金善泉 王成云 董 欣 陳柯言 張 雪 萬 琪

（南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內科，南京210029）

?論 著?

頭痛寧對偏頭痛大鼠硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)IL-1β表達影響

金善泉 王成云 董 欣 陳柯言 張 雪 萬 琪△

（南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內科，南京210029）

目的：研究頭痛寧對反復發(fā)作性偏頭痛大鼠硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)IL-1β(interleukin-1beta)表達的影響。方法：選擇健康成年雄性SD大鼠60只，初始質量180～220 g。先取20只隨機分為4組，每組5只，分別為生理鹽水7天組 (sham)、致炎劑 (in fl ammatory soup, IS) 1天組（IS1）、致炎劑3天組（IS3）和致炎劑7天組(IS7)，建立反復發(fā)作性偏頭痛大鼠模型；再取25只隨機分為5組，每組5只，分別為致炎劑7天對照組(IS7)、0.375 g/kg頭痛寧干預組(T1)、0.75 g/kg頭痛寧干預組(T2)、1.5 g/kg頭痛寧干預組(T3)和3.0 g/kg頭痛寧干預組(T4)，取硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)進行IL-1β蛋白免疫印跡分析(western blot)及IL-1β mRNA實時熒光定量PCR檢測。最后取15只，隨機分為3組，每組5只，分別為生理鹽水7天組(sham)、致炎劑7天組(IS7)和3.0 g/kg頭痛寧干預組(T4)，灌流固定后各組分別取大鼠硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)進行IL-1β蛋白免疫熒光檢測。結果：(1)與生理鹽水7天組比較，致炎劑7天組IL-1β的表達在硬腦膜(P＜ 0.01)及三叉神經(jīng)節(jié)(P＜ 0.01)均明顯升高；(2)與致炎劑7天組相較，在大鼠硬腦膜/三叉神經(jīng)節(jié)，0.75 g/kg頭痛寧干預組(P＜ 0.01/P＜ 0.01)、1.5 g/kg 頭痛寧干預組 (P＜ 0.01/P＜ 0.05)和 3.0 g/kg 頭痛寧干預組 (P＜ 0.01/P＜ 0.01) IL-1β 表達均明顯降低，0.375 g/kg頭痛寧干預組IL-1β表達下降不明顯；(3)與致炎劑7天組相較，3.0 g/kg頭痛寧干預組三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞胞質內免疫熒光斑點數(shù)明顯減少，大鼠硬腦膜未能成功染色；(4)與致炎劑7天組相較，3.0 g/kg頭痛寧干預組在硬腦膜(P＜ 0.01)及三叉神經(jīng)節(jié) (P＜ 0.05) IL-1β mRNA表達均減少。結論：頭痛寧抑制硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)IL-1β基因轉錄，下調IL-1β的表達可能是其治療偏頭痛的機制之一。

偏頭痛；頭痛寧；硬腦膜；三叉神經(jīng)節(jié)；IL-1β

偏頭痛是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性頭痛，典型表現(xiàn)為單側、搏動性、中到重度疼痛，常持續(xù)4到72小時[1]。其中，超過一半的人（50.3%）報告為嚴重頭痛，21.8%的人報告為極嚴重頭痛[2]，嚴重影響患者生活質量。因此，研究偏頭痛發(fā)生機制及其相應的治療手段具有重要意義。目前偏頭痛的發(fā)病機制涉及兩個主要理論：皮層擴散性抑制及三叉神經(jīng)血管學說[3]。其中，三叉神經(jīng)血管學說的分子學機制涉及到硬腦膜、三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)核等多個層面，以及 IL-1β[4]、CGRP[5]、TRPV1受體[6]、5-HT1B/1D受體[7]等多個分子。在眾多分子中，IL-1β的角色最近越來越受到重視，成為偏頭痛發(fā)生機制研究的熱點。偏頭痛發(fā)生機制的不完全明晰導致偏頭痛的治療陷入困境——傳統(tǒng)途徑藥物治療有其較大的局限性[8]。因此，探索偏頭痛產生發(fā)展的新機制及其相對應的治療方法成為當務之急。幸運的是，我們臨床研究表明，頭痛寧(Toutongning) 膠囊（咸陽步長制藥有限公司，國藥準字Z20026851）作為中成藥制劑，在治療偏頭痛方面具有確切療效[9,10]，這為我們進一步探索偏頭痛機制、尋找新的治療方法開辟了新思路。IL-1β作為目前偏頭痛機制研究中的熱點，進一步明確其在偏頭痛產生維持過程中的角色，探索其在頭痛寧治療偏頭痛機制中的變化成為本實驗研究目的。

