李大命，張彤晴，關(guān)浩勇，唐晟凱，劉燕山，劉小維，潘建林

(江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210017)

基于線粒體Cytb基因和D-loop區(qū)序列的高郵湖湖鱭(Coilianasus)遺傳多樣性分析

李大命，張彤晴，關(guān)浩勇，唐晟凱，劉燕山，劉小維，潘建林

(江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210017)

本研究利用線粒體細(xì)胞色素b(Cytb)基因和控制區(qū)(D-loop)序列作為分子標(biāo)記，調(diào)查了高郵湖湖鱭(Coilianasus)種群遺傳多樣性。結(jié)果顯示，Cytb基因和D-loop區(qū)序列堿基A+T含量均高于G+C含量，顯示堿基組成具有偏倚性。38條Cytb基因序列檢出26個(gè)變異位點(diǎn)，定義13個(gè)單倍型，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.716±0.078和0.002 70±0.000 57；40條D-loop區(qū)序列檢出53個(gè)變異位點(diǎn)，定義21個(gè)單倍型，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.906±0.034和0.006 27±0.000 99。13個(gè)Cytb基因單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.014之間，NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示單倍型聚為1支；21個(gè)D-loop區(qū)單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.019之間，NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示單倍型聚為2支。中性檢測(cè)結(jié)果和歧點(diǎn)分布圖均表明高郵湖湖鱭種群穩(wěn)定，近期沒(méi)有發(fā)生種群擴(kuò)張。整體來(lái)看，高郵湖湖鱭種質(zhì)資源遺傳多樣性水平較高，具有高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特征。

湖鱭(Coilianasus)；遺傳多樣性；線粒體DNA；細(xì)胞色素b基因；控制區(qū)序列

刀鱭(Coilianasus)是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的洄游性中小型魚(yú)類，隸屬于鯡形目(Clupeiformes)鳀科(Engraulidae)鱭屬(Coilia)。近年來(lái)，由于過(guò)度捕撈、環(huán)境污染及水利工程建設(shè)等因素，刀鱭天然資源趨于枯竭，保護(hù)刀鱭資源刻不容緩[1-4]。湖鱭是刀鱭一種湖泊定居型，它沒(méi)有徊游習(xí)性，在我國(guó)淡水湖泊中廣泛分布，且占漁業(yè)資源量的比重較高，已成為漁業(yè)資源的重要組成部分[5-7]。研究顯示湖鱭和刀鱭在遺傳上沒(méi)有顯著差異，屬于同一種類[8-9]。

遺傳多樣性是生物多樣性的一個(gè)重要方面，決定了物種的進(jìn)化潛能和對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力。掌握物種的遺傳多樣性水平是物種保護(hù)需要了解的重要內(nèi)容，可以為制定針對(duì)性的保護(hù)和管理策略提供科學(xué)依據(jù)。魚(yú)類線粒體DNA是一種閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳、不發(fā)生重組及進(jìn)化速度快等特征，使其成為分子群體遺傳學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)研究的重要分子標(biāo)記[10]。細(xì)胞色素b(Cytochrome b，Cytb) 基因的結(jié)構(gòu)和功能在mtDNA的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中被了解得最為清楚，且其進(jìn)化速度適中[11-12]。線粒體DNA控制區(qū)(D-loop)為非編碼區(qū)，因缺乏編碼的選擇壓力而比其他線粒體基因的進(jìn)化速率更快，富含系統(tǒng)發(fā)育信息[13]。因此，Cytb基因和D-loop區(qū)序已成為魚(yú)類種群遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性研究中常用的2個(gè)分子標(biāo)記。

