于澤奇 衣泰龍 涂悅 楊小颯 江繼鵬 董曉煜 張賽 程世翔

·基礎(chǔ)研究·

RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡在C57BL/6小鼠顱腦創(chuàng)傷模型中的作用

于澤奇1衣泰龍2涂悅2楊小颯2江繼鵬2董曉煜3張賽2程世翔2

目的 探討受體相互作用蛋白3（RIP3）介導(dǎo)的壞死性凋亡在C57BL/6小鼠顱腦創(chuàng)傷（TBI）模型中的作用及其機(jī)制。 方法 采用電子控制性皮質(zhì)撞擊儀（CCI），設(shè)定打擊參數(shù)（速度5 m/s、時(shí)間120 ms、深度1 mm），對(duì)小鼠頂葉大腦皮質(zhì)進(jìn)行精確撞擊，建立顱腦創(chuàng)傷模型。將80只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組，每組20只：Ctrl組不予處理，Sham組僅開骨窗，TBI組CCI打擊后原位注射4 μl的DMSO，GSK’872組CCI打擊后原位注射4 μl的 GSK’872。再采用改良型神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS）量表評(píng)估小鼠顱腦創(chuàng)傷后損傷程度，腦干濕比重法檢測(cè)顱腦創(chuàng)傷后腦水腫程度，HE染色法檢測(cè)小鼠腦皮層及海馬區(qū)損傷程度，以創(chuàng)傷后覺醒時(shí)間評(píng)價(jià)損傷后恢復(fù)情況，Western blot法檢測(cè)RIP3/RIP1/混合連接激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白 （MLKL）、Akt/p-Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 （mTOR）/p-mTOR、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8（Caspase-8）/X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)、Caspase-1/核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果 與TBI組相比，GSK’872 可明顯降低 mNSS 評(píng)分 [1 d：（11.95±1.50） vs （13.05±1.82），t=2.084，P＜0.05；3 d：（8.95±1.39） vs （11.00±2.10），t=3.634，P＜0.01；5 d：（6.75±1.33） vs （8.90±1.52），t=4.759，P＜0.01；7 d：（4.00±1.08） vs （7.15±1.09），t=9.200，P＜0.01]， 同時(shí)可明顯減輕腦水腫 程度 [（77.91±0.84）%vs（80.34±0.94）%，t=8.692，P＜0.01]，減輕皮層及海馬區(qū)損傷程度，并促進(jìn)創(chuàng)傷后覺醒[（4.08±0.63） h vs（5.11±0.74） h，t=4.717，P＜0.01]。 Western blot結(jié)果顯示， 與 TBI組相比， 應(yīng)用 GSK’872 后能降低RIP3[（0.70±0.03） vs （1.04±0.04），t=13.051，P＜0.01]、RIP1[（0.93±0.02） vs （1.16±0.03），t=11.203，P＜0.01]、MLKL[（0.75±0.04） vs （1.03±0.03），t=9.873，P＜0.01]、Akt[（0.55±0.04） vs （0.77±0.05），t=6.278，P＜0.01]、p-Akt[（0.80±0.04） vs（0.99±0.04），t=6.217，P＜0.01]、mTOR[（0.48±0.05） vs （0.90±0.05），t=10.608，P＜0.05]、p-mTOR[（0.59±0.06） vs（1.00±0.05），t=9.144，P＜0.01]、Caspase-1[（0.80±0.04） vs（0.98±0.05），t=5.226，P＜0.01]、NLRP3[（0.51±0.03） vs （0.89±0.03），t=15.590，P＜0.01]、XIAP[（0.50±0.03） vs（0.83±0.03），t=13.340，P＜0.01] 蛋白表達(dá)， 并可促進(jìn) Caspase-8 持續(xù)升高 [（0.83±0.03） vs（0.71±0.03），t=5.044，P＜0.01]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡在小鼠顱腦創(chuàng)傷中起重要作用，應(yīng)用GSK’872可減輕小鼠顱腦創(chuàng)傷后的損傷程度，提示RIP3有可能成為將來(lái)臨床上治療顱腦創(chuàng)傷新的靶點(diǎn)。

