吳雄健++++++鄭虹++++++朱海燕++++++毛忠懿++++++謝軍

[摘要]目的 探討丹參水溶性成分丹酚酸A對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的防治作用及機(jī)制。方法 選取成年健康雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1），每組各12只。除假手術(shù)組外均注射CCl4制作大鼠肝纖維化模型。丹酚酸A組于造模8周后給予丹酚酸A 10 mg/（kg·d）腹腔注射，Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）于造模8周后予以DKK-1和丹酚酸A 10 mg/kg腹腔注射，而假手術(shù)組和模型組均于造模8周后予以等量生理鹽水腹腔注射。給藥治療6周后，處死各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，收集肝右葉中部?jī)蓧K肝組織進(jìn)行檢測(cè)，其中一塊利用10%的甲醛進(jìn)行固定并制備石蠟切片；另一塊置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?，用于分子生物學(xué)檢測(cè)。結(jié)果 經(jīng)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組的α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ蛋白水平顯著高于假手術(shù)組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經(jīng)相應(yīng)的治療之后可以顯著下調(diào)上述指標(biāo)的表達(dá)水平。模型組的α-SMA、MMP-2、TIMP-1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經(jīng)相應(yīng)的治療之后可以顯著下調(diào)上述指標(biāo)的表達(dá)水平。模型組的Gsk3β、β-catenin表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組，β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經(jīng)相應(yīng)的治療之后可以顯著下調(diào)Gsk3β、β-catenin的表達(dá)水平。結(jié)論 丹酚酸A可能是通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路來抑制肝纖維化。

[關(guān)鍵詞]肝纖維化；大鼠；丹參；丹酚酸A

[中圖分類號(hào)] R-332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）10（b）-0004-04

[Abstract]Objective To explore the preventive effect and mechanism of salvianolic acid A of water-soluble component from Salvia miltiorrhiza on hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats.Methods 48 adult male SD rats were selected and randomly divided into the sham group，the model group，the salvianolic acid A group，and the Wnt channel blocker group （DKK-1），with 12 rats in each group.Except the sham group，the CCl4 was injected in other three groups to establish hepatic fibrosis model in rats.In the salvianolic acid A group，10 mg/（kg·d） salvianolic acid A was intraperitoneally injected after 8-week modeling.In the Wnt channel blocker group，the DKK-1 and 10 mg/kg salvianolic acid A were intraperitoneally injected after 8-week modeling.For the sham group and the model group，the same volume of saline was intraperitoneally injected after 8-week modeling.The rats were sacrificed 6 weeks after medications.Two liver tissues from the middle of the right lobe of the liver were collected for test.One of them was fixed with 10% formaldehyde and prepared into paraffin sections.The other one was stored in a refrigerator at -70℃ for molecular biological detection.Results By Western blot detection，the expression of α-SMA，TIMP-1 and Collagen Ⅰ proteins in the model group was significantly higher than that in the sham group，while in the salvianolic acid A group and Wnt channel blocker group，the proteins expression mentioned above could be obviously down-regulated after the corresponding therapy.In the model group，the expression levels of α-SMA，MMP-2，TIMP-1，Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ mRNA were much higher compared with those in the sham group，while in the salvianolic acid A group and the Wnt channel blocker group，these indexes were greatly down-regualted after the related therapy.The Gsk3β and β-catenin expression levels in the model group were much higher than those in the sham group.The β-catenin expression level was extremely higher than that in the sham group.In the salvianolic acid A group and the Wnt channel blocker group，after the corresponding therap，the Gsk3β and β-catenin expression levels could be significantly down-regulated.Conclusion Salvianolic acid A may inhibit hepatic fibrosis by activating Wnt/β-catenin signal pathway.endprint

[Key words]Hepatic fibrosis；Rat；Salvia miltiorrhiza；Salvianolic acid A

肝纖維化是各種慢性肝炎發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)病理階段，嚴(yán)重影響肝臟的功能[1]，因此，采取有效藥物治療手段抑制或逆轉(zhuǎn)肝纖維化至關(guān)重要[2]。肝纖維化的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，涉及多條信號(hào)通路的改變以及多種蛋白表達(dá)水平的變化。研究顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)途徑與肺及腎纖維化的形成密切相關(guān)，但該通路與肝纖維化的關(guān)系尚不明確[3]。本研究利用丹酚酸A對(duì)大鼠肝纖維化模型進(jìn)行干預(yù)治療，觀察丹酚酸A對(duì)四氯化碳（CCl4）致實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝組織表達(dá)的影響，旨在為治療肝纖維化尋求新的治療靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1材料

成年健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠48只，體重200 g左右，均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所提供，許可證號(hào)：SYXK（粵）2016-0165。除假手術(shù)組外，大鼠輪替背部皮下及四肢內(nèi)側(cè)注射40% CCl4橄欖油混懸液3 ml/kg體重，每周2次，共8周，以建立肝纖維化動(dòng)物模型。

