張雪嬌+王利平+趙振軍+鄭銀英+陳婕+崔百明

摘要：為了獲得來(lái)源于西洋梨紅貝雷沙寄主潛帶蘋(píng)果莖溝病毒（ASGV）分離物的基因組全長(zhǎng)序列，并明確其分子特性，采用RT-PCR、RACE末端克隆及生物信息學(xué)方法，對(duì)ASGV分離物基因組全長(zhǎng)進(jìn)行序列測(cè)定，并對(duì)其序列特點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于西洋梨的ASGV-HB分離物的基因組全長(zhǎng)序列為6 496 nt（GenBank登錄號(hào)：KU605672），含有2個(gè)開(kāi)放閱讀框ORF1、ORF2及2個(gè)可變區(qū)Ⅵ、Ⅶ。序列分析表明ASGV-HB與GenBank登錄的18個(gè)ASGV分離物的基因組全長(zhǎng)核苷酸序列同源性為80.6%～87.7%；ORF1和ORF2編碼的氨基酸同源性分別為843%～92.3%和94.4%～98.7%；Ⅵ和Ⅶ可變區(qū)的氨基酸序列同源性分別為22.9%～68.8%和48.8%～922%；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示，來(lái)源于不同國(guó)家的相同寄主的ASGV分離物聚集為同一分支。結(jié)果表明，ASGV的分子變異無(wú)地域相關(guān)性，具有一定的寄主選擇性，研究結(jié)果為進(jìn)一步探究ASGV的群體遺傳進(jìn)化機(jī)制及其防治提供了重要的分子信息。

關(guān)鍵詞：梨；蘋(píng)果莖溝病毒；基因組全長(zhǎng)序列；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析；同源性

中圖分類號(hào)： S436.611.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）18-0043-05

收稿日期：2016-05-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31201488）；國(guó)家梨產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（編號(hào)：nycytx-29-08）。

作者簡(jiǎn)介：張雪嬌（1990—），女，河南周口人，碩士，研究方向?yàn)橹参锓肿舆z傳學(xué)。E-mail：yaqifeixue62@sina.com。

通信作者：崔百明，博士，副教授，研究方向?yàn)橹参锓肿舆z傳學(xué)。E-mail：2247237543@qq.com。 蘋(píng)果莖溝病毒（apple stem grooving virus，ASGV）為β-線性病毒科（Flexiviridae）發(fā)狀病毒屬（Capillovirus）的代表種[1]，是一種嚴(yán)重危害果樹(shù)產(chǎn)業(yè)的潛隱性病毒。ASGV感染梨樹(shù)后一般不產(chǎn)生明顯的癥狀，但對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)有嚴(yán)重的影響，給果樹(shù)生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。且ASGV一旦感染便較難脫除，脫除率僅為68.9%[2]。ASGV存在多種分子變異，目前尚未報(bào)道西洋梨寄主ASGV分離物基因組全長(zhǎng)序列信息，了解ASGV的分子序列變異特點(diǎn)為研究ASGV的群體遺傳和果樹(shù)防治提供重要的分子依據(jù)。自1965年Waterworth首次報(bào)道蘋(píng)果被感染ASGV后，陸續(xù)在梨、杏、柑橘、百合、獼猴桃、櫻桃等[3-7]植株上發(fā)現(xiàn)該病毒。研究明確ASGV基因組含有2個(gè)重疊開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORFs），分別編碼多聚蛋白（polyprotein）和運(yùn)動(dòng)蛋白（MP），多聚蛋白包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為甲基轉(zhuǎn)移酶（Met）、類木瓜蛋白酶（P-Pro）、解旋酶（Hel）、RNA聚合酶（RdRp）和外殼蛋白（CP）[8]；ORF2編碼36 ku運(yùn)動(dòng)蛋白（MP），與復(fù)制酶和CP之間存在重疊[9]。ASGV基因組中存在2個(gè)可變區(qū)（variable regions），稱為Ⅵ和Ⅶ，Ⅴ～Ⅰ可變區(qū)在基因組523～570 aa位置處，Ⅶ可變區(qū)在復(fù)制酶和CP之間，位于1 583～1 868 aa位置處跟ORF2區(qū)域存在重疊。Liebenberg等通過(guò)對(duì)Ⅵ和Ⅶ區(qū)進(jìn)行壓力選擇分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)ASGV的多樣性與寄主存在一定的相關(guān)性[10]。目前GenBank登錄了來(lái)源于日本百合分離物CTLV-L和CTLV-Li-23，韓國(guó)砂梨分離物ASGV-P、德國(guó)蘋(píng)果分離物ASGV-AC和印度日本蘋(píng)果分離物ASGV-P209及來(lái)自中國(guó)臺(tái)灣柑橘分離物CTLV-K和CTLV-LCd-NA-1等18個(gè)ASGV分離物的全基因組序列，而國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道來(lái)源于西洋梨寄主的ASGV分離物基因組全長(zhǎng)序列。本研究根據(jù)GenBank上登錄的ASGV分離物基因組全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，并結(jié)合RACE技術(shù)首次從西洋梨品種紅貝雷沙中獲得ASGV分離物，命名為ASGV-HB，分析了其基因組結(jié)構(gòu)并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，明確其分子進(jìn)化地位以及該病毒與地域起源和寄主種類的相關(guān)性，旨在為進(jìn)一步探究果樹(shù)ASGV的群體遺傳和防治提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