本實驗首次觀察到IL-1β不僅在偏頭痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)也在其硬腦膜有了顯著表達增加，并首次觀察到頭痛寧可以減少偏頭痛大鼠硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)IL-1β表達，其可能為頭痛寧治療偏頭痛的重要機制之一。

方 法

1.主要試劑及儀器

IL-1β兔抗大鼠一抗 (ab9787, Abcam)；GAPDH兔抗大鼠一抗(AB2302, Millipore)；熒光二抗Alexa Fluor 594（紅色）山羊抗兔IgG (A-11012, Thermo)；逆 轉錄 試 劑 盒 (R222-01, Vazyme)，SYBR Green Master Mix (Q141 - 02, Vazyme)；引物合成（上海，Introgen）；Western blot 電泳儀，轉膜儀(Thermo)；石蠟包埋機(EG1150H, Leica)；石蠟切片機(RM2235,Leica)；熒光顯微鏡(DP70, Olympus)；實時定量PCR 儀 (Step one plus, Applied Biosystems)。

2.方法

（1）實驗動物及分組

選擇健康成年雄性SD大鼠共60只，初始質量180～220 g, 購于上海杰思捷實驗動物有限公司。22℃恒溫環(huán)境中單籠飼養(yǎng)，自由飲水進食。先隨機（電腦選?。┤?0只分為4組，每組5只，分別為生理鹽水7天組(sham)、致炎劑 (in fl ammatory soup, IS) 1天組 (IS1)、致炎劑3天組 (IS3)、致炎劑7天組 (IS7)；再取25只隨機分為5組，每組5只，分別為致炎劑7天對照組 (IS7)、0.375 g/kg頭痛寧干預組(T1)、0.75 g/kg頭痛寧干預組(T2)、1.5g/kg頭痛寧干預組 (T3) 和3.0g/kg頭痛寧干預組 (T4)。取硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)行IL-1β蛋白免疫印跡分析(western blot)、IL-1β mRNA實時熒光定量PCR檢測。最后取15只，隨機分為3組，每組5只，為生理鹽水7天組，致炎劑7天組，3.0 g/kg頭痛寧干預組，灌流固定后各組分別取大鼠硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)行IL-1β蛋白免疫熒光檢測。

（2）手術方法

根據(jù)Agustin等的反復發(fā)作性偏頭痛模型[11]，參考Chen等[12]手術方法，腹腔注射10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)，麻醉大鼠，將大鼠固定于立體定位儀。碘伏消毒，逐層剪開皮膚肌肉，暴露人字縫。于左側橫竇上，上矢狀竇旁左側，牙科鉆小心于硬腦膜外鉆出方形骨窗（約3 mm×3 mm）。取出方形骨瓣，并在骨窗右側鉆一保留底邊的縱行骨瓣。棉線固定消毒過的PE10管于縱行骨瓣上，使之開口于硬腦膜與顱骨之間（不接觸硬腦膜），將方形骨瓣復位并縫合切口。所有操作過程切勿觸及硬腦膜。

（3）建立模型

藥物干預：術后恢復3天，于第4天開始每天固定時間經(jīng)PE10管緩慢（10 min）向硬腦膜外注射致炎劑（含2 mmol/L組胺、5-羥色胺、緩激肽1.032 mg及 0.2 mmol/L 前列腺素 E2）1次 10 μl。①致炎劑1天、3天、7天組分別經(jīng)PE10管予致炎劑注射1次、3次、7次。生理鹽水7天對照組，每天經(jīng)PE10管給予等量生理鹽水1次，共7次。建立反復發(fā)作性偏頭痛大鼠模型。②頭痛寧干預組在術后第2天開始，每天予頭痛寧0.375 g/kg、0.75 g/kg、1.5 g/kg和3.0 g/kg灌胃，術后第4天開始每組除頭痛寧灌胃外，每天經(jīng)PE10管予致炎劑1次，直至術后第7天。致炎劑7天對照組從術后第2天開始予等量生理鹽水灌胃，第4天開始經(jīng)PE10管予致炎劑，直至術后7天。

