楊紅洋+朱曉慶+商云霞+谷新利+郭曉

摘要：為探究MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性對(duì)中藥復(fù)方多糖免疫調(diào)節(jié)劑量的影響，采用PCR-SSCP方法將500羽黃麻肉雞按不同MHC B-LβⅡ基因型分組，再將各組分成高、中、低劑量中藥復(fù)方多糖組和空白對(duì)照組。分別于8日齡皮下注射50.0、25.0、12.5 mg/mL中藥復(fù)方多糖和生理鹽水各0.2 mL/只，連續(xù)注射7 d，于21、42、56、70日齡各組隨機(jī)取5只試驗(yàn)雞，翅靜脈采血分離血清，測(cè)定血清中新城疫（newcastle disease，簡(jiǎn)稱ND）抗體和IgG、IgM的含量。結(jié)果顯示，多糖能提高M(jìn)HC B-LβⅡ不同基因型雞新城疫抗體和IgG、IgM含量，且高劑量組中藥復(fù)方多糖組中AB基因型個(gè)體血清中新城疫抗體含量最高，AA基因型個(gè)體血清中IgG、IgM含量最高；中、低劑量中藥復(fù)方多糖組中AB基因型個(gè)體血清中新城疫抗體含量和IgG、IgM含量最高。表明中藥復(fù)方多糖能提高不同MHC B-LβⅡ基因型雞的免疫力，且中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHC B-LβⅡ基因雞的最適免疫調(diào)節(jié)劑量不同。

關(guān)鍵詞：中藥復(fù)方多糖；MHC B-LβⅡ基因；新城疫；免疫球蛋白IgG和IgM；雞

中圖分類號(hào)： S853.74 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）18-0168-05

收稿日期：2016-11-29

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31460673）。

作者簡(jiǎn)介：楊紅洋（1987—），男，山東菏澤人，碩士研究生，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)。E-mail：hongyangy527@126.com。

通信作者：商云霞，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，從事動(dòng)物疫病防治研究，E-mail：shangyunxia@shzu.edu.cn；谷新利，博士，教授，從事中藥制劑開發(fā)與應(yīng)用方面研究，E-mail：xlgu@shzu.edu.cn。 免疫能力的高低決定了機(jī)體抵抗病原能力的大小，直接影響經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的生長(zhǎng)和生產(chǎn)。注射疫苗能有效地提高機(jī)體抵抗病原的能力，并且當(dāng)疫苗與免疫增強(qiáng)劑配合使用時(shí)能顯著增強(qiáng)疫苗的防疫效果。目前，國(guó)內(nèi)外廣泛使用的油乳劑、鋁膠類等化學(xué)性免疫增強(qiáng)劑常具有副作用大、局部刺激性強(qiáng)、致癌等弊端。大量研究表明，從中草藥中提取的多糖不僅能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，還具有毒副作用小、殘留量低等優(yōu)點(diǎn)，成為開發(fā)療效確定、低毒免疫增強(qiáng)劑的理想藥物。

雞主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，簡(jiǎn)稱MHC）最初是作為具有高度多態(tài)性的紅細(xì)胞抗原而被認(rèn)識(shí)，之后將該基因的基因座標(biāo)記為B，即B復(fù)合體[1]，是一個(gè)與機(jī)體免疫應(yīng)答、抗病性能密切相關(guān)的多基因家族，具有高度的多態(tài)性。雞MHC至少包含3個(gè)亞區(qū)，即B-F、B-L、B-G區(qū)[2]。其中，B-L區(qū)基因編碼MHCII類分子，主要負(fù)責(zé)遞呈外源性抗原，供CD4+T細(xì)胞識(shí)別，誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)機(jī)體抗體的產(chǎn)生，參與機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)[3]。MHC B-LβⅡ基因是MHCII類抗原的結(jié)合區(qū)，具有豐富的多態(tài)性和功能特異性[4]。