受體相互作用蛋白3； 顱腦創(chuàng)傷； 壞死性凋亡

顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）是一種破壞性極強(qiáng)的神經(jīng)外科常見疾病，是指外源性機(jī)械力作用于顱腦導(dǎo)致的非退行性、非先天性的腦損傷[1]。TBI的病理生理過程包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷：前者是由直接外力沖擊大腦所致，發(fā)生在損傷中心區(qū)；后者在損傷中心區(qū)周圍，在傷后數(shù)秒、數(shù)分鐘，甚至持續(xù)數(shù)天延遲性發(fā)生。繼發(fā)性損傷加劇了TBI誘導(dǎo)的腦組織損傷、神經(jīng)細(xì)胞死亡、炎癥反應(yīng)及神經(jīng)功能損害。因此，對(duì)其信號(hào)靶點(diǎn)和通路進(jìn)行干預(yù)，可有望降低TBI后的損害程度[2]。

壞死性凋亡是近期發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞死亡形式，參與多種疾病的發(fā)展進(jìn)程，比如細(xì)菌感染，胰腺炎，動(dòng)脈粥樣硬化，腦、心肌、腸道炎癥等[3-8]。其中受體相互作用蛋白 3（receptor-interacting protein3，RIP3）是細(xì)胞壞死的開關(guān)分子，在壞死性凋亡途徑中發(fā)揮重要作用[9]。近年來(lái)，研究表明RIP3可不依賴于RIP1而獨(dú)自引起壞死性凋亡的發(fā)生，并誘導(dǎo)混合連接激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）磷酸化，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變，甚至細(xì)胞膜破裂[10]。另一方面，GSK’872是RIP3的特異性抑制劑，研究表明GSK’872可有效地抑制壞死性凋亡的發(fā)生[11,12]。但壞死性凋亡與顱腦創(chuàng)傷之間的詳細(xì)機(jī)制仍未完全清楚，因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用電子控制性皮質(zhì)撞擊儀 （controlled coctical impactor，CCI）建立小鼠顱腦創(chuàng)傷模型，以探討RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡在顱腦創(chuàng)傷中的作用及其機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性C57BL/6小鼠80只 （動(dòng)物合格證號(hào)：0002284），購(gòu)自解放軍醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，8～12 周齡，體質(zhì)量（20±5）g，于溫度 20～25 ℃、濕度（60±5）%條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)分為4組，每組20只：Ctrl組 （不予處理）；Sham 組（僅開骨窗）；TBI組[開骨窗，予以 CCI打擊，并在原位注射4 μl的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）]，GSK’872 組（開骨窗，予以 CCI打擊，并在原位注射 4 μl的 GSK’872，濃度為25 mmol/l，用 DMSO 溶解）。

二、儀器與試劑

電子控制性皮質(zhì)撞擊儀（eCCI-6.3，美國(guó)Custom Design&Fabrication公司），小鼠立體定向儀（深圳瑞沃德生命科技有限公司），HE染色試劑 （上海博谷生物科技有限公司），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（AI600，美國(guó)GE 公司）， 兔抗小鼠 RIP3、RIP1、MLKL、Akt、p-Akt、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-mTOR、X 連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-1）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain receptor protein 3，NLRP3）和 3-磷酸-甘油醛脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗（美國(guó)Abcam公司），羊抗小鼠Caspase-8一抗（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體（美國(guó)KPL公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊 IgG 抗體（美國(guó) KPL公司），GSK’872（美國(guó)Millipore公司）。

三、建立C57BL/6小鼠顱腦創(chuàng)傷模型

使用5%水合氯醛（0.01 ml/g）腹腔注射麻醉小鼠，置于立體定向儀上，于無(wú)菌條件下切開頭皮，暴露右頂骨。前囟人字縫尖連線中點(diǎn)偏右2 mm顱鉆鉆孔，直徑3.5 mm，暴露完整硬腦膜后開始打擊。設(shè)置CCI損傷參數(shù)：3 mm打擊帽，打擊臂與垂直方向角度20°，打擊速率為 5 m/s，打擊深度為1 mm，打擊最低點(diǎn)持續(xù)時(shí)間為120 ms。CCI致傷后，觀察小鼠是否有呼吸異常，若有則給予小動(dòng)物呼吸機(jī)維持通氣，若無(wú)則直接縫合頭皮。

四、小鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分

由于不清楚實(shí)驗(yàn)情況，經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的老師參照改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分表（modified neurological severity scores，mNSS） 對(duì) CCI損傷后 1、3、5、7 d 小鼠進(jìn)行功能評(píng)定，包括提尾試驗(yàn)、行走測(cè)試、感覺試驗(yàn)、平衡木試驗(yàn)、反射缺失和不正常運(yùn)動(dòng)[13]。

