(dá) （Masson染色×100）

表2 各組光密度值及相關(guān)基因水平比較 （±s）

表2 各組光密度值及相關(guān)基因水平比較 （±s）

注：avs.A 組，P<0.05；bvs.B 組，P<0.05；cvs.E 組，P<0.05。

組別 光密度值 MMP1 mRNA CoL1a1 mRNA MMP3 mRNA CoL1a3 mRNA A 0.145±0.013 1.001 6±0.066 4 1.0064±0.1391 1.0037±0.1079 1.001 6±0.069 3 B 0.456±0.020a 0.088 7±0.092 2a 14.2772±0.9890a 0.0657±0.0068a 16.400 2±1.136 0a C 0.136±0.022bc 0.977 7±0.039 6bc 1.235 6±0.128 4bc 1.051 2±0.112 9bc 1.177 4±0.081 5bc D 0.184±0.006bc 0.724 8±0.050 2abc 2.899 1±0.200 8abc 0.741 7±0.051 4abc 3.415 5±0.367 0abc E 0.361±0.020ab 0.308 2±0.021 3ab 7.154 1±0.768 7ab 0.501 8±0.052 2ab 8.587 9±0.594 9ab F 0.314±0.012abc 0.416 2±0.028 8abc 6.066 0±0.239 8abc 0.338 1±0.023 4abc 7.491 8±0.779 0abc G 0.277±0.038abc 0.479 1±0.049 8abc 5.298 0±0.569 3abc 0.379 5±0.029 5abc 5.933 9±0.411 0abc F 62.179 194.386 216.235 89.861 233.782 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

光老化中所表現(xiàn)出的皮膚皺紋、彈性下降、皮膚松弛等都是由真皮結(jié)構(gòu)的改變所致，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這些外在表現(xiàn)主要與真皮膠原含量減少有關(guān)[6]。其中最主要的是Ⅰ型和Ⅲ型膠原。Ⅰ型膠原約占皮膚膠原干重的85%，在真皮中聚集成與皮面平行的粗大纖維束，相互交織成網(wǎng)，是維持皮膚張力和承受拉力的重要成分，也是維持皮膚飽滿充盈的物質(zhì)基礎(chǔ)。Ⅲ型膠原是構(gòu)成網(wǎng)狀纖維的主要成分，在維持皮膚彈性方面起重要作用。UVB長期照射可以減少膠原纖維的合成，本研究中UVB照射組小鼠皮膚膠原纖維淡染，排列稀疏，與空白對照組比較光密度值明顯減?。≒<0.05），外用不同濃度SOP組光密度值較UVB照射組不同程度增加（P<0.05），即膠原纖維含量不同程度增加。UVB照射組COL1a1、COL3a1 mRNA表達(dá)量較空白對照組明顯下降（P<0.05），外用SOP后這種變化則有不同程度改善，且以中濃度SOP組較UVB照射組改善最為明顯（P<0.05）。光密度值的變化與COL1a1、COL3a1 mRNA表達(dá)趨勢一致。說明UVB長期照射導(dǎo)致小鼠皮膚中膠原纖維含量降低，且COL1a1、COL3a1 mRNA表達(dá)也明顯下降，外用SOP可對抗UVB照射導(dǎo)致的膠原纖維的降解。

UVB長期照射可以誘導(dǎo)MMPs降解真皮層膠原纖維。MMPs是一大類具有其特定結(jié)構(gòu)的鋅依賴性內(nèi)源性蛋白酶家族，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，其中MMP1、MMP3的作用最重要。MMP1能水解Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維，這兩種膠原纖維被MMP1切斷后，MMP3可以繼續(xù)降解斷裂的膠原纖維，并且MMP3還能激活其他的基質(zhì)金屬蛋白酶，從而降解真皮中的膠原纖維等多種細(xì)胞外基質(zhì)，使皮膚在紫外線損傷后膠原修復(fù)能力下降導(dǎo)致正常皮膚結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[7]。UV照射可以改變多種不同基因的表達(dá)，已證實(shí)其可以增加其中MMP1和MMP3的含量[8]。本研究中UVB照射組MMP1、MMP3 mRNA的表達(dá)與空白對照組比較明顯增加，不同濃度外用SOP組中MMP1、MMP3 mRNA的表達(dá)則較UVB照射組不同程度下降，且以中濃度SOP組的MMP1、MMP3 mRNA表達(dá)下降最為明顯（P＜0．05）。說明外用SOP可緩解UVB照射所致MMP1、MMP3 mRNA的表達(dá)增加，從而減少UVB對膠原纖維的降解。