有研究表明，多糖能被MHCII分子呈遞而被αβ-T細(xì)胞的TCR（T cell receptor）直接或者間接識(shí)別，激活B淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生[5]。而雞MHC基因多態(tài)性使得不同個(gè)體對(duì)相同抗原有不同免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫功能存在個(gè)體差異，進(jìn)而可能影響中藥多糖最適免疫增強(qiáng)劑量。因此，本研究采用PCR-SSCP方法對(duì)試驗(yàn)雞進(jìn)行MHC B-LβⅡ基因分型后，給予不同劑量中藥復(fù)方多糖，通過測(cè)定各組試驗(yàn)雞新城疫抗體和IgG、IgM等2種免疫球蛋白含量，探討MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性對(duì)中藥復(fù)方多糖提高雞體液免疫的最佳使用劑量是否有影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物 中藥復(fù)方由當(dāng)歸、黨參、熟地、川芎、山楂、何首烏、淫羊藿、麥冬、茯苓、補(bǔ)骨脂和黃芪11味中藥組成，各單味藥均購(gòu)自新疆石河子市醫(yī)藥公司。中藥多糖（質(zhì)量百分濃度w=77.10%）由石河子大學(xué)化工學(xué)院提供。用滅菌蒸餾水將中藥復(fù)方多糖配制成高劑量（50 mg/mL）、中劑量（25 mg/mL）、低劑量（12.5 mg/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度。

1.1.2 藥品與試劑 新城疫活疫苗購(gòu)自新疆石河子市八師獸醫(yī)站；雞新城疫抗體（NDV-Ab）酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)自北京城林生物技術(shù)有限公司；雞IgG、IgM ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海藍(lán)基生物有限公司；血液基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及分組 500羽1日齡黃麻肉雞購(gòu)自新疆石河子市孵化場(chǎng)，臨床檢查其健康情況。根據(jù)MHC B-LβⅡ基因第2外顯子PCR-SSCP的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分組，再將各組分成高、中、低劑量中藥多糖組和空白對(duì)照組。分別于8日齡皮下注射50.0、25.0、12.5 mg/mL中藥復(fù)方多糖及生理鹽水各 0.2 mL/只，連續(xù)注射7 d。

所有試驗(yàn)雞于7日齡進(jìn)行新城疫疫苗的點(diǎn)眼和滴鼻免疫，27日齡進(jìn)行2免，并且均采用相同的飼養(yǎng)方法、飼養(yǎng)條件、飼料品質(zhì)和飼養(yǎng)管理進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.4 試驗(yàn)儀器 酶標(biāo)儀（美國(guó)熱電FC型號(hào)）、微量移液器、恒溫培養(yǎng)箱等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 分別采集500羽雞的外周血，按照DNA提取試劑盒說明書提取雞全血DNA，4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank收錄的雞MHC B-LβⅡ基因序列（NC_006103.2）第2外顯子信息，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成引物設(shè)計(jì)和合成，擴(kuò)增目的條帶大小為308 bp，上游引物Forward：5′-CTGAATACTGGAAC AGCAACG-3′，下游引物Reverse：5′-ACCACTTCACCTC GATCTCC-3′。endprint

1.2.3 PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增反應(yīng)總體積為20 μL，其組成為Mix 12 μL，上、下游引物各1 μL，基因組DNA 1 μL，滅菌ddH2O 5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃ 保存。

1.2.4 PCR-SSCP基因型檢測(cè) 3 μL PCR產(chǎn)物與8 μL上樣緩沖液（98%甲酰胺，0.025%溴酚藍(lán)，0.025%二甲苯青，10 mmol EDTA）混勻后98 ℃水浴變性10 min，立即冰浴 10 min。樣品在8%非變性聚丙烯酰氨凝膠中電泳。電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染并用聚焦成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.5 雞血清新城疫抗體和IgG、IgM的含量測(cè)定 每組抽取5只試驗(yàn)雞，于21、42、56、70日齡翅靜脈采血，常規(guī)分離血清。根據(jù)雞新城疫抗體及IgG、IgM酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)稱ELISA）檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定樣品在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（D值），并根據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其對(duì)應(yīng)的D值獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的D值利用回歸方程計(jì)算出相應(yīng)樣品的新城疫抗體和IgG、IgM的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用SPSS 19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。所有統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以P<0.05作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-SSCP基因型檢測(cè)