高郵湖是江蘇省第三大淡水湖、全國(guó)第六大淡水湖，水域面積780 km2。高郵湖具有漁業(yè)生產(chǎn)、工農(nóng)業(yè)及生活用水、航運(yùn)、旅游、泄洪行洪等多種功能[14]。高郵湖有魚(yú)類63種，湖鱭是高郵湖漁業(yè)資源的優(yōu)勢(shì)種類之一。受生態(tài)環(huán)境污染、不合理漁業(yè)生產(chǎn)方式及涉湖、涉漁工程建設(shè)的影響，高郵湖漁業(yè)資源量顯著下降，漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展受到嚴(yán)重威脅[15]。到目前為止，有關(guān)高郵湖魚(yú)類的遺傳學(xué)資料較少。僅有研究者調(diào)查了高郵湖日本沼蝦的遺傳多樣性[16]。已有研究者開(kāi)展了我國(guó)10個(gè)湖鱭地理群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究，其中包括太湖、洞庭湖、鄱陽(yáng)湖及巢湖群體[17]。但到目前為止，尚無(wú)有關(guān)高郵湖湖鱭遺傳多樣性的研究報(bào)道。本研究采用Cytb基因和D-loop區(qū)序列作為分子標(biāo)記，對(duì)高郵湖湖鱭遺傳多樣性開(kāi)展研究，不僅有利于豐富高郵湖魚(yú)類的分子生物學(xué)數(shù)據(jù)，而且可以為湖鱭種質(zhì)資源保護(hù)及合理利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本收集和處理

湖鱭于2016年12月份在高郵湖用刺網(wǎng)捕獲，隨機(jī)取40尾湖鱭樣本，體長(zhǎng)在10.5～24.5 cm之間，平均體長(zhǎng)為16.2 cm；體重在3.5～31.7 g之間，平均體重為16.3 g。用無(wú)水乙醇固定，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

取湖鱭肌肉組織用于基因組DNA提取。采用Takara公司的DNA提取試劑盒提取總DNA，將DNA溶于滅菌超純水，保存于-20 ℃冰箱備用。

擴(kuò)增Cytb基因序列的上游引物為L(zhǎng)14724(5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′)，下游引物為(5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′)[18]；擴(kuò)增D-loop區(qū)序列的上游引物為DF1(5′-CTAACTCCCAAAGCTAGAATTCT-3′)，下游引物為DR2為(5′-ATCTTAGCA TCTTCAGTG 3′)[2]。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR體系均為50 μL，包括2×Taq酶混合液(Taq酶1.25 U，DNTP 0.2 mmol/L，Mg2+L 1.5 mmol/L) 上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，DNA模板1 μL，滅菌超純水22 μL。PCR反應(yīng)條件下如下：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，53 ℃退火(Cytb)或55 ℃退火(D-loop)50 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物與擴(kuò)增引物相同。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用ClustalX1.83軟件[19]對(duì)獲得的Cytb基因和D-loop區(qū)序列進(jìn)行多重比較，并人工校對(duì)。采用Mega 5.1軟件[20]分析序列堿基組成和變異位點(diǎn)，利用Kimura雙參數(shù)(Kimura-2-parameter)模型計(jì)算單倍型之間的遺傳距離，采用鄰接法(Neighbour-joining method，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用DnaSP 5.0軟件[21]獲得群體序列遺傳多樣性參數(shù)，包括單倍型數(shù)、單倍型多樣性(h) 、核苷酸多樣性(π) 和平均核苷酸差異數(shù)(K)。采用Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗(yàn)，同時(shí)結(jié)合核苷酸不配對(duì)分布分析檢驗(yàn)湖鱭種群歷史動(dòng)態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 Cytb基因和D-loop區(qū)序列堿基組成

通過(guò)序列分析，本研究獲得38條Cytb基因全序列，長(zhǎng)度為1 141 bp，共檢出26個(gè)變異位點(diǎn)，其中11個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，15個(gè)單一信息位點(diǎn)，沒(méi)有插入和缺失位點(diǎn)。4種堿基的平均含量分別為：A(27.8%)、T(30.6%)、G(14.5%)和C(27.1%)，A+T的含量(58.4%)高于G+C的含量(41.6%)(表1)。在第2和3位點(diǎn)，堿基G的含量最低，表現(xiàn)出明顯的堿基組成偏向性。

表1 Cytb基因序列堿基組成Tab.1 Base composition of Cytb gene sequence

通過(guò)序列分析，本研究獲得40條D-loop區(qū)序列，其長(zhǎng)度為1 214～1 290 bp，其中25條長(zhǎng)度為1 252 bp，占比62.5%；11條長(zhǎng)度為1 290 bp，占比27.5%；2條長(zhǎng)度為1 328 bp，占比5%；2條長(zhǎng)度為1 214 bp，占比5%。經(jīng)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)D-loop區(qū)序列有4處長(zhǎng)度為38 bp的插入或缺失序列。4種堿基的平均含量分別為：A(33.3 %)、T(33.4%)、G (14.2%)和C(19.1%)，A+T的含量(66.7%)明顯高于G+C的含量(33.3%)，表現(xiàn)出明顯的堿基組成偏向性。D-loop區(qū)序列共檢出53個(gè)變異位點(diǎn)，其中30個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，23個(gè)單一信息位點(diǎn)。

