徐 進，魏開金，徐 濱，馬寶珊，朱祥云

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護重點實驗室，武漢 430223)

克氏原螯蝦對高溫應(yīng)激的生理學(xué)響應(yīng)

徐 進，魏開金，徐 濱，馬寶珊，朱祥云

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護重點實驗室，武漢 430223)

本實驗旨在研究高溫對克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)血液生化指標(biāo)、抗氧化能力以及熱休克蛋白70基因表達的影響。實驗分別采用30 ℃和35 ℃水溫進行高溫應(yīng)激試驗，應(yīng)激前(0 h)和在應(yīng)激后3、6、12、24和48 h分別采集樣本，測定血淋巴液中LDH、GLU、TCHO、TP和TG含量，測定肝胰腺T-AOC、CAT、MDA以及HSP70基因的表達變化。結(jié)果顯示：在高溫應(yīng)激的初級階段(6 h)，克氏原螯蝦血淋巴中的TCHO和LD含量急劇上升，而GLU含量持續(xù)上升到24 h；TG含量在應(yīng)激的初級階段變化不明顯，但在6 h后急速上升，在12 h達到最高后開始回落；TP的含量在初級階段出現(xiàn)下降，然后在12 h恢復(fù)至應(yīng)激前水平。肝胰腺中的MDA含量在應(yīng)激后持續(xù)上升，在24 h后達到最高值，隨后下降至應(yīng)激前水平；T-AOC在應(yīng)激后3 h上升至最高水平，隨后降低；CAT的含量分別在應(yīng)激后6 h和12 h上升至最高值然后回落。HSP70基因在應(yīng)激前未檢測到有表達，高溫應(yīng)激后3 h即可檢測到少量表達，35 ℃組在6 h出現(xiàn)大量表達，并持續(xù)到12 h，隨后24 h降低至無法檢出；而30 ℃組在應(yīng)激 6 h后降低至無法檢出。結(jié)果表明，30 ℃和35 ℃高溫能引起克氏原螯蝦機體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，并對機體的生理機能產(chǎn)生影響。

克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)；高溫應(yīng)激；生化指標(biāo)；抗氧化；熱休克蛋白70

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)又稱小龍蝦、紅色沼澤螯蝦或克氏螯蝦，是我國目前重要的淡水養(yǎng)殖蝦類。近年來，由于克氏原螯蝦國內(nèi)消費激增，市場需求旺盛，促使克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖發(fā)展迅猛，特別是在湖北、安徽、江蘇等地被大規(guī)模人工養(yǎng)殖。統(tǒng)計資料顯示，我國已成為世界最大的克氏原螯蝦生產(chǎn)國，2016年全國克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積超過60萬hm2，總產(chǎn)量達89.91萬t(含捕撈產(chǎn)量)，產(chǎn)值達564.1億元，經(jīng)濟總產(chǎn)值1 466.1億元[1]。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，病害問題也日益嚴重[2-5]。特別是在每年的高溫季節(jié)，病害問題尤為突出，造成巨大的經(jīng)濟損失。疾病的頻發(fā)可能跟環(huán)境應(yīng)激有關(guān)。本文探討了克氏原螯蝦在30℃和35℃的應(yīng)激溫度下機體生理生化指標(biāo)的變化以及熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)基因的表達變化，以揭示高溫應(yīng)激對克氏原螯蝦生理機能的影響，為克氏原螯蝦的健康養(yǎng)殖技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗克氏原螯蝦及其飼養(yǎng)方法

試驗用克氏原螯蝦為捕自武漢市梁子湖的野生克氏原螯蝦，試驗前暫養(yǎng)1周，挑選活力強、無病無傷、規(guī)格基本一致(體重(30±5)g)的克氏原螯蝦用于試驗。養(yǎng)殖用水為曝氣3 d以上的自來水，水溫(25±2) ℃，每日換水一次，暫養(yǎng)期間按蝦體重的5%左右投喂商品蝦料，試驗期間不投喂、不換水。

1.2高溫應(yīng)激試驗

取上述規(guī)格基本一致的克氏原螯蝦，分別采用30 ℃和35 ℃水溫進行高溫應(yīng)激試驗。每個溫度組設(shè)置一個平行組，每組50尾克氏原螯蝦，放于規(guī)格為70 cm×50 cm×40 cm的控溫水箱中，連續(xù)應(yīng)激48 h，實驗期間持續(xù)充氧，并減少人為干擾，避免額外應(yīng)激。