（4）免疫印跡分析

在最后一次藥物干預后3 h，10%水合氯醛深麻醉處死實驗大鼠。迅速于冰上從矢狀縫剪開大鼠顱骨，取出大鼠左側刺激側硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)，在4℃預冷PBS溶液中充分洗凈血液，濾紙吸干，置于1.5 ml EP管中，液氮速凍，-80℃冰柜保存留用。于-80℃冰柜取出硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)，剪碎組織，加入含有蛋白酶抑制劑等裂解混合液，置于冰上，超聲勻漿，靜置40 min后4℃離心，12 000 r/min，15 min（離心半徑5 cm），取上清，BCA法測蛋白濃度。蛋白原液加入上樣緩沖液100℃變性5 min。取等量蛋白上樣液行免疫印跡檢測，SDS-PAGE凝膠電泳，轉于PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入IL-1β一抗稀釋液(1:1 000，ab9787, Abcam) 、GAPDH一抗稀釋液(1:4 000，AB2302, Millipore) 4℃過夜。洗膜緩沖液洗膜3次，加入山羊抗兔二抗稀釋液室溫孵育2 h，洗膜，顯色，使用ImageJ2x進行灰度分析，以GAPDH作為內參照。

（5）免疫熒光

在最后一次藥物干預后3 h，10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，開胸經(jīng)左心室插管至升主動脈，先用0.01 mol/L 預冷PBS沖洗血液，再用4%多聚甲醛灌流固定，取出硬腦膜及左側三叉神經(jīng)節(jié)置于4%多聚甲醛固定12 h。于梯度酒精中逐步脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋。切片機上石蠟切片，厚度5 μm，4℃冰箱保存待用。取出切片，二甲苯，梯度酒精，脫蠟到水。PBS沖洗(5 min×3次)后，PBST中浸泡20 min破膜。滴加含5%小牛血清白蛋白和0.3%Triton X-100的封閉液室溫孵育1 h。滴加IL-1β一抗（1:400，ab9787,Abcam），4℃過夜。次日，PBS沖洗（5 min×3次），加入熒光二抗Alexa Fluor 594（紅色）山羊抗兔IgG (1:800，A-11012, Thermo)避光室溫孵育2 h，PBS沖洗（5 min×3次），封固，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

（6）實時熒光定量PCR

取材方法同免疫印跡分析。于-80℃冰柜取出腦膜及三叉神經(jīng)，迅速放入-80℃預冷消毒的研缽內，不斷倒入適量液氮，進行研磨。當組織成粉末時，根據(jù)試劑盒操作指南提取總RNA，分光光度計測RNA濃度。取總RNA0.5 μg，構建10 μl逆轉錄體系：5*prime script RT master mix for realtime (vazyme,R222-01) 2 μl，無菌ddH2O補至10 μl放入逆轉錄儀，37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ forever，得全基因組cDNA。構建10ulqRT-PCR反應體系：SYBR Green Master Mix (vazyme, Q141-02) 5 μl，前后端引物各0.2 μl (GAPDH:F:GTGGAGTCTACTGGCGTCTT,R:TGCTGACAATCTTGAGGGA; IL-1β:F:CAAATCT-CACAGCAGCAT,R:GGTCGTCATCATC CCAC)，無菌ddH2O補至10 μl。實時定量PCR儀(Applied Biosystems)進行兩步法反應：95℃預變性5 min, 擴增95℃變性10 s，60℃退火/延伸30 s，擴增40個循環(huán)，得出CT值。并通過2－△ct計算相對mRNA表達水平。