2.2 種群遺傳多樣性參數(shù)

38條Cytb基因序列共定義13個(gè)單倍型(Hb1-Hb13)(GenBank序列號(hào)：MF589305～ MF589317)，單倍型Hb11的數(shù)量最多(20個(gè))，占比52.6%，單倍型H2、H4～H7、H9～H10和H12～H13的數(shù)量均為1個(gè)，占比2.6%，單倍型多樣性為0.716，核苷酸多樣性為0.00216，平均核苷酸差異數(shù)為2.463(表2)。40條D-loop區(qū)序列共定義21個(gè)單倍型(Hd1-Hd21)(GenBank序列號(hào)：MF589318～ MF589338)，單倍型Hd11數(shù)量最多(11個(gè))，占比27.5%，單倍型Hd1～Hd5、Hd9～Hd10和Hd12～Hd21的數(shù)量均為1個(gè)，占比2.5%，單倍型多樣性為0.906，核苷酸多樣性為0.006 27，平均核苷酸差異數(shù)為7.568(表2)。整體來(lái)看，高郵湖湖鱭種群遺傳多樣性呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性特征。

表2 高郵湖湖鱭種群的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity of C.nasus population in Gaoyou Lake

2.3 單倍型系統(tǒng)樹(shù)

基于Kimura 雙參數(shù)模型估算湖鱭單倍型之間的遺傳距離，結(jié)果顯示，Cytb基因單倍型之間的遺傳距離在0.001至0.014之間，D-loop區(qū)序列單倍型之間的遺傳距離在0.001至0.019之間。

以鳳鱭(C.mystus，GenBank登錄號(hào)為KF056322.1)為外群，采用NJ法構(gòu)建單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，Cytb基因單倍型聚為1支(圖1)；D-loop區(qū)序列單倍型聚為2支，其中單倍型Hd7～Hd17聚為1支，單倍型Hd1～Hd6、Hd18～Hd21聚為1支(圖2)。

2.4 種群歷史動(dòng)態(tài)

基于Cytb基因和D-loop區(qū)序列的中性檢驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，Cytb基因的Tajima′sD和Fu′sFs中性檢驗(yàn)產(chǎn)生的D和Fs均為負(fù)值，其中D值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯著(P=0.026)，F(xiàn)s值統(tǒng)計(jì)結(jié)果不顯著(P=0.088)。D-loop區(qū)的Tajima′sD和Fu′sFs中性檢驗(yàn)產(chǎn)生的D為負(fù)值，F(xiàn)s為正值，且統(tǒng)計(jì)結(jié)果均不顯著。另外，Cytb基因和D-loop區(qū)序列核苷酸不配對(duì)分布呈多峰類型(圖3和圖4)。綜合來(lái)看，高郵湖湖鱭種群較為穩(wěn)定，近期內(nèi)沒(méi)有發(fā)生擴(kuò)張事件。

3 討論

遺傳多樣性即基因多樣性，是指種內(nèi)不同群體間或一個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異的總和。

圖1 湖鱭Cytb基因單倍型NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Neighbor-joining molecular dendrogram based on the sequences of Cytb gene of C.nasus in Gaoyou Lake節(jié)點(diǎn)處的數(shù)字為1 000次bootstrap檢驗(yàn)的支持率，圖2同。

圖2 湖鱭D-loop區(qū)序列單倍型NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Neighbor-joining molecular dendrogram based on the sequences of D-loop sequence of C.nasus in Gaoyou Lake

表3 湖鱭種群的中性檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Neutral test of C.nasus population based on Cytb gene and D-loop sequences

圖3 高郵湖湖鱭Cytb基因序列核苷酸歧點(diǎn)分布圖Fig.3 Distribution of pairwise differences for Cytb gene of C.nasus in Gaoyou Lake