紅貝雷沙枝條于2010年4月采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所，取枝條韌皮部作為檢測(cè)材料，采用引物ASGV-U（5′-CCCGCTGTTGGATTTGATACACCTC-3′）/ASGV-2（5′-GGAATTTCACACGACTCCTAACCCTCC-3′）[11]，經(jīng) RT-PCR 檢測(cè)證實(shí)感染ASGV；通過(guò)芽尖組織培養(yǎng)獲得的離體植株保存于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)“國(guó)家果樹(shù)無(wú)毒種質(zhì)資源室內(nèi)保存中心”，取其葉片和莖尖作為本研究提取核酸的材料。

1.2 總RNA的提取

參照?qǐng)?bào)道的CTAB法[12-13]，取待檢材料嫩葉和莖尖0.1 g，加液氮研磨成粉末，后加入2%的CTAB緩沖液[2% CTAB、1.5 mol/L NaCl、2% PVP-40、100 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）、20 mmol/L EDTA]和2% β-巰基乙醇，65 ℃水浴后加入等體積水飽和酚 ∶ 氯仿 ∶ 異戊醇[25 ∶ 24 ∶ 1]，取上清加入2.5倍體積無(wú)水乙醇和10% 3 mol/L醋酸鈉（pH值5.2）沉降RNA，溶于DEPC水中，-80 ℃保存。

1.3 RT-PCR擴(kuò)增基因組全長(zhǎng)序列

根據(jù)GenBank上登錄的ASGV（GenBank登錄號(hào)：D16681）基因組序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，對(duì)ASGV-HB部分片段進(jìn)行擴(kuò)增并送公司測(cè)序，結(jié)合測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其間隔序列。RT-PCR體系20 μL：總RNA 2 μg、6堿基隨機(jī)引物1 μL，加RNase Free dH2O補(bǔ)足10 μL，混勻后90 ℃溫浴 7 min，冰浴3 min，后加入5× M-MLV Buffer 4 μL、dNTPs 1 μL、RRI 0.5 μL、M-MLV 0.5 μL和RNase Free dH2O 4 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 1.5 h，-20 ℃?zhèn)溆?。endprint

PCR反應(yīng)體系25 μL：10×Taq DNA polymerase Buffer（Mg2+）2.5 μL、dNTPs 0.5 μL、引物0.5 μL、Taq DNA Polymerase 0.25 μL、cDNA 2 μL、加水補(bǔ)足25 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s（可變），72 ℃ 1 min（可變），34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用5′RACE和3′RACE（TaKaRa公司）技術(shù)獲得5′端和3′端序列，送至上海生工生物公司測(cè)序。

1.4 ASGV基因組全長(zhǎng)序列克隆和序列分析

選取經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液提交至上海生工生物工程公司武漢分公司測(cè)序，采用Vector NTI Advance 11.5.3完成對(duì)序列的拼接，多重比對(duì)用BioEdit、RDP4等生物學(xué)軟件完成，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建采用DNAMAN（7.0）、MEGA6.0軟件，Neighbor-Joining法進(jìn)行分析，設(shè)置1 000次重復(fù)，并隱藏了支撐值低于50的數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 來(lái)源于中國(guó)西洋梨ASGV-HB分離物基因組全長(zhǎng)核苷酸序列分析