五、小鼠腦組織含水量測(cè)定

在CCI損傷后24 h將小鼠斷頭處死，開顱取腦，吸干表面水分，將腦組織放在烘烤過的錫紙上稱重（即濕重），再置于100℃恒溫干燥箱內(nèi)烘烤24 h至恒重，取出稱重（即干重）。按公式計(jì)算小鼠腦含水量變化，腦組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

六、HE染色

小鼠經(jīng)CCI損傷后24 h，用5%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌注固定后，取腦組織，切取合適部位約1 cm，用4%多聚甲醛固定24 h以上。經(jīng)漂洗、脫水、透明、浸泡等步驟處理后，切成5 μm厚的切片。再烤干、脫蠟、浸水等步驟處理后，用蘇木素和伊紅分別染色。染色結(jié)束后，經(jīng)75%、85%、95%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片，室溫保存。

七、覺醒時(shí)間

將CCI損傷后小鼠置于室溫下，記錄Ctrl組、Sham組、TBI組、GSK’872組小鼠覺醒時(shí)間。

八、Western blot

采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取各組等量蛋白行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉(zhuǎn)至硝酸纖維素 （nitrocellulose filter membrane，NC）膜，用含 5%脫脂奶粉的 TBST進(jìn)行封閉1 h。再分別加入兔抗小鼠RIP3、RIP1、MLKL、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、XIAP、Caspase-1、NLRP3一抗（稀釋比例均為 1∶1 000），羊抗小鼠 Caspase-8一抗 （稀釋比例 1∶1 000），4℃孵育過夜。 轉(zhuǎn)天用TBST洗膜5次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、兔抗羊二抗（稀釋比例均為1∶10 000），室溫?fù)u床孵育 1 h，再用 TBST洗膜 5次，每次5 min。將ECL發(fā)光液覆蓋在NC膜上，用GE化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行采集。內(nèi)參為GAPDH。使用ScnImage軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的條帶比值代表目的蛋白的表達(dá)水平。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較行非配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠神經(jīng)功能缺陷情況

Ctrl組與Sham組基本完全正常；TBI損傷后小鼠行走異常，平衡功能、感覺功能異常，mNSS評(píng)分明顯升高。GSK’872組較TBI組mNSS評(píng)分明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1 d：t=2.084，P＜0.05；3 d：t=3.634，P＜0.01；5 d：t=4.759，P＜0.01；7 d：t=9.200，P＜0.01），且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，效果逐漸明顯（圖 1）。

二、小鼠腦組織含水量測(cè)定

Ctrl組腦含水量為 （76.27±1.09）%，Sham 組為（76.07±1.37）%，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.502，P＞0.05）；與Sham組相比，TBI組腦含水量顯著上升[（80.34±0.94）%vs（76.07±1.37）%，t=11.370，P＜0.01]，而應(yīng)用GSK’872后，腦含水量與TBI組相比顯著下降[（77.91±0.84）%vs（80.34±0.94）%，t=8.692，P＜0.01]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖1 小鼠神經(jīng)功能缺陷情況

圖2 小鼠腦組織含水量比較

三、HE染色檢查腦組織損傷程度

Ctrl組和Sham組皮層及海馬區(qū)結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，胞質(zhì)豐富，未見損傷灶；而CCI損傷后，TBI組皮層和海馬區(qū)可見不同程度損傷，紅細(xì)胞聚集、腦組織結(jié)構(gòu)松散、胞體明顯縮小變形、胞核模糊不清晰、神經(jīng)元細(xì)胞空泡化等。而與TBI組相比，應(yīng)用GSK’872后，神經(jīng)細(xì)胞核固縮及空泡化程度有所減輕，紅細(xì)胞數(shù)目也有所下降，表明應(yīng)用RIP3特異性抑制劑GSK’872對(duì)于小鼠顱腦創(chuàng)傷后具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用（圖3）。

四、小鼠覺醒時(shí)間

Ctrl組小鼠覺醒時(shí)間為（2.99±0.63） h，Sham 組為（3.04±0.64） h，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.252，P＞0.05）；與Sham組相比，TBI后小鼠覺醒時(shí)間顯著增長(zhǎng)[（5.11±0.74） h vs （3.04±0.64） h，t=9.534，P＜0.01]，而應(yīng)用GSK’872后，小鼠覺醒時(shí)間與TBI組相比明顯縮短[（4.08±0.63） h vs （5.11±0.74） h，t=4.717，P＜0.01]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。研究結(jié)果表明，顱腦創(chuàng)傷后應(yīng)用RIP3特異性抑制劑GSK’872能夠有效促進(jìn)覺醒。