圖4 高郵湖湖鱭D-loop區(qū)序列核苷酸歧點(diǎn)分布圖Fig.4 Distribution of pairwise differences for D-loop region of C.nasus in Gaoyou Lake

它不僅是生物多樣性的重要組成部分，而且是物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎(chǔ)，也是生命進(jìn)化和物種進(jìn)化的基礎(chǔ)。一個(gè)物種的遺傳多樣性與其適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力等密切相關(guān)[22-23]。物種的遺傳變異越豐富，對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力越強(qiáng)，反之，更容易受到環(huán)境變化的影響。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量物種遺傳多樣性的2個(gè)常用參數(shù)。本研究采用線粒體Cytb基因和D-loop區(qū)序列作為分子標(biāo)記分析了高郵湖湖鱭的遺傳多樣性。結(jié)果顯示，基于Cytb基因的湖鱭單倍型遺傳多樣性和核苷酸多樣性分別為0.716和0.002 70，基于D-loop區(qū)的湖鱭單倍型遺傳多樣性和核苷酸多樣性分別為0.906和0.006 27，顯示出較高的遺傳多樣性。與基于Cytb基因序列相比，基于D-loop區(qū)序列湖鱭種群的遺傳多樣性相對(duì)較高，這是因?yàn)轸~(yú)類線粒體D-loop區(qū)序列受的選擇壓力較小、進(jìn)化速率快，而Cytb基因作為線粒體編碼基因，其進(jìn)化速度相對(duì)較慢[10]。已有文獻(xiàn)報(bào)道了基于Cytb基因的洞庭湖(h:0.643 3，π:0.002 6)、鄱陽(yáng)湖(h:0.950 0，π:0.003 4)、太湖(h:0.857 0，π:0.002 1)和巢湖(h:0.901 5，π:0.002)湖鱭的遺傳多樣性水平[17]。可以得出，高郵湖湖鱭種群的遺傳多樣性水平高于洞庭湖湖鱭種群，而低于鄱陽(yáng)湖、太湖和巢湖湖鱭種群。因此，高郵湖湖鱭種群的遺傳多樣性可以進(jìn)一步提高。與湖鱭相比較，基于Cytb基因的刀鱭遺傳多樣性高于湖鱭[11]。同樣，基于D-loop區(qū)序列的湖鱭遺傳多樣性也低于刀鱭[2-4]。這是因?yàn)楹q是刀鱭的陸封型群體[9]，由奠基者效應(yīng)(Founder effect)等因素的影響，其遺傳多樣性水平應(yīng)低于刀鱭[11]。

整體來(lái)看，基于Cytb基因和D-loop區(qū)序列高郵湖湖鱭遺傳多樣性呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特征。有研究者根據(jù)單倍型多樣性和核苷酸多樣性標(biāo)準(zhǔn)，將魚(yú)類進(jìn)化情景分為4種類型(低h(<0.5)和低π(<0.005)；高h(yuǎn)和低π；低h和高π；低h和低π)[24]?？梢钥闯?，高郵湖湖鱭遺傳多樣性屬于第2種類型。已有文獻(xiàn)報(bào)道了湖鱭多個(gè)地理種群的遺傳多樣性水平，均具備這一特征[17]。湖鱭種群的遺傳多樣性現(xiàn)狀可能是由一個(gè)較小的有效種群經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)或建群效應(yīng)(bottlenecks or founder events)后迅速增長(zhǎng)，盡管變異導(dǎo)致單倍型的多態(tài)性的積累，但核苷酸序列的多樣化還未能積累造成[24-25]。另外，湖鱭是刀鱭的湖泊定居生態(tài)類型，種群進(jìn)化時(shí)間較短，尚未有效積累更多的遺傳變異。從種群歷史動(dòng)態(tài)來(lái)看，高郵湖湖鱭種群相對(duì)穩(wěn)定，近期沒(méi)有發(fā)生種群擴(kuò)張。