將擴(kuò)增得到的序列利用Vector NTI Advance 11.5.3軟件進(jìn)行拼接，獲得ASGV-HB分離物基因組全長(zhǎng)為6 496 nt（不含PloyA尾），其序列遞交GenBank，獲得的登錄號(hào)為KU605672。利用在線工具對(duì)其進(jìn)行核苷酸編碼的開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），ASGV-HB基因組結(jié)構(gòu)與報(bào)道的ASGV分離物一致，可編碼2個(gè)重疊的開(kāi)放閱讀框，為ORF1（37～6 354 nt）和ORF2（4 788～5 750 nt），分別編碼2 105 aa分子量為241 ku的多聚蛋白和320 aa分子量為36 ku的蛋白；多聚蛋白含有甲基轉(zhuǎn)移酶、木瓜蛋白酶、解旋酶和RNA依賴的RNA聚合酶以及位于基因組C末端27 ku的外殼蛋白。5′UTR含有36個(gè)核苷酸，3′UTR 含有142個(gè)核苷酸。通過(guò)BioEdit軟件對(duì)ORF1氨基酸進(jìn)行多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ASGV-HB基因組中存在與其他ASGV分離物基因組相似的2個(gè)可變區(qū)，分別為Ⅵ（532～570 aa）和Ⅶ（1 538～1 868 aa）。Ⅶ區(qū)與ORF2部分區(qū)域重疊。因此，基于預(yù)測(cè)的蛋白保守功能結(jié)構(gòu)域，ASGV-HB分離物基因組結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。將ASGV-HB分離物與GenBank上收錄的來(lái)源于不同寄主及不同地域的18個(gè)ASGV分離物的基因組全長(zhǎng)序列及部分編碼區(qū)氨基酸進(jìn)行同源性比較， 結(jié)果（表1、表2）表明，ASGV-HB與此18個(gè)ASGV分離物的基因組全長(zhǎng)核苷酸序列相似性為80.6%～87.7%。其中ASGV-HB全長(zhǎng)序列與日本蘋(píng)果上的P-209分離物全長(zhǎng)序列相似性最高，為87.7%；ORF1和ORF2氨基酸同源性分別為

843%～92.3%和94.4%～98.7%，可變區(qū)Ⅵ（532～570 aa）和Ⅶ（1 583～1 852 aa）氨基酸相似性分別為22.9%～688%和48.85%～92.2%，5′端UTR和3′端UTR核苷酸相似性分別為100%和98.6%。

將ASGV-HB和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上收錄的來(lái)源于不同國(guó)家或地區(qū)的蘋(píng)果、梨、柑橘和百合寄主的18個(gè)ASGV分離物基因組全長(zhǎng)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析（圖2）。結(jié)果表明，19個(gè)ASGV分離物可聚為3個(gè)組群，分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。Ⅰ組群分為2個(gè)分支，其中來(lái)源于日本的百合Li-23和L聚為1個(gè)分支，ASGV-HB分離物為獨(dú)立分支，與日本和中國(guó)的蘋(píng)果、柑橘和梨分離物（YTG、HH、CHN、MTH、P209和T47）聚為Ⅰ組群。Ⅱ組群由3個(gè)分支組成，其中來(lái)源于美國(guó)和中國(guó)寄主的柑橘分離物（分別為STJ、XHC、K、Lcd-NA-1、PK、ML）聚集為1個(gè)分支；來(lái)源于印度和德國(guó)的蘋(píng)果寄主AC和P12的分離物聚集為另一個(gè)分支，來(lái)源于中國(guó)砂梨的分離物ASGV-J2單獨(dú)為1個(gè)分支；來(lái)源于韓國(guó)寄主的梨SK分離物單獨(dú)聚為Ⅲ組。

2.2 ASGV-HB分離物mp基因核苷酸序列分析

ASGV-HB分離物與報(bào)道的18個(gè)分離物mp基因核苷

酸序列同源性為78.5%～96.4%，與報(bào)道的中國(guó)砂梨分離物ASGV-J2相似性最高。進(jìn)而對(duì)其ASGV分離物的mp基因在核苷酸水平上進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，結(jié)果表明，共分析的19個(gè)分離物分為2個(gè)組群，分別命名為Ⅰ和Ⅱ組群。Ⅰ組群包含2個(gè)分支，其中來(lái)源于中國(guó)和美國(guó)的柑橘mp分離物均聚為1個(gè)分支，來(lái)源于南非、印度和德國(guó)的梨與蘋(píng)果寄主的mp分離物聚為另一個(gè)分支。Ⅱ組群主要分為2個(gè)分支，其中ASGV-HB西洋梨分離物與來(lái)源于中國(guó)的砂梨J2分離物聚為同一分支；來(lái)源于中國(guó)和日本的蘋(píng)果、梨、柑橘和百合分別聚集為同一個(gè)分支的隨寄主而選擇的不同簇（圖3）。