3.統(tǒng)計學方法

采用SPSS STATISTICS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±SD)及直方圖表示，兩組比較用t檢驗，秩和檢驗。多組間比較運用單因素方差分析(ANOVA)，Turkey's多重比較法，Tamhane's T2檢驗法。P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.隨致炎劑注射次數(shù)增加，大鼠硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)IL-1β表達逐漸增加：取致炎劑7天組，建立反復發(fā)作性偏頭痛大鼠模型（見圖1，表1）。

2.經(jīng)頭痛寧干預，與致炎劑7天組相較，IL-1β在大鼠硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)表達下降（見圖2，表2）。

3.經(jīng)頭痛寧干預，與致炎劑7天組相較，大鼠三叉神經(jīng)節(jié)IL-1β免疫熒光明顯減少與生理鹽水7天對照組相較，致炎劑7天組IL-1β主要表達于神經(jīng)元細胞，點狀免疫熒光明顯增多。3.0 g/kg頭痛寧干預組與致炎劑7天組相較，神經(jīng)元細胞內點狀免疫熒光明顯減少。大鼠硬腦膜由于組織特殊性，未能成功染色（見圖3）。

4.經(jīng)頭痛寧干預，與致炎劑7天組相較，頭痛寧干預組大鼠硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)IL-1βmRNA表達下降大鼠硬腦膜，致炎劑7天組與生理鹽水7天組相較，IL-1β mRNA表達明顯增高。1.5 g/kg頭痛寧干預組、3.0 g/kg頭痛寧干預組較致炎劑7天組mRNA表達明顯降低。在大鼠三叉神經(jīng)節(jié)，致炎劑7天組與生理鹽水7天組相較，IL-1β mRNA表達增高。3.0 g/kg頭痛寧干預組較致炎劑7天組mRNA表達降低（見圖4，表3）。

討 論

圖1 A:大鼠硬腦膜，與Sham相較，IS1、IS3、IS7組IL-1β表達均顯著增加(*P ＜ 0.01)；B:大鼠三叉神經(jīng)節(jié)，與Sham相較，IS1、IS3,IS7組IL-1β表達均顯著增加(*P ＜ 0.01,見表1)。Sham:生理鹽水7天組; IS1:致炎劑1天組; IS3:致炎劑3天組; IS7:致炎劑7天組Fig.1 A: IL-1β level of IS1, IS3, and IS7 group was signi fi cantly higher than saline control group in dura (*P ＜ 0.01); B:IL-1β level of IS1, IS3, and IS7 group was signi fi cantly higher than saline control group in trigeminal ganglion (*P ＜ 0.01, Table 1). Sham:7-day saline control group, IS1: 1-day in fl ammatory soup group; IS3:3-day in fl ammatory soup group; IS7:7-day in fl ammatory soup group.

表1 生理鹽水7 天對照組及致炎劑注射各組IL-1β在硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)表達比較( ±SD，n = 5)Table 1 The expression of IL-1β in dura and trigeminal ganglion of different inflammatory soup groups (±SD，n = 5)

表1 生理鹽水7 天對照組及致炎劑注射各組IL-1β在硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)表達比較( ±SD，n = 5)Table 1 The expression of IL-1β in dura and trigeminal ganglion of different inflammatory soup groups (±SD，n = 5)

致炎劑7天組IS7硬腦膜Dura 0.125±0.023 0.405±0.010* 0.634±0.028* 1.183±0.035*三叉神經(jīng)節(jié)Trigeminal ganglion 0.665±0.006 0.731±0.001* 1.114±0.016* 1.173±0.023*組織Tissue生理鹽水7天對照組Sham致炎劑1天組IS1致炎劑3天組IS3

圖2 A:大鼠硬腦膜，與IS7組相較， IL-1β在T1組表達無明顯變化，T2,T3,T4組表達明顯下降(*P ＜ 0.01)。B:大鼠三叉神經(jīng)節(jié)，與IS7組相較， IL-1β在T1組表達無明顯變化，T2,T3,T4組表達明顯下降(#P ＜ 0.01,見表2)。 IS7:致炎劑7天對照組, T1:0.375 g/kg頭痛寧干預組; T2:0.75 g/kg頭痛寧干預組; T3:1.5 g/kg頭痛寧干預組; T4:3.0 g/kg頭痛寧干預組Fig.2 A: In dura, compared with IS7, IL-1β level in T2, T3, T4 group was signi fi cantly lower (*P ＜ 0.01); B: In trigeminal ganglion,compared with IS7, IL-1β level in T2, T3, T4 group was signi fi cantly lower (*P ＜ 0.01, #P ＜ 0.05, Table 2). IS7:7-day in fl ammatory soup group; T1:0.375 g/kg Toutongning group; T2:0.75 g/kg Toutongning group; T3:1.5 g/kg Toutongning group; T4:3.0 g/kg Toutongning group.