基于Kimura雙參數(shù)模型Cytb基因單倍型之間的遺傳距離在0.001至0.014之間，D-loop區(qū)單倍型之間的遺傳距離在0.001至0.019之間。整體來(lái)看，單倍型之間的遺傳距離較小，說(shuō)明高郵湖湖鱭個(gè)體之間的基因交流不受限制。這是因?yàn)楹q運(yùn)動(dòng)能力較強(qiáng)，個(gè)體間基因交流不存在地理隔離限制。從單倍型組成來(lái)看，13個(gè)Cytb基因單倍型中優(yōu)勢(shì)單倍型Hb11有20個(gè)，占比52.6%；而9個(gè)單倍型(H2、H4～H7、H9～H10和H12～H13)的數(shù)量只有1個(gè)，均占比2.6%。21個(gè)D-loop區(qū)單倍型中優(yōu)勢(shì)單倍型Hd11有11個(gè)，占比27.5%；而17個(gè)單倍型(Hd1～Hd5、Hd9～Hd10和Hd12～Hd21)的數(shù)量只有1個(gè)，均占比2.5%。由此可以看出，湖鱭單倍型組成具有不均勻性。一方面優(yōu)勢(shì)單倍型的個(gè)體適應(yīng)能力強(qiáng)擁有更大的繁殖群體，而低頻率的單倍型則因環(huán)境適應(yīng)能力差則擁有的繁殖群體較小，更容易對(duì)整個(gè)種群的遺傳多樣性造成不利影響。因此，需要持續(xù)加強(qiáng)對(duì)湖鱭種質(zhì)資源保護(hù)力度，通過(guò)控制捕撈強(qiáng)度、改善水體生態(tài)環(huán)境以及加強(qiáng)資源動(dòng)態(tài)變化監(jiān)測(cè)等措施增加湖鱭資源量，提高其遺傳多樣性水平，改善種群遺傳結(jié)構(gòu)，從而有利于湖鱭資源的可持續(xù)發(fā)展。

致謝：感謝江蘇省高寶-邵伯湖漁業(yè)管理委員會(huì)的許飛、王華和袁輝等對(duì)采樣工作的幫助與支持。

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ThegeneticdiveristyofCoilianasuspopulationinGaoyouLakerevealedbymtDNACytbgeneandD-loopsequences

LI Da-ming，ZHANG Tong-qing，GUAN Hao-yong，TANG Sheng-kai，LIU Yan-shan，LIU Xiao-wei，PAN Jian-lin

(FreshwaterFisheriesResearchInstituteofJiangsuProvince；KeyLaboratoryofFisheriesResourcesinInlandWaterofJiangsuProvince，Nanjing210017，China)

Coilianasusis an important commercial fisheries species.In recent decades，the natural resource ofC.nasushas dramatically declined due to multiple factors.In the present study，the genetic diveristy ofC.nasuspopulation in Lake Gaoyou was investigated based on mitochondrial DNA cytochrome b (Cytb) gene and control region (D-loop) sequences.The content of A+T base pairs was higher than that of the C+G base pairs in bothCytbgene andD-loopsequences，which indicating that the base composition is biased.26 variable sites were detected and 13 haplotypes were defined in 38Cytbgene sequences.The haplotype diversity and nucleotide diversity were 0.716 ±0.078 and 0.002 70±0.000 57.53 variable sites were detected and 21 haplotypes were defined in 40D-loopsequences.The haplotype diversity and nucleotide diversity were 0.906±0.034 and 0.006 27±0.000 99.The genetic distance among 13Cytbgene haplotypes varied from 0.001 to 0.014，and all haplotypes clusted one clade in the NJ phylogentic tree.The genetic distance among 21D-loophaplotypes varied from 0.001 to 0.019，and all haplotypes clusted two clades in the NJ phylogentic tree.Neutrality tests and mismatch distribution both indicated that it was stable forC.nasuspopulation in Lake Gaoyou in recent period.As a whole，the genetic diversity ofC.nasusin the Lake Gaoyou is relatively high，and it has the characteristics of high haplotype diversity and low nucleotide diversity.

Coilianasus；geneitc diversity；mitochondrial DNA；Cytbgene；D-loop

2017-07-03；

2017-08-17

江蘇省海洋與漁業(yè)資源環(huán)保項(xiàng)目“江蘇省水生生物資源重大專項(xiàng)(ZYHB16-3)”

李大命(1981- )，男，博士，副研究員，研究方向?yàn)闈O業(yè)資源與環(huán)境。E-mail:ldm8212@126.com

潘建林。E-mail:Jianlinpan2006@126.com

S917.4

A

1000-6907-(2017)06-0003-06