五、Western blot結(jié)果

與Sham組相比，CCI損傷后 6 h的 TBI組RIP3、RIP1、MLKL 表達(dá)顯著升高[RIP3：（1.04±0.04）vs（0.60±0.02），t=18.660，P＜0.01；RIP1：（1.16±0.03）vs （0.68±0.05），t=15.002，P＜0.01；MLKL：（1.03±0.03）vs （0.40±0.03），t=25.864，P＜0.01]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而應(yīng)用 GSK’872 后，與 TBI相比，RIP3、RIP1、MLKL表達(dá)量均有所下降，分別為 [RIP3：（0.70±0.03） vs （1.04±0.04），t=13.051，P＜0.01；RIP1：（0.93±0.02） vs （1.16±0.03），t=11.203，P＜0.01；MLKL：（0.75±0.04） vs （1.03±0.03），t=9.873，P＜0.01]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）。

與Sham組相比，CCI損傷后6 h的TBI組Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 表達(dá)顯著升高 [Akt：（0.77±0.05） vs（0.53±0.05），t=6.065，P＜0.01；p-Akt：（0.99±0.04）vs （0.40±0.05），t=17.401，P＜0.01；mTOR：（0.90±0.05）vs （0.45 ±0.04），t=12.902，P ＜0.01；p-mTOR：（1.00 ±0.05）vs （0.75±0.05），t=6.232，P＜0.01]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而應(yīng)用GSK’872后，與 TBI相比，Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表達(dá)量均有所下降，分別為[Akt：（0.55±0.04） vs （0.77±0.05），t=6.278，P＜0.01；p-Akt：（0.80±0.04） vs（0.99±0.04），t=6.217，P＜0.01；mTOR：（0.48±0.05） vs （0.90±0.05），t=10.608，P＜0.05；p-mTOR：（0.59±0.06） vs （1.00±0.05），t=9.144，P＜0.01]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6）。

圖3 小鼠腦組織HE染色（×400）

圖4 小鼠CCI損傷后覺醒時(shí)間比較

圖5 受體相互作用蛋白3、受體相互作用蛋白1、混合連接激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白表達(dá)變化

與Sham組相比，CCI損傷后 6 h的TBI組Caspase-8 表達(dá)顯著升高[（0.71±0.03） vs （0.46±0.03），t=9.989，P＜0.01]，XIAP 表達(dá)顯著下降 [（0.83±0.03）vs （0.97±0.03），t=5.831，P＜0.01]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而應(yīng)用GSK’872后，與TBI組相比，Sham組的Caspase-8 表達(dá)持續(xù)升高[（0.83±0.03） vs （0.71±0.03），t=5.044，P＜0.01]，XIAP 表達(dá)持續(xù)下降 [（0.50±0.03） vs（0.83±0.03），t=13.340，P＜0.01]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 7）。

圖 6 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 蛋白表達(dá)變化

與Sham組相比，CCI損傷后 6 h的 TBI組Caspase-1、NLRP3 表達(dá)顯著升高 [Caspase-1：（0.98±0.05） vs （0.70±0.05），t=7.186，P＜0.01；NLRP3：（0.89±0.03） vs （0.43±0.03），t=18.28，P＜0.01]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而應(yīng)用GSK’872后，與 TBI相比，Caspase-1、NLRP3表達(dá)量均有所下降，分別為[Caspase-1：（0.80±0.04） vs （0.98±0.05），t=5.226，P＜0.01；NLRP3：（0.51±0.03） vs （0.89±0.03），t=15.590，P＜0.01]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 8）。

討 論

顱腦創(chuàng)傷通過原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷導(dǎo)致腦組織結(jié)構(gòu)破壞及功能障礙。目前人們普遍認(rèn)為，壞死性凋亡在其中起到重要作用[14]。RIP3是調(diào)控壞死性凋亡的關(guān)鍵分子，而MLKL更是導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂的重要執(zhí)行者[15,16]。另外，RIP3和RIP1可形成壞死小體，并通過一系列壞死過程導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17]。此外，RIP3特異性抑制劑GSK’872能夠在某些情況下對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)性作用[18,19]。因此，筆者在小鼠顱腦創(chuàng)傷模型中應(yīng)用RIP3特異性抑制劑GSK’872，結(jié)果顯示，GSK’872能夠有效降低RIP3/RIP1/MLKL信號(hào)表達(dá)，降低小鼠CCI損傷后的腦組織損傷程度，促進(jìn)創(chuàng)傷后覺醒，減輕水腫程度等，這表明RIP3特異性抑制劑GSK’872能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元壞死，這為臨床上治療顱腦創(chuàng)傷提供了寶貴依據(jù)。