表2 頭痛寧干預組及致炎劑7天對照組IL-1β在硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)表達比較(±SD，n = 5)Table 2 The exp ression of IL-1β in dura and trigeminal ganglion of different Toutongning groups and 7-day inflammatorysoup group(±SD，n = 5)

表2 頭痛寧干預組及致炎劑7天對照組IL-1β在硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)表達比較(±SD，n = 5)Table 2 The exp ression of IL-1β in dura and trigeminal ganglion of different Toutongning groups and 7-day inflammatorysoup group(±SD，n = 5)

*P ＜ 0.01, #P ＜ 0.05，與致炎劑 7 天組比較，compared with IS7. IS7: 7-day in fl ammatory soup group.

頭痛寧干預組 Toutongning group 0.375 g/kg (T1) 0.75g/kg (T2) 1.5 g/kg (T3) 3.0 g/kg (T4)硬腦膜Dura 0.998±0.023 1.115±0.078 0.362±0.029* 0.108±0.013* 0.207±0.033*三叉神經(jīng)節(jié)Trigeminal ganglion 1.291±0.047 0.951±0.128 0.267±0.162* 0.530±0.154# 0.290±0.148*組織Tissue致炎劑7 天對照組IS7

圖3 各組三叉神經(jīng)節(jié)內IL-1β免疫熒光的比較（×400）Sham:生理鹽水7天對照組；IS7：致炎劑7天組；T4: 3.0 g/kg頭痛寧干預組Fig.3 The expression of IL-1β in trigeminal ganglion by immuno fl uorescence in 3 di ff erent groups（×400）Sham: 7-day saline control group; IS7: 7-day in fl ammatory soup group; T4: 3.0 g/kg Toutongning group.

圖4 各組大鼠硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)IL-1βmRNA表達情況。*P ＜0.01，#P ＜ 0.05。Sham: 生理鹽水7 天對照組；IS7:致炎劑7天組；T3:1.5 g/kg頭痛寧干預組；T4:3.0 g/kg頭痛寧干預組 (見表3)。Fig.4 The mRNA expression of di ff erent groups in dura and trigeminal ganglion. *P ＜ 0.01, #P ＜ 0.05. Sham: 7-day saline control group; IS7:7-day in fl ammatory soup group; T3:1.5 g/kg Toutongning group; T4:3.0 g/kg Toutongning group (Table 3).