2.3 ASGV-HB分離物cp基因核苷酸序列分析

將ASGV-HB分離物與選取的GenBank上登錄的來(lái)源于中國(guó)、日本、南非、印度、韓國(guó)、德國(guó)的蘋(píng)果、梨、百合、柑橘和竹子寄主上的34個(gè)ASGV分離物基于cp基因序列的同源性為88.85%～95.5%，與來(lái)源于日本的P209蘋(píng)果分離物的同源性為95.2%。進(jìn)而對(duì)cp基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，結(jié)果（圖4）表明，來(lái)源于不同寄主的35個(gè)ASGV分離物可分為3個(gè)組群，分別命名為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。Ⅰ組群包含2個(gè)分支，其中來(lái)源于南非的蘋(píng)果獨(dú)立成簇，與中國(guó)不同地區(qū)柑橘的cp基因分離物聚為1個(gè)分支； 來(lái)源于巴西、日本、中國(guó)、印度、南非和

德國(guó)的梨、蘋(píng)果、柑橘和竹子的cp分離物分別聚集為同一個(gè)分支的隨寄主而選擇的不同簇，其中ASGV-HB cp基因分離物與來(lái)源于南非、巴西、日本和中國(guó)的梨與蘋(píng)果的cp分離物（A19、HPHF15、T47、P209和MP220）聚為此分支的同一簇；來(lái)源于中國(guó)的蘋(píng)果和柑橘聚為第Ⅱ組；來(lái)源于美國(guó)的柑橘單獨(dú)成簇，與來(lái)源于印度的蘋(píng)果聚為第Ⅲ組。endprint

3 討論與結(jié)論

本研究采用RT-PCR結(jié)合末端RACE法首次對(duì)采集自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所西洋梨紅貝雷沙樣品的ASGV分離物，即ASGV-HB的基因組進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，獲得其全長(zhǎng)序列為6 496 nt（不含ployA），包含2個(gè)完整的ORFs。其中ORF1編碼含有4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的復(fù)制酶蛋白（Rep）以及外殼蛋白（CP），ORF2編碼運(yùn)動(dòng)蛋白（MP），以及序列變異明顯的Ⅵ和Ⅶ區(qū)。報(bào)道顯示，ASGV的cp和mp基因均通過(guò)亞基因組表達(dá)[14]，cp通過(guò)亞基因組表達(dá)引起寄主系統(tǒng)感染，在cp亞基因組（subgnomic RNA，sgRNA）編碼區(qū)上游存在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)AUG及cp sgRNA表達(dá)所需的6堿基保守核心啟動(dòng)子序列UUAGGU，共同調(diào)控cp基因表達(dá)，同時(shí)對(duì)ASGV的侵染活性有重要影響[15]。本研究得到的ASGV-HB基因組序列 5 602～5 607 nt位置處含有此六堿基序列UUAGGU，此序列為cp sgRNA起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的核心堿基序列。在其后 5 640～5 642 nt 位置處推測(cè)為cp sgRNA的起始位點(diǎn)AUG。