1.2方法

1.2.1分組及給藥 造模后8周，對(duì)大鼠實(shí)施隨機(jī)分組，分為假手術(shù)組、模型組、丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1），每組12只，并進(jìn)行不同的處理，各組具體給藥方式如下：假手術(shù)組和模型組單純采用等量生理鹽水腹腔注射；丹酚酸A組于造模8周后予丹酚酸A（蘇州巨能世紀(jì)信息科技有限公司）10 mg/（kg·d）腹腔注射；Wnt通道阻滯劑組（DKK-1，由上海江萊生物科技有限公司提供）于造模8周后予DKK-1和丹酚酸A 10 mg/kg腹腔注射。

1.2.2標(biāo)本采集 給藥治療6周后，處死各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，收集各組肝組織，稱取肝臟濕重，并切取肝右葉中部2塊肝組織進(jìn)行檢測(cè)，其中一塊利用10%的甲醛（上海江萊生物科技有限公司）進(jìn)行固定，制備石蠟切片；另一塊置于-70℃冰箱（由河北國(guó)輝實(shí)驗(yàn)儀器有限公司提供）中保存?zhèn)溆?，用于分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.2.3觀察指標(biāo)與檢測(cè) ①肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)：采用HE染色分析肝纖維化的程度，采用Isak評(píng)分系統(tǒng)對(duì)肝纖維化程度進(jìn)行評(píng)分，采用免疫組化法觀察大鼠肝組織中MMP-2、TIMP-1、Tcf-4、α-SMA的表達(dá)，采用RT-PCR檢測(cè)大鼠肝組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA的表達(dá)情況。②Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)：采用免疫組化法觀察大鼠肝組織中β-catenin的表達(dá)，采用Western-blot檢測(cè)大鼠肝組織中β-catenin蛋白的表達(dá)，采用RT-PCR檢測(cè)大鼠肝組織中GSK-3β、β-catenin、Wntl、Wnt3α、Wntlob mRNA的表達(dá)情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1四組α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ蛋白表達(dá)水平分析

經(jīng)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組的α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ蛋白水平顯著高于假手術(shù)組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經(jīng)相應(yīng)的治療之后可以顯著下調(diào)上述指標(biāo)的表達(dá)水平（圖1）。

2.2各組α-SMA、MMP-2、TIMP-1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表達(dá)水平的比較

模型組的α-SMA、MMP-2、TIMP-1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經(jīng)相應(yīng)的治療之后可以顯著下調(diào)上述指標(biāo)的表達(dá)水平（圖2）。

2.3各組Gsk3β、β-catenin蛋白表達(dá)水平的比較

模型組的Gsk3β、β-catenin表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組，β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經(jīng)相應(yīng)的治療之后可以顯著下調(diào)Gsk3β、β-catenin的表達(dá)水平（圖3）。

3討論

肝病是一種常見疾病，會(huì)對(duì)人體健康造成不同程度的影響。肝纖維化是慢性肝病所共有的病理改變，是肝臟對(duì)慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，被視為各種慢性肝病導(dǎo)致嚴(yán)重后果的共同途徑[4]。如何促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)，是預(yù)防和治療肝硬化的有效方法之一。

丹參是一種臨床應(yīng)用較多的中藥之一，被廣泛應(yīng)用于抗肝纖維化治療之中。丹參中含有的丹酚酸A是丹參的主要水溶性成分之一，在丹參水溶性成分中占有重要地位[5]。研究顯示，丹酚酸A具有很強(qiáng)的抗氧化、抗肝損傷、抗肝纖維化等作用[6]，可以通過清除超氧陰離子和羥自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而減輕肝損傷。魯珽等[7]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，針對(duì)CCl4致大鼠肝纖維化實(shí)施丹酚酸A注射治療效果確切，治療效果顯著優(yōu)于口服50 mg/kg丹酚酸膠囊治療，可以發(fā)揮出更好的抗肝纖維化作用，能夠更好地改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臨床體征，并改善動(dòng)物的肝臟器系數(shù)等指標(biāo)。丹酚酸A可以抑制體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，激活膠原酶，促進(jìn)膠原蛋白降解[8]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，丹酚酸A可降低CCl4慢性中毒大鼠的血清ALT、AST活性和肝組織丙二醛的含量，進(jìn)而從整體上證實(shí)了丹酚酸A有顯著抗脂質(zhì)過氧化肝損傷的作用[9]。另外，丹酚酸A還可降低肝臟羥脯氨酸的含量，減輕肝組織纖維化程度，抑制肝臟Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積，具有顯著的抗肝纖維化作用[10]。丹酚酸A還可以抑制HSC的活化與增殖，減少ECM的合成，阻止肝纖維化的進(jìn)程，因此，丹酚酸A可作為抗肝纖維化治療的有效藥物，丹酚酸A抑制肝星狀細(xì)胞增殖與膠原表達(dá)是其抗肝纖維化的主要作用機(jī)制[11]。通過本次研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Western blot檢測(cè)，模型組α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ蛋白顯著高于假手術(shù)組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經(jīng)相應(yīng)的治療之后可以顯著下調(diào)上述指標(biāo)的表達(dá)水平。肝纖維化的出現(xiàn)是由人體內(nèi)以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解發(fā)生失衡現(xiàn)象所導(dǎo)致，正常情況下，人體的肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)在合成以及降解方面處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)[12]，其中，肝星狀細(xì)胞是合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源，在一定情況下，肝臟受損之后，肝星狀細(xì)胞便會(huì)發(fā)生一定的變化，被激活或轉(zhuǎn)分化為肌纖維母細(xì)胞[13]，進(jìn)而表達(dá)大量的α-SMA及細(xì)胞珠蛋白，并分泌出大量的細(xì)胞外基質(zhì)；同時(shí)，其可以通過正反饋的方式，對(duì)肌纖維母細(xì)胞的增殖產(chǎn)生明顯的調(diào)節(jié)作用[14]，而且在合成細(xì)胞外基質(zhì)的同時(shí)，肝星狀細(xì)胞也會(huì)分泌大量對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生降解作用的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）[15]。本次研究結(jié)果還顯示，模型組α-SMA、MMP-2、TIMP-1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經(jīng)相應(yīng)的治療之后可以顯著下調(diào)上述指標(biāo)的表達(dá)水平；模型組Gsk3β、β-catenin表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組，β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經(jīng)相應(yīng)的治療之后可以顯著下調(diào)Gsk3β、β-catenin的表達(dá)水平，提示丹酚酸A在治療β肝纖維化的過程中，發(fā)揮相關(guān)作用的機(jī)制可能是通過對(duì)經(jīng)典的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路予以抑制，進(jìn)而促使肝星狀細(xì)胞增殖水平的下降，以及細(xì)胞外基質(zhì)降解的增加來予以實(shí)現(xiàn)[16]。endprint