偏頭痛是一種原發(fā)性反復發(fā)作性的單側，劇烈搏動性頭痛，嚴重影響患者生活質量。其致病機制復雜，研究最深入的是“三叉神經(jīng)血管學說”。該學說認為，三叉神經(jīng)支配區(qū)的三叉神經(jīng)周圍末梢受刺激激活，激活后啟動疼痛傷害感受通路，同時信號逆向傳遞至三叉神經(jīng)末梢，引發(fā)末梢促炎神經(jīng)肽物質的釋放（CGRP, P物質等）[13]，造成神經(jīng)源性炎癥。這些促炎神經(jīng)肽類物質具有擴張局部血管，增加滲透性和激活召集炎性細胞作用，使炎癥反應放大，釋放大量炎性產物（PGE2，緩激肽，5-HT和細胞因子），反復持續(xù)的刺激三叉神經(jīng)周圍感覺神經(jīng)疼痛傷害感受器，引起周圍敏化[14]。由該經(jīng)典理論可知，神經(jīng)源性炎癥在偏頭痛產生的機制中具有重要作用。而IL-1β作為白介素家族細胞因子一員，已經(jīng)被證實在多種炎癥性疾病及炎癥性疼痛中表達顯著增加[15]。而Alessandro 等研究表明：IL-1β 可激活三叉神經(jīng)節(jié)內衛(wèi)星細胞 SGC，使其三叉神經(jīng)元 CGRP 釋放增加，神經(jīng)節(jié)內 CGRP 濃度的升高又再次促進了 SGC 內 IL-1β 在內的細胞因子表達增加，形成了一個正反饋回路[4]。CGRP 則被認為是三叉神經(jīng)傳導頭痛信號通路中主要的神經(jīng)介質。而我實驗室研究隨后證實，IL-1β 在急性炎癥性頭痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)表達顯著增加[12]。因此，IL-1β很可能在偏頭痛產生機制中也扮演重要角色。另一方面，臨床調查顯示：偏頭痛患者和對照組中 IL-1β+3953 C/T 基因型分布的多態(tài)性存在顯著的差異(P= 0.004)，IL-1β +3953 T 等位基因在無先兆性偏頭痛患者中出現(xiàn)頻率顯著高于健康對照組(P= 0.004)[16]。綜上，種種證據(jù)提示，IL-1β 在以神經(jīng)源性炎癥為基礎的偏頭痛的發(fā)展和維持中可能起著重要作用。本實驗采用的偏頭痛大鼠模型基于 augustin 等的偏頭痛模型[11]。該模型基于偏頭痛的三叉血管系統(tǒng)激活與敏化理論，即利用致炎劑(In fl ammation soup, IS)連續(xù) 7 天反復刺激硬腦膜痛覺受體，使三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)反復激活。該模型表現(xiàn)出了與慢性偏頭痛患者近似的癥狀：日常活動減少，靜息活動增加，出現(xiàn)頭面部痛覺過敏現(xiàn)象，曲普坦類藥物可以減少以上變化，且結果穩(wěn)定可重復。因此該模型是目前較好的可模擬反復發(fā)作慢性偏頭痛的重要模型。

表3 各組大鼠硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)IL-1β mRNA表達比較(n=5)Table 3 The relative IL-1β mRNA expression of different groups in dura and trigeminal ganglion (n=5)

在偏頭痛大鼠模型的三叉神經(jīng)節(jié)，IL-1β轉錄翻譯后主要以無活性的前體形式（proIL-1β）存在于三叉神經(jīng)眼支無髓鞘C纖維細胞質中[12,17]。當受到促炎刺激時，細胞質內NALP3被激活，形成具有casepase-1活性的細胞內蛋白復合體，其水解proIL-1β，引發(fā)IL-1β的成熟和分泌[17～19]。并繼而通過與周圍膠質細胞的自分泌和旁分泌通路，強化維持局部炎癥[20]。本實驗顯示：頭痛寧可減少三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元內IL-1β表達，并呈一定的劑量依賴性：0.375 g/kg頭痛寧干預組IL-1β表達未見明顯變化，而0.75 g/kg及以上劑量頭痛寧干預組IL-1β表達則呈現(xiàn)明顯降低。3.0 g/kg頭痛寧干預組與致炎劑7天組相較，神經(jīng)元細胞內點狀免疫熒光明顯減少。本實驗還發(fā)現(xiàn)，3.0 g/kg頭痛寧干預組IL-1β基因的轉錄較致炎劑7天對照組下降，說明頭痛寧可能也可以通過抑制三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞內IL-1β基因的轉錄，減少proIL-1β的存量來下調活性IL-1β的生成和分泌。