圖7 Caspase-8、XIAP蛋白表達(dá)變化

圖8 Caspase-1、NLRP3蛋白表達(dá)變化

Akt一直被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)控神經(jīng)元存活的關(guān)鍵分子，mTOR是Akt的下游分子，在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)[20,21]。有研究指出，應(yīng)用Akt和mTOR的特異性抑制劑能夠減少小鼠CCI模型中的細(xì)胞死亡，表明Akt/mTOR可能參與顱腦創(chuàng)傷后細(xì)胞壞死性凋亡途徑中[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)顱腦創(chuàng)傷能夠誘導(dǎo)Akt和mTOR的磷酸化，并進(jìn)一步導(dǎo)致壞死性凋亡的發(fā)生，而此過程可被RIP3特異性抑制劑GSK’872抑制，表明RIP3參與到Akt/mTOR信號(hào)途徑中，并可對(duì)其進(jìn)行調(diào)控。

Caspase-8在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及保護(hù)免受腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死過程中起重要作用[24]。研究表明，Caspase-8可通過蛋白酶剪切RIP1，并抑制RIP1對(duì)于TNF誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子kappa B途徑的激活，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑[25]。而Caspase-8的缺乏或抑制又可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)以及壞死性凋亡的發(fā)生[26]。但Caspase-8是否在凋亡或壞死性凋亡途徑中起到重要作用目前還是有爭(zhēng)議的。本研究表明，在顱腦創(chuàng)傷發(fā)生時(shí)，Caspase-8表達(dá)上調(diào)，而XIAP表達(dá)減少。然而應(yīng)用RIP3特異性抑制劑 GSK’872不僅抑制了 RIP1/RIP3/MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡，同時(shí)明顯地上調(diào)了Caspase-8介導(dǎo)的凋亡途徑，這表明應(yīng)用RIP3特異性抑制劑GSK’872可以阻斷顱腦后壞死性凋亡的發(fā)生，并部分扭轉(zhuǎn)到凋亡途徑，與以往的研究不同，導(dǎo)致這種現(xiàn)象發(fā)生的原因可能是，在以往研究中壞死性凋亡可能被完全抑制，或者實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒⒉皇悄M自然的顱腦創(chuàng)傷過程[27]。

眾所周知，炎癥反應(yīng)常常導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而近年的研究表明，在許多炎癥疾病中都有壞死性凋亡途徑的發(fā)生[28-30]。RIP3可特異性激活NLRP3，并進(jìn)一步促進(jìn)Caspase-1的活化，從而形成炎性體，并最終促進(jìn)促炎因子白細(xì)胞介素1β的分泌，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[31]。在本研究中，CCI損傷導(dǎo)致NLRP3和Caspase-1顯著升高，而應(yīng)用RIP3特異性抑制劑GSK’872后，Caspase-1顯著降低，而NlLRP3相對(duì)于Ctrl組及Sham組而言仍然偏高。這些研究結(jié)果揭示，通過調(diào)控RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡可調(diào)節(jié)腦損傷后的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡在小鼠顱腦創(chuàng)傷模型中起重要作用，而應(yīng)用RIP3特異性抑制劑GSK’872，可通過調(diào)控 RIP3/RIP1/MLKL復(fù)合體，Akt/mTOR信號(hào)途徑有效阻斷壞死性凋亡，并部分扭轉(zhuǎn)成凋亡途徑。由此表明通過控制或抑制顱腦創(chuàng)傷早期的壞死性凋亡可有效減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷程度以及隨后的炎癥反應(yīng)。但顱腦創(chuàng)傷后凋亡、壞死性凋亡以及炎癥之間關(guān)系究竟如何，還有待進(jìn)一步研究，這將為臨床上治療顱腦創(chuàng)傷提供新的理論依據(jù)和目標(biāo)靶點(diǎn)。