對(duì)所有DNA樣品進(jìn)行PCR-SSCP基因型檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有5種基因型，即AA基因型（共186羽），AB基因型（共180羽），BB基因型（共68羽），AC基因型（共35羽），AD基因型（共31羽）（圖1）。

2.2 中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHC B-L βⅡ基因型雞血清中新城疫抗體含量的影響

由表1可知，與空白對(duì)照組相比，各劑量中藥復(fù)方多糖均能提高不同基因型雞新城疫抗體含量，但在同一劑量中藥復(fù)方多糖組和空白對(duì)照組中，不同基因型雞血清中新城疫抗體含量不同。其中，高劑量中藥復(fù)方多糖組21、42日齡AB基因型雞血清中新城疫抗體含量顯著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），56日齡AB基因型的新城疫抗體含量顯著高于AC、AD基因型（P<0.05），70日齡AB基因型的新城疫抗體含量顯著高于AA、AC、AD基因型（P<0.05）；中劑量中藥復(fù)方多糖組21日齡AB基因型雞血清中新城疫抗體含量顯著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），AC基因型的新城疫抗體含量顯著高于AA、BB、AD基因型（P<0.05），42日齡AB基因型的新城疫抗體含量顯著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），AC基因型的新城疫抗體含量顯著高于AD基因型（P<0.05），56日齡AB基因型的新城疫抗體含量顯著高于AA、BB、AD基因型（P<0.05），70日齡AB基因型的新城疫抗體含量顯著高于AD基因型（P<0.05）；低劑量中藥復(fù)方多糖組21日齡AB基因型雞血清中新城疫抗體含量顯著高于BB、AC、AD基因型（P<0.05），AA基因型的新城疫抗體含量顯著高于AC、AD基因型（P<0.05），42日齡AB基因型的新城疫抗體含量顯著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），AA基因型的新城疫抗體含量顯著高于BB、AD基因型（P0.05）；空白對(duì)照組各日齡AA基因型雞血清中新城疫抗體含量略高于AB、BB、AC、AD基因型，但無顯著性差異（P>0.05）。

2.3 中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHC B-L βⅡ基因型雞血清中IgG含量的影響

由表2可知，與空白對(duì)照組相比，各劑量中藥復(fù)方多糖均能提高不同基因型雞的IgG含量，但在同一劑量中藥復(fù)方多糖組和空白對(duì)照組中，不同基因型雞血清中的IgG含量不同。其中，高劑量中藥復(fù)方多糖組21、42日齡時(shí)AA基因型雞血清中IgG含量略高于AB、BB、AC、AD基因型，但無顯著性差異（P>0.05），56日齡時(shí)AA基因型的IgG含量顯著高于AC、AD基因型（P<0.05），70日齡時(shí)AA基因型的IgG含量顯著高于BB、AC、AD基因型（P005）。

2.4 中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHC B-L βⅡ基因型雞血清中IgM含量的影響

由表3可知，與空白對(duì)照組相比，各劑量中藥復(fù)方多糖均能提高不同基因型雞IgM含量，但在同一劑量中藥復(fù)方多糖組和空白對(duì)照組中，不同基因型雞血清中IgM含量不同。其中，高劑量中藥復(fù)方多糖組21日齡AA基因型雞血清中IgM含量顯著高于AB、BB、AC、AD基因型（P<0.05），42日齡時(shí)AA基因型的IgM含量顯著高于BB、AC、AD基因型（P<005），56、70日齡時(shí)AA基因型的IgM含量顯著高于AB、BB、AC、AD基因型（P<0.05），AB基因型的IgM含量顯著高于AD基因型（P<0.05）；中劑量中藥復(fù)方多糖組各日齡AB基因型雞血清中IgM含量顯著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），并且21日齡時(shí)AA基因型的IgM含量顯著高于AD、AC基因型（P<0.05）；低劑量中藥復(fù)方多糖組21日齡時(shí)AB、AA基因型雞血清中IgM含量顯著高于BB、AD基因型（P<0.05），42日齡時(shí)AB、AA基因型的IgM含量顯著高于AC基因型（P<0.05），56日齡時(shí)AB基因型的IgM含量顯著高于BB、AC、AD基因型（P<0.05），70日齡時(shí)AB基因型的IgM含量顯著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），AA基因型的IgM含量顯著高于AC、AD基因型（P<0.05），BB基因型的IgM含量顯著高于AD基因型（P<0.05）；空白對(duì)照組各日齡AB基因型雞血清中IgM含量顯著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），并且在42日齡時(shí)AA基因型的IgM含量顯著高于AC基因型（P<0.05），70日齡時(shí)AA基因endprint