1.3血淋巴液、肝胰腺的采集與指標(biāo)測定

每組分別于應(yīng)激前(0 h)以及應(yīng)激后3、6、12、24、48 h等時間節(jié)點各取3尾蝦，將蝦迅速撈起并于圍心腔抽取0.5 mL血淋巴液，隨即剝開頭胸甲取1 g左右肝胰腺組織。用于測定生理生化指標(biāo)的血淋巴液用同等體積的5%肝素鈉抗凝，并隨后于4 ℃、3 000g離心10 min，留取血漿于-80 ℃保存待測。血淋巴液中的乳酸脫氫酶(LDH)、葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TCHO)、總蛋白(TP)、甘油三酯(TG)等指標(biāo)在希森美康全自動生化分析儀(chemix-800)上測定。肝胰腺組織分2份，一份用于抗氧化酶類指標(biāo)的測定，一份用于分子生物學(xué)測定，均保存于-80 ℃。應(yīng)激相關(guān)酶類指標(biāo)測定時，取出冷凍樣本于冰上解凍后加入適量磷酸緩沖液(PBS，sigma產(chǎn)品)冰浴勻漿，勻漿液于4 ℃、10 000g離心20 min，取上清液于-20 ℃保存待測。肝胰腺中總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)以及丙二醛(MDA)均采用檢測試劑盒測定[6]，上述試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。肝胰腺勻漿液蛋白濃度采用福林酚方法測定，以牛血清白蛋白(BSA)作標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.4肝胰腺HSP70mRNA測定

取約0.1 g在-80 ℃保存的肝胰腺，使用Trizol試劑(Invitrogen公司產(chǎn)品)提取總RNA，參照其說明書進行?？耸显r肝胰腺HSP70 mRNA的測定參照孫勇等的半定量法[7]進行。HSP70擴增引物為PF：5’-GGTGTTGGTGGGAGGGTCTA-3’，PR：5’-GGCTCGCTCTCCCTCATACAC-3’，片段大小343bp；內(nèi)參基因β-Actin擴增引物為Actin F：5’-AGTAGCCGCCCTGGTTGTAGAC-3’，Actin R：5’-TTCTCCATGTCGTCCCAGT-3’，片段大小240 bp。上述引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液為：1 μL Oligo(dT)18引物(0.5 μg/μL)；0.5 μg RNA模板；2 μL dNTPs(10 mmol/L)；4 μL 5×Buffer；1 μL RiboLockTMRNA酶抑制劑(20 U/μL)；1 μL RevertAidTMM-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)；加DEPC水至20 μL。反應(yīng)液混勻后，42 ℃ 60 min；70 ℃ 5 min終止反應(yīng)。PCR擴增采用rTaq酶(Takara)，具體反應(yīng)液為：2 μL cDNA；5 μL 10×Buffer；2 μL dNTPs(10 mmol/L)；正反向引物(10 μmol/L)各1 μL；1 μL rTaq酶(5 U/μL)；加純水至50 μL。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 3 min，變性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，34個循環(huán)后72 ℃延伸5 min，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用GelDoc EQ凝膠成像系統(tǒng)成像分析。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)用SPSS 12.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和DUNCAN多重比較，所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1高溫應(yīng)激對克氏原螯蝦血淋巴液生化指標(biāo)的影響