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2017-05-08）

（本文編輯：張麗）

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Effects of necroptosis induced by receptor interacting-protein 3 in traumatic brain injury model of C57/BL mice

Yu Zeqi1,Yi Tailong2,Tu Yue2,Yang Xiaosa2,Jiang Jipeng2,Dong Xiaoyu3,Zhang Sai2,Cheng Shixiang2.1First Department of Surgery,the Chengdu Hospital of Sichuan Armed Police Corps,Chengdu 610041,China;2Neurology and Neurosurgery Hospital,Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People’s Armed Police Force,Tianjin 300162,China;3Medical Unit of Three Department of Beijing Armed Police Corps,Beijing 100621,China
Corresponding author:Cheng Shixiang,Email:shixiangcheng@vip.126.com

ObjectiveTo investigate the effects of necroptosis induced by receptor interacting- protein 3(RIP3)on traumatic brain injury(TBI)model of C57BL/6 mice and its mechanisms.MethodsC57BL/6 mice were positioned beneath the controlled cortical impactor device(CCI)and subjected to impact injury at 1 mm depth of penetration,for a sustained depression of 120 msec and a velocity of 5 m/s.Ctrl group was not treated.Sham group was

craniotomy,without CCI injury.TBI group was received CCI injury and 4 μl DMSO injected.GSK’872 group was received CCI injury and 4 μl GSK’872 injected.Then,the degree of injury was detected by modified neurological severity scores(mNSS),the degree of brain edema was measured with drying wet method,the injure degree of cortex and hippocampus was assessed by HE staining,the recovery after CCI was measured by awakening time and the expressions of RIP3/RIP1/MLKL,Akt/p-Akt/mTOR/p-mTOR,Caspase-8/XIAP,Caspase-1/NLRP3 were detected by Western blot assay.ResultsCompared with TBI group,GSK’872 could significantly decrease the score of mNSS[1 d:(11.95±1.50)vs(13.05±1.82),t=2.084,P＜0.05;3 d:(8.95±1.39)vs(11.00±2.10),t=3.634,P＜0.01:5 d:(6.75±1.33)vs(8.90±1.52),t=4.759,P＜0.01;7 d:(4.00±1.08)vs(7.15±1.09),t=9.200,P＜0.01],decrease the degree of brain edema[(77.91±0.84)%vs(80.34±0.94)%,t=8.692,P＜0.01],reduce the degree of injury in cortex and hippocampus,and promote the awaking of mice after CCI[(4.08±0.63)h vs (5.11±0.74)h,t=4.717,P＜0.01].Furthermore,Western blotting assay reveled that GSK’872 could significantly decrease the levels of RIP3[(0.70±0.03)vs(1.04±0.04),t=13.051,P＜0.01],RIP1[(0.93±0.02)vs(1.16±0.03),t=11.203,P＜0.01],MLKL[(0.75±0.04)vs(1.03±0.03),t=9.873,P＜0.01],Akt[(0.55±0.04)vs(0.77±0.05),t=6.278,P＜0.01],p-Akt[(0.80±0.04)vs(0.99±0.04),t=6.217,P＜0.01],mTOR[(0.48±0.05)vs(0.90±0.05),t=10.608,P＜0.05],p-mTOR[(0.59±0.06)vs(1.00±0.05),t=9.144,P＜0.01],Caspase-1[(0.80±0.04)vs(0.98±0.05),t=5.226,P＜0.01],NLRP3[(0.51±0.03)vs(0.89±0.03),t=15.590,P＜0.01],XIAP[(0.50±0.03)vs(0.83±0.03),t=13.340,P＜0.01],but increase the level of Caspase-8 compared with TBI group[(0.83±0.03)vs(0.71±0.03),t=5.044,P＜0.01].ConclusionNecroptosis induced by RIP3 may play an important role in TBI,however,GSK’872 could reduce the degree of injury after TBI,which reveals that RIP3 may be a new target for clinical treatment of TBI in the future.

Receptor-interacting protein3;Traumatic brain injury;Necroptosis

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.05.006

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31200809）；武警部隊(duì)后勤科研項(xiàng)目（WJHQ2012-20）；軍隊(duì)技術(shù)產(chǎn)品研究重大項(xiàng)目（AWS15J001）；天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（15ZXLCSY00040）

610041成都，武警四川總隊(duì)成都醫(yī)院外一科1；300162天津，武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院2；100621北京，北京武警總隊(duì)三支隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)3

程世翔，Email：shixiangcheng@vip.126.com