型的IgM含量顯著高于AC、AD基因型（P<005）。

3 討論

新城疫是由新城疫病毒（newcastle disease virus，簡(jiǎn)稱NDV）引起的一種雞急性、敗血性、熱性以及高度接觸性的傳染病，一旦發(fā)病，在雞群中會(huì)迅速傳播，造成雞的大批死亡。新城疫抗體滴度是雞對(duì)新城疫疾病免疫狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)，能夠反映出雞對(duì)新城疫的免疫水平，同時(shí)也能反映出雞的體液免疫水平[6-7]。楊慶芳等研究了黃芪多糖（ASP）、淫羊藿多糖（EPP）和板藍(lán)根多糖對(duì)雞新城疫疫苗免疫效果的影響，發(fā)現(xiàn)3種中藥多糖均可提高新城疫HI抗體效價(jià)[8]；Liang等的研究證實(shí)，泰山刺洋槐多糖（Taishan Robinia pseudoacacia polysaccharides，簡(jiǎn)稱TRPP）作為免疫佐劑可促進(jìn)新城疫疫苗免疫的雛雞免疫器官發(fā)育，提高新城疫疫苗抗體效價(jià)，而且還可以提高十二指腸中SIgA的含量[9]。在本試驗(yàn)中，與空白對(duì)照組相比，高、中、低劑量中藥復(fù)方多糖均能不同程度提高雞ND抗體含量，并且在42日齡時(shí)達(dá)到峰值，之后逐漸降低，其主要原因是本試驗(yàn)中27日齡時(shí)使用的是新城疫活疫苗，它在接種后7～9 d可產(chǎn)生保護(hù)力，接種后2周抗體可達(dá)到峰值。

IgG、IgM是由活化的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的主要免疫球蛋白，反映體液免疫狀況[10]。其中，IgG是血清和體液中抗體的主要成分，其含量占整個(gè)血清免疫球蛋白的70%～75%，主要參與機(jī)體再次體液免疫應(yīng)答，具有調(diào)理吞噬作用、凝集反應(yīng)和沉淀抗原、中和病原體和毒素、活化補(bǔ)體傳導(dǎo)途徑的作用[11]。IgM含量占免疫球蛋白總量的10%，是活化B細(xì)胞受抗原刺激后產(chǎn)生最早的免疫球蛋白[12]。IgM具有很強(qiáng)的抗原結(jié)合能力，在機(jī)體初期的體液免疫防御中有著重要的地位。陳強(qiáng)等在雛雞日糧中添加黃芪多糖之后發(fā)現(xiàn)雛雞IgG、IgM 2種免疫球蛋白的分泌量增加[13]；何雯娟等研究表明，黃芩多糖能夠提高雞的免疫器官指數(shù)，并且能夠提高雞免疫球蛋白水平，對(duì)雞的免疫能力有提高作用[14]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高、中、低劑量中藥復(fù)方多糖在各日齡均能不同程度地提高雞血清中的IgG、IgM含量，增強(qiáng)了雛雞免疫力，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。