分別在30 ℃和35 ℃的高溫應(yīng)激下，隨著應(yīng)激時間的延長，克氏原螯蝦血淋巴液中的LDH、GLU、TCHO、TP、TG都有不同程度的變化(見表1)。在30 ℃溫度下，克氏原螯蝦血淋巴液中的LDH含量在3 h后顯著升高，然后逐漸降低，在第48 h后其含量恢復(fù)到應(yīng)激前水平。而在35 ℃高溫應(yīng)激下，血淋巴液中的LDH含量在第6 h后升高到最高點，其升高持續(xù)時間比30 ℃應(yīng)激組長3 h，隨后下降并在48 h后恢復(fù)到應(yīng)激前水平。30 ℃和35 ℃高溫應(yīng)激后6 h，克氏原螯蝦蝦血淋巴液中的TCHO含量均出現(xiàn)上升趨勢，6 h后出現(xiàn)下降趨勢，48 h后恢復(fù)到應(yīng)激前水平，其中30 ℃較35 ℃下降更顯著。血淋巴液中的GLU含量隨著高溫應(yīng)激時間的延長而逐漸升高，30 ℃溫度下在第12 h達到最高點，隨后保持高位濃度；而35 ℃溫度下在第24 h達到最高點，隨后顯著下降。血淋巴液中的TP含量在高溫應(yīng)激后逐漸降低，并在第6 h后達到最低值，隨后出現(xiàn)反彈上升。30 ℃溫度下TP含量在第12 h升高到最高點，與應(yīng)激前水平差異不顯著，隨后變化不顯著；35 ℃溫度下在第24 h升高到最高點，并與應(yīng)激前水平差異不顯著。血淋巴液中的TG含量在高溫應(yīng)激的前6 h變化不明顯，隨后顯著升高并在12 h達到最高點，隨后下降并在48h恢復(fù)到應(yīng)激前水平。

表1 高溫應(yīng)激對克氏原螯蝦血液生化指標(biāo)的影響

注：表中數(shù)值為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=6)。同一行數(shù)據(jù)右上角的不同字母表示DUNCAN多重比較下的差異顯著(P<0.05。表2同)

2.2高溫應(yīng)激對克氏原螯蝦肝胰腺中抗氧化酶的影響

在35 ℃和30 ℃溫度下，隨著時間的延長，克氏原螯蝦肝胰腺的T-AOC、CAT以及MDA等抗氧化相關(guān)指標(biāo)的含量與應(yīng)激前相比都有顯著變化(見表2)。在高溫應(yīng)激試驗的3 h，克氏原螯蝦肝胰腺的T-AOC達到最高，隨后逐漸降低，但35 ℃組降低速度明顯低于30 ℃組，且在第48 h仍未恢復(fù)到應(yīng)激前水平。克氏原螯蝦肝胰腺中CAT的濃度隨著應(yīng)激時間的延長而逐漸增加，其中35 ℃組CAT的濃度于應(yīng)激后12 h達到最高，隨后降低；30 ℃組于應(yīng)激后6 h達到最高，隨后緩慢降低。克氏原螯蝦肝胰腺中MDA的濃度隨著應(yīng)激時間的延長而持續(xù)增加，并于24 h達到最高，隨后快速降低，其中35 ℃組下降速度明顯較30 ℃組快。

2.3高溫應(yīng)激對克氏原螯蝦肝胰腺中HSP70基因表達的影響

如圖1所示，在應(yīng)激前未檢測到有HSP70基因的表達。在35 ℃溫度應(yīng)激下，克氏原螯蝦肝胰腺中HSP70基因在應(yīng)激后3 h即出現(xiàn)少量表達，隨后到6 h出現(xiàn)大量表達，并持續(xù)到12 h，隨后24 h降低至無法檢出。而30 ℃下，克氏原螯蝦肝胰腺中HSP70基因在應(yīng)激后3 h出現(xiàn)少量表達，隨后到6 h后降低至無法檢出。

表2 高溫應(yīng)激對克氏原螯蝦肝胰腺中抗氧化酶的影響

圖1 克氏原螯蝦肝胰腺中HSP70基因在高溫應(yīng)激下的表達變化

3 討論

應(yīng)激是生物適應(yīng)性的一種表現(xiàn)形式，適度的應(yīng)激可增強動物機體對環(huán)境的適應(yīng)能力，而過度的應(yīng)激則會引起機體正常生理功能的紊亂，導(dǎo)致機體免疫力低下進而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[8]。蝦是低等無脊椎動物，其生理功能更容易受到環(huán)境的影響。本研究檢測了高溫飼養(yǎng)條件下，克氏原螯蝦血淋巴液生化指標(biāo)、肝胰腺中抗應(yīng)激相關(guān)酶類以及HSP70基因的表達差異，證實了30 ℃和35 ℃高溫的確能引起克氏原螯蝦機體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。由于克氏原螯蝦的最適生長溫度為21～28 ℃[9]，30 ℃和35 ℃引起的高溫應(yīng)激必定對其機體的生理功能產(chǎn)生一定的影響。

從生理學(xué)的角度，應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)展過程通常分為初級、次級和第三級應(yīng)激反應(yīng)[10]。