綜上所述，通過本次研究，從組織水平、蛋白水平和基因水平證實(shí)丹酚酸A可能是通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路來抑制肝纖維化，從而為利用丹酚酸A治療肝纖維化提供新的治療靶點(diǎn)，為丹酚酸A在肝纖維化中的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]李書，陶艷艷，王清蘭，等.丹酚酸B對(duì)纖維化大鼠腎素血管緊張素系統(tǒng)的影響[A]//中華醫(yī)學(xué)會(huì)第三次全國(guó)肝纖維化、肝硬化學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C].2012：151.

[2]魯珽，陳方明，朱科燕，等.注射用丹酚酸A防治肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2014，24（7）：57-62.

[3]王曉檸，胡義揚(yáng)，劉成海，等.丹酚酸B鹽對(duì)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1及其受體蛋白表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2005，3（4）：286-289.

[4]劉建國(guó)，丁艷蕊，楊勝蘭，等.丹酚酸B對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝組織CD14表達(dá)的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31（4）：547-551.

[5]王育紅，宋明，李時(shí)，等.丹酚酸B對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的防治作用[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2014，24（2）：24-28.

[6]Zhang Y，Xie Y，Gao Y，et al.Multitargeted inhibition of hepatic fibrosis in chronic iron-overloaded mice by Salvia miltiorrhiza[J].J Ethnopharmacol，2013，148（2）：671-681.

[7]魯珽，朱科燕，陳方明，等.注射用丹酚酸A抗四氯化碳致大鼠肝纖維化的作用[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2014，34（4）：272-277.

[8]Parajuli DR，Park EJ，Che XH，et al.PF2401-SF，standardized fraction of Salvia miltiorrhiza，induces apoptosis of activated hepatic stellate cells in vitro and in vivo[J].Molecules，2013，18（2）：2122-2134.

[9]Rui W，Xie L，Liu X，et al.Compound Astragalus and Salvia miltiorrhiza extract suppresses hepatocellular carcinoma progression by inhibiting fibrosis and PAI-1 mRNA transcription[J].J Ethnopharmacol，2014，151（1）：198-209.

[10]徐晨光，閆潔，陳藍(lán)羽，等.丹參有效成分抗肝纖維化作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2013，6（4）：305-308.

[11]魯珽，朱科燕，陳方明，等.注射用丹酚酸A抗四氯化碳致大鼠肝纖維化的作用[A]//華東地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)學(xué)術(shù)交流會(huì)[C].2014：216.

[12]王文祥.丹參抗肝纖維化有效部位化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25（6）：789-791.

[13]Parajuli DR，Zhao YZ，Jin H，et al.Anti-fibrotic effect of PF2401-SF，a standardized fraction of Salvia miltiorrhiza，in thioacetamide-induced experimental rats liver fibrosis[J].Arch Pharm Res，2015，38（4）：549-555.

[14]朱云清，宗偉，郭雪艷，等.丹參多酚酸鹽注射液與替比夫定對(duì)比治療慢性乙型肝炎肝纖維化63例[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2012，41（7）：873-875.

[15]張清.逍遙散加丹參和鱉甲聯(lián)合恩替卡韋對(duì)慢性乙型肝炎肝纖維化患者的臨床療效[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12（21）：135-138，149.

[16]馬建紅，王霞，貢桂英，等.丹參強(qiáng)肝膠囊治療慢性乙型病毒性肝炎肝纖維化54例療效觀察[J].河北中醫(yī)，2015， 37（3）：342-344.endprint