SOP是大豆蛋白水解產(chǎn)物，其氨基酸組成幾乎與大豆蛋白質(zhì)完全一樣，其有降壓、降脂、抗氧化等多方面的功效。本實(shí)驗(yàn)小組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外用SOP對UVB所致小鼠皮膚中的氧化損傷具有保護(hù)作用[9]，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，外用SOP對UVB所致小鼠皮膚慢性光損傷中膠原纖維的降解具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過減少UVB所致MMP1和MMP3的含量的升高起作用。本實(shí)驗(yàn)對光老化的防治及SOP抗衰老產(chǎn)品的研制具有一定指導(dǎo)作用。

[1]Butler PE,Gonzalez S,Randolph MA,et al．Quantitative and qualitative effects of chemical peeling on photo－aged skin:an experimental study[J]．Plast Reconstr Surg,2001,107:222－228．

[2]Sárdy M．Role of Matrix metalloproteinases in skin ageing[J]．Connect Tissue Res,2009,50:132．

[3]Haarmann－Stemmann T,Boege F,Krutmann J．Adaptive and maladaptive responses in skin:mild heat exposure protects against UVB－induced photoaging in mice[J]．J Invest Dermatol,2013,133:868－871．

[4]Cho JM,Lee YH,Baek RM,et al．Effect of platelet－rich plasma on ultraviolet b－induced skin wrinkles in nude mice[J]．J Plast Reconstr Aesthet Surg,2011,64:e31－39．

[5]Kwon OS,Jung SH,Yang BS．Topical administration of manuka oil prevents UV－B irradiation－induced cutaneous photoaging in mice[J]．Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:930 857．

[6]Helfrich Y,Sachs DJ．Overview of skin aging and photoaging[J]．Dermatology Nursing,2008,20:177．

[7]Wang XY,Bi ZG．UVB－irradiated human keratinocytes and interleukin－1alpha indirectly increase MAP kinase/AP－1 activation and MMP－1 production in UVA－irradiated dermal fibroblasts[J]．Chin Med J（Engl）,2006,119:827－831．

[8]Cho HS,Lee MH,Lee JW,et al．Anti－wrinkling effects of the mixture of vitamin C,vitamin E,pycnogenol and evening primrose oil,and molecular mechanisms on hairless mouse skin caused by chronic ultraviolet B irradiation[J]．Photodermatol Photoimmunol Photomed,2007,23:155－162．

[9]馬立文,趙宏偉,周炳榮,等．大豆低聚肽對中波紫外線誘導(dǎo)的光老化小鼠皮膚的保護(hù)作用[J]．中國皮膚性病學(xué)雜志,2014,28（2）:119－122．

Effects of Soybean Oligopeptide on Collagen TypeⅠandⅢin Mice Skin Irradiated by UVB

Ma Liwen1,Yin Zhi2,Zhou Bingrong2,Luo Dan2
1.Drum Tower Hospital,The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School,Nanjing 210008,China;2.First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China

ObjectiveIn order to study the effects of soybean oligopeptide （SOP）on Collagen typeⅠandⅢ in BALB/c mice skin irradiated by ultraviolet radiation B（UVB）．MethodsBALB/c mice irradiated by UVB for a long time on back hair shaving．Each group smeared different concentration of SOP after UVB irradiation．Masson staining was used to observe the collagen changes and measure collagen content．Real time－PCR to determine the mRNA expression levels of MMP1,MMP3,collagen typesⅠandⅢ．ResultsThe collagen typeⅠandⅢ conten of used SOP groups showed higher than the group irradiated by UVB only（P＜0．05）．And the expression of MMP1,MMP3 mRNA also decreased（P＜0．05）．The middle dose SOP group had the most significant effect （P＜0．05）．ConclusionSOP can prevent the degradation of collagen typeⅠand Ⅲ in BALB/c mice skin irradiated by UVB light．

Soybean oligopeptide;Ultraviolet radiation B;Collagen typeⅠ;Collagen typeⅢ;MMP1,MMP3

R334．+5

A

1672－0709（2017）05－0395－04

駱丹，E－mail：daniluo2005@163．com

2017－04－14）