初級反應(yīng)主要包括機體對應(yīng)激源的識別及生物防御的啟動，是機體在神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)水平上的反應(yīng)，表現(xiàn)在血淋巴液中的兒茶酚胺和皮質(zhì)醇等應(yīng)激激素水平的升高[11]。本研究中克氏原螯蝦血液中的TCHO水平在高溫應(yīng)激后的前6 h持續(xù)增加，6 h后開始降低，表明應(yīng)激后的6 h為克氏原螯蝦高溫應(yīng)激的初級反應(yīng)階段。

次級反應(yīng)階段是由初級反應(yīng)階段所產(chǎn)生的應(yīng)激激素調(diào)控的一系列生理生化反應(yīng)過程，包括呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、能量代謝、電解質(zhì)平衡以及免疫系統(tǒng)等生物學(xué)功能的改變。此階段機體代謝的一個重要特征是以葡萄糖為代表的能量物質(zhì)的代謝變化以應(yīng)對應(yīng)激[12]。本研究中克氏原螯蝦血淋巴的GLU含量隨著高溫應(yīng)激時間的延長持續(xù)上升，分別在第12 h(30 ℃)和24 h(35 ℃)達到最高值，隨后降低。GLU含量的持續(xù)上升表明機體在應(yīng)激狀態(tài)下需要更多的能量以應(yīng)對應(yīng)激壓力，因此在相關(guān)激素和酶的調(diào)控下加強了GLU的合成。對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的研究表明[13]，皮質(zhì)醇可以增強糖原合成有關(guān)酶的活性，進而大大加強糖原的異生，使血糖升高。LDH是參與糖無氧酵解和糖原異生的重要酶。本研究中，在應(yīng)激反應(yīng)的初級階段，LDH的濃度大幅升高，開始了糖原合成的一系列生化反應(yīng)，最終使克氏原螯蝦機體的血糖濃度持續(xù)增加。除了糖，脂肪和蛋白質(zhì)也是動物能量代謝重要物質(zhì)。TG是脂肪的分解成分，是機體能量的重要來源，本研究中，克氏原螯蝦血液中的TG含量在應(yīng)激的初級階段變化不明顯，但到次級階段后顯著升高并在12 h達到最高點，表明克氏原螯蝦機體為了應(yīng)對應(yīng)激，加速了脂肪的分解以提供能量。TP含量的變化通常反映了機體生理和病理變化。在本研究中，原螯蝦血液中的TP含量在初級階段逐漸降低，推測是由于應(yīng)激引起的蛋白質(zhì)消耗引起的。隨后在次級階段，TP含量開始持續(xù)升高，表明機體的蛋白質(zhì)合成增加，為應(yīng)對應(yīng)激提供各種相關(guān)功能蛋白。

第三級應(yīng)激反應(yīng)是在次級應(yīng)激反應(yīng)的基礎(chǔ)上，要么機體對應(yīng)激源產(chǎn)生了適應(yīng)性，各項生物學(xué)功能恢復(fù)正常，要么因應(yīng)激損傷，個體或群體出現(xiàn)諸如生長速率、繁殖能力及抗病能力降低等變化[8]。研究應(yīng)激對機體生理機能的損傷是揭示應(yīng)激對動物健康影響的重要基礎(chǔ)。由于應(yīng)激能使機體內(nèi)氧自由基增多[14]，過多的氧自由基能攻擊細胞膜中的不飽和脂肪酸，造成脂質(zhì)過氧化，脂質(zhì)過氧化物進一步分解，可產(chǎn)生大量的醛類、醇類和烴類，其中MDA是具有很強生物毒性的物質(zhì)，會對機體造成傷害[15]。而機體抗氧化系統(tǒng)的T-AOC、CAT等酶能清除自由基，減少脂質(zhì)過氧化損傷[16]。本研究對高溫應(yīng)激下克氏原螯蝦肝胰腺的T-AOC、CAT和MDA進行了測定，MDA的濃度隨著應(yīng)激時間的延長而持續(xù)增加，并于24 h達到最高，表明高溫應(yīng)激引起的脂質(zhì)過氧化損傷在持續(xù)增加，同時T-AOC和CAT的含量在高溫應(yīng)激后也快速增加，并在應(yīng)激24 h時仍然高于應(yīng)激前水平，表明機體的抗氧化系統(tǒng)也在持續(xù)工作，使得MDA在高溫應(yīng)激24 h后迅速降低。