自MHC基因發(fā)現(xiàn)以來，已有大量的研究表明該基因的突變會(huì)引起不同個(gè)體對(duì)相同抗原表現(xiàn)出不同的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫功能存在個(gè)體差異。劉立波研究了雞MHC B-L基因SNPs單倍型與綿羊紅細(xì)胞抗體滴度（SRBC）、禽流感（AI）及新城疫（ND）抗體滴度等5個(gè)免疫性狀關(guān)系，結(jié)果表明，每個(gè)免疫性狀與多個(gè)突變位點(diǎn)存在顯著相關(guān)，且有多個(gè)優(yōu)勢(shì)單倍型，反映了不同個(gè)體之間存在免疫應(yīng)答能力的差異[15]。在本試驗(yàn)的空白對(duì)照組中，不同MHC B-LβⅡ基因型雞ND抗體和IgG、IgM含量不同，其中，AA基因型雞血清中ND抗體含量略高于AB、BB、AC、AD基因型，AB基因型雞血清中的IgG、IgM含量略高于其他基因型雞，表明MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性會(huì)引起機(jī)體免疫功能的個(gè)體差異。周偉等研究發(fā)現(xiàn)，不同MHC基因型狼山雞的IgG、IgM含量存在一定差異[16]，這與本研究結(jié)果一致。

另外，中醫(yī)藥自古就講求用藥個(gè)體化，基因組學(xué)的發(fā)展為個(gè)體化用藥提供了理論支持。當(dāng)遺傳變異和藥物療效之間的相互作用逐漸受到人們關(guān)注時(shí)，將基因組的研究應(yīng)用于藥物治療領(lǐng)域逐漸增多。隨著各國(guó)學(xué)者從細(xì)胞、分子、基因等不同水平對(duì)多糖免疫調(diào)節(jié)機(jī)理的深入研究，發(fā)現(xiàn)從中草藥中提取的多糖不僅能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，也是一種T細(xì)胞依賴性抗原，它能被MHCⅡ類分子處理和呈遞，進(jìn)而被TCR識(shí)別[5]，參與機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。在本試驗(yàn)中，當(dāng)對(duì)不同MHC B-LβⅡ基因型雞進(jìn)行中藥復(fù)方多糖處理后，不同劑量中藥復(fù)方多糖組中MHC B-LβⅡ的優(yōu)勢(shì)基因型不同。其中，高劑量中藥復(fù)方多糖組中AB基因型個(gè)體ND抗體含量最高，AA基因型個(gè)體IgG、IgM含量最高，中、低劑量中藥復(fù)方多糖組中AB基因型個(gè)體ND抗體含量和IgG、IgM含量最高。出現(xiàn)不同劑量中藥復(fù)方多糖組中優(yōu)勢(shì)基因型不同的原因可能是：（1）MHC基因豐富的多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致MHCII類分子抗原肽結(jié)合槽的結(jié)構(gòu)不同，TCR在識(shí)別被呈遞的細(xì)胞表面抗原時(shí)也要識(shí)別細(xì)胞上的MHCII類分子，中藥多糖中的活性成分或雜質(zhì)作為一種外來抗原被MHCII類分子提呈給T細(xì)胞的能力和激活B細(xì)胞的能力不同，導(dǎo)致不同濃度中藥復(fù)方多糖組中不同基因型個(gè)體T、B淋巴細(xì)胞增殖能力及抗體產(chǎn)生量不同，免疫功能存在差異；（2）免疫系統(tǒng)對(duì)抗原的感知有數(shù)量和濃度上的敏感性差異，多糖的濃度過高或者過低均不會(huì)產(chǎn)生較高的免疫應(yīng)答，從而引起機(jī)體免疫水平的差異；（3）免疫性狀除受MHC B-LβⅡ基因調(diào)控外，還受到其他突變位點(diǎn)或者基因的調(diào)控，不同的突變位點(diǎn)引起的免疫性狀的變化不同，可對(duì)抗體和免疫球蛋白的產(chǎn)生具有調(diào)節(jié)作用。

以上結(jié)果說明，MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性使雞的免疫能力產(chǎn)生個(gè)體差異，并且對(duì)提高雞血清中的ND抗體含量和IgG、IgM含量的最適多糖濃度會(huì)有一定影響。

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