硬腦膜主要分布有無髓C纖維痛覺傳導末梢[21]，與其周圍分布的大量免疫細胞群（包括纖維細胞，巨噬細胞，樹突狀細胞，和肥大細胞）具有密切聯(lián)系。這些免疫細胞群可釋放炎癥前細胞因子（包括IL-1β）及神經(jīng)興奮介質，在神經(jīng)源性炎癥產生階段具有重要作用[22]。本實驗發(fā)現(xiàn)，頭痛寧可顯著下調硬腦膜IL-1β蛋白表達，且呈劑量依賴性。同時，頭痛寧也可顯著抑制由硬腦膜反復炎癥刺激引起的IL-1βmRNA表達。由于大鼠硬腦膜極薄，很難進行切片獲得完整的硬腦膜組織熒光染色。國外文獻中有報道用“整體標本準備”（Whole-mount preparation）技術行免疫熒光染色[23]，本實驗室由于相應技術、經(jīng)驗儲備不足，未能成功，因而遺憾未能觀察到硬腦膜IL-1β的組織學定位。盡管如此，我們認為，對于感覺神經(jīng)元，由于其硬腦膜上分布的感覺末梢缺乏游離核糖體和mRNA，不合成蛋白質。因此，本實驗中致炎劑7天組硬腦膜大量表達的成熟IL-1β很可能就是來自于硬腦膜大量免疫細胞群。三叉神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元細胞只占很小比例，而proIL-1β又主要分布于C纖維神經(jīng)元內[12]，所占比例更小。硬腦膜卻分布有大量免疫細胞群。本實驗同組之間硬腦膜與三叉神經(jīng)節(jié)表現(xiàn)出的IL-1β mRNA巨大數(shù)量級差異（見表3）也與我們以上的猜測一致。所以，盡管沒有足夠的組織學支持，我們的研究表明，頭痛寧可能通過抑制硬腦膜免疫細胞群IL-1β基因轉錄而顯著下調了硬腦膜IL-1β的表達。

綜上所述，我們認為頭痛寧抑制硬腦膜及三叉神經(jīng)節(jié)IL-1β基因轉錄從而下調IL-1β表達可能是其治療偏頭痛的機制之一。

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EFFECTS OF TOUTONGNING ON THE EXPRESSION OF IL-1β BOTH IN DURA AND TRIGEMINAL GANGLION IN A MIGRAINE RAT MODEL

JIN Shan-Quan, WANG Cheng-Yun, DONG Xin, CHEN Ke-Yan, ZHANG Xue, WAN Qi△
(Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

Objective:To investigate the e ff ect of Toutongning on the expression of IL-1β (interleukin-1beta)both in dura and trigeminal ganglion of the recurrent migraine rat model.Methods:Totally 60 healthy adult male SD rats were selected. Twenty SD rats were randomly divided into 7-day saline control group and 1, 3, 7-day in fl ammatory soup (IS) groups (5 in each group). The recurrent migraine rat model was created. Twenty- fi ve adult male SD rats were randomized into 7-day IS control group and 0.375 g/kg, 0.75 g/kg, 1.5 g/kg, 3.0 g/kg Toutongning groups (5 in each group). Expression of IL-1β in dura matter and trigeminal ganglion of above was detected by Western blot and quanti fi ed realtime-PCR. At last, fi fteen adult male SD rats were randomized into 7-day saline control group, 7-day IS control group and 3.0 g/kg Toutongning group. Expression of IL-1β in dura matter and trigeminal ganglion of this 3 groups was detected by immuno fl uorescence after being perfused with paraformaldehyde.Results:(1)IL-1β levels of 7-day IS group was significantly higher than that of saline control group both in dura (P＜ 0.01) and trigeminal ganglion (P＜ 0.01). (2) Compared with 7-day IS control group, the expression of IL-1β in dura/trigeminal ganglion sharply decreased in 0.75 g/kg (P＜ 0.01/P＜ 0.01), 1.5 g/kg (P＜ 0.01/P＜ 0.05) and 3.0 g/kg Toutongning group (P＜ 0.01/P＜ 0.01). However, there was no di ff erence in 0.375 g/kg Toutongning group. (3) The number of fl uorescence spots in the neuron plasma of 3.0 g/kg Toutongning group was greatly reduced compared with 7-day IS control group. The immuno fl uorescence of dura was unsuccessful. (4) The IL-1β mRNA levels of 3.0 g/kg Toutongning group was signi fi cantly lower than 7-day IS control group both in dura (P＜ 0.01) and trigeminal ganglion (P＜ 0.05).Conclusion:Toutongning may down-regulate the expression of IL-1β by repressing transcription which may be one of the underlying mechanisms for the treatment of migraine.

Migraine; Toutongning; Dura matter; Trigeminal ganglion; IL-1β

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.03.003

△通訊作者