HSP70是機體在應(yīng)激狀態(tài)下細胞內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì)，它能清除應(yīng)激所造成的細胞內(nèi)異?；蜃冃缘鞍踪|(zhì)，同時具有活化其他基因的作用，廣泛參與各種保護機體和細胞的功能[17-18]。本研究的結(jié)果顯示，HSP70基因在正常情況下(應(yīng)激前)在細胞中的表達水平低至無法檢出，但在高溫應(yīng)激后3 h即可被檢出，在35 ℃的高溫應(yīng)激下，其表達水平在6 h達到最高并持續(xù)到12 h，隨后24 h降低至無法檢出；而30 ℃下，HSP70基因只在應(yīng)激后3 h出現(xiàn)少量表達，隨后到6 h后降低至無法檢出。這表明30 ℃和35 ℃均能引起機體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)HSP70基因的轉(zhuǎn)錄表達，且35 ℃的應(yīng)激強度比30 ℃強，持續(xù)的時間更長。

綜上所述，30 ℃和35 ℃高溫均能引起克氏原螯蝦機體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，隨著應(yīng)激時間的延長，機體從基因水平、內(nèi)分泌水平以及生理生化水平全方位地協(xié)調(diào)應(yīng)對和消除應(yīng)激的不良影響，使機體免于應(yīng)激損傷。在池塘養(yǎng)殖上，控制養(yǎng)殖水溫是不現(xiàn)實的，那么如何人工干預(yù)和消除高溫應(yīng)激，提高克氏原螯蝦的抗應(yīng)激能力，尚需進一步探討和研究。

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PhysiologicalresponsesofProcambarusclarkiitohightemperaturestress

XU Jin,WEI Kai-jin,XU Bin,MA Bao-shan,ZHU Xiang-yun

(YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,KeyLaboratoryofFreshwaterBiodiversityConservation,MinistryofAgricultureofChina,Wuhan430223，China)

This study was conducted to investigate the effects of high temperature on the biochemistry index,antioxidant activity and theHSP70 gene expression of the Red Swamp CrawfishProcambarusclarkii.The high temperature stress (HTS) experiment was carried out at the temperature of 30 and 35 ℃ respectively.The hemolymph and hepatopancreas were sampled before stress and at 3,6,12,24,48 h post-temperature stress (PTS) which were used for the analyses of lactate dehydrogenase (LD),glucose (GLU),total cholesterol (TCHO),total protein (TP),triglyceride (TG) and total antioxidant capacity (T-AOC),catalase (CAT),malondialdehyde (MDA),heat shock protein 70 (HSP70) gene expression respectively.The results showed that,at the primary stage of HTS (at 6 h PTS),the TCHO and LD concentration of the hemolymph were increased sharply.The concentration of GLU was continuously increased at 24 h PTS.TG had no significant change at the primary stage of HTS but increased sharply at 6 h PTS and reached the highest level at 12 h PTS and then dropped down.TP reduced at the primary stage of HTS and then recovered to the normal level at 12 h PTS.The concentration of MDA in the hepatopancreas was continuously increased post stress and reached the highest level at 24 h PTS,then dropped to the normal level at 48 h PTS.The T-AOC of the hepatopancreas was increased to the highest level at 3 h PTS and then dropped down,and the CAT was increased to the highest level at 6 h and 12 h respectively and then dropped down to the normal level.TheHSP70 mRNA could not be detected before HTS but could be detected at 3 h PTS,and huge expression was detected began at 6 h to 12 h PTS in the 35 ℃ group，while it could not be detected after 6 h PTS in the 30 ℃ group.This study revealed that high temperatures of 30 and 35 ℃ could cause stress and affect the body′s physiological functions ofProcambarus.clarkia.

Red Swamp CrawfishProcambarusclarkia;high temperature stress;biochemistry index;antioxidant activity;HSP70

2017-09-09；

2017-09-10

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費資助(2016HY-ZC02)

徐 進(1982- )，博士，副研究員，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病學(xué)研究。E-mail：xujin@yfi.ac.cn

魏開金。E-mail：weikj@yfi.ac.cn

S917.4

A

1000-6907-(2017)06-0009-05