為了進(jìn)一步明確其分子序列特性和遺傳進(jìn)化關(guān)系，將ASGV-HB分離物與GenBank上登錄的來(lái)源于國(guó)內(nèi)外的梨、蘋(píng)果、柑橘和百合共4種寄主的18個(gè)ASGV分離物進(jìn)行基因組核苷酸水平相似性比較，結(jié)果表明，ASGV-HB分離物與來(lái)源于日本的蘋(píng)果分離物P209相似性最高，且在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中聚為同一組群同一分支（表2、圖2）。對(duì)19個(gè)分離物進(jìn)行mp基因水平上的序列分析結(jié)果也顯示，ASGV-HB分離物與P209位于同一組群，但是聚集為不同分支，與來(lái)源于中國(guó)的砂梨J2分離物聚集為同一分支，遺傳距離最近。另外，我們對(duì)ASGV-HB分離物與GenBank登錄的34個(gè)分離物進(jìn)行cp基因遺傳進(jìn)化關(guān)系分析，結(jié)果也表明，來(lái)源于不同國(guó)家和地區(qū)的寄主分離物聚集為同一組群同一分支。因此，基于ASGV基因組全長(zhǎng)核苷酸、mp和cp基因核苷酸水平上的遺傳進(jìn)化分析均表明，ASGV具有分子變異特點(diǎn)，顯示出與寄主的相關(guān)性。進(jìn)而分析了ASGV-HB分離物Ⅵ和Ⅶ區(qū)氨基酸序列，結(jié)果表明，ASGV-HB分離物Ⅵ區(qū)氨基酸序列同源性僅為229%～68.8%，Ⅶ區(qū)同源性為48.8%～92.2%，且遺傳進(jìn)化關(guān)系也揭示了該分離物與來(lái)源于蘋(píng)果和梨寄主的分離物進(jìn)化關(guān)系較近。趙磊研究結(jié)果表明ASGV的cp基因分子變異趨勢(shì)具有一定的寄主選擇性，不存在明顯的地理差異[16]。本研究結(jié)果與Liebenberg等[10]報(bào)道的ASGV分離物變異區(qū)Ⅵ和Ⅶ的進(jìn)化分析也揭示了遺傳進(jìn)化關(guān)系與寄主有相關(guān)性，而與地理位置無(wú)任何關(guān)聯(lián)相似。推測(cè)可能與不同國(guó)家間種質(zhì)材料交換而導(dǎo)致了攜帶該病毒的分子遺傳進(jìn)化與來(lái)源無(wú)相關(guān)性有關(guān)。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究ASGV的群體遺傳和深入探討其進(jìn)化機(jī)制提供了重要的分子信息，也為深入探究其基因組致病性功能及構(gòu)建其侵染性克隆提供了材料。

參考文獻(xiàn)：

[1]Martelli G P，Adams M J，Kreuze J F，et al. Family flexiviridae：a case study in virion and genome plasticity[J]. Phytopathology，2007，45：73-100.

[2]張尊平，張少瑜，洪 霓，等. 熱處理脫除梨病毒技術(shù)研究[J]. 北方果樹(shù)，2001（5）：8-9.

[3]Wu Z B，Zheng Y X，Su C C，et al. Identification and characterization of apple stem grooving virus causing leaf distortion on pear （Pyrus pyrifolia） in Taiwan[J]. European Journal of Plant Pathology，2010，128（1）：71-79.

[4]Inouye N，Maeda T，Mitsuhata K. Citrus tatter leaf virus isolated from lily[J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan，1979，45：712-720.

[5]Lovisolo O，Accotto G P，Masenga V，et al. An isolate of apple stem grooving virus associated with Cleopatra mandarin fruit intumescence[J]. Tropical Plant Pathology，2003，28（1）：54-58.

[6]Clover G，Pearson M，Elliott D，et al. Characterization of a strain of apple stem grooving virus in Actinidia chinensis from China[J]. Plant Pathology，2003，52（3）：371-378.

[7]Campbell A. The effect of some latent virus infections on the growth and cropping of apples[J]. Journal of Horticultural Science，1963，38（1）：15-19.

[8]Hirata H，Lu X，Yamaji Y，et al. A single silent substitution in the genome of apple stem grooving virus causes symptom attenuation[J]. Journal of General Virology，2003，84（9）：2579-2583.endprint

[9]Zhou Y，Holmes E C. Bayesian estimates of the evolutionary rate and age of hepatitis B virus[J]. Journal of Molecular Evolution，2007，65（2）：197-205.

[10]Liebenberg A，Moury B，Sabath N，et al. Molecular evolution of the genomic RNA of apple stem grooving capillovirus[J]. Journal of Molecular Evolution，2012，75（3/4）：92-101.

[11]James D. A simple and reliable protocol for the detection of apple stem grooving virus by RT-PCR and in a multiplex PCR assay[J]. Journal of Virological Methods，1999，83（1/2）：1-9.

[12]張 濤，韓 梅，劉翠晶，等. 人參總RNA提取方法及后轉(zhuǎn)錄酶的比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（8）：34-37.

[13]董 璐，賈紅梅，劉 迪，等. 菊花葉片總RNA提取方法的比較研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（3）：67-69.

[14]Hirata H，Yamaji Y，Komatsu K，et al. Pseudo-polyprotein translated from the full-length ORF1 of capillovirus is important for pathogenicity，but a truncated ORF1 protein without variable and CP regions is sufficient for replication[J]. Virus Research，2010，152（1/2）：1-9.

[15]Komatsu K，Hirata H，F(xiàn)ukagawa T，et al. Infection of capilloviruses requires subgenomic RNAs whose transcription is controlled by promoter-like sequences conserved among flexiviruses[J]. Virus Research，2012，167（1）：8-15.

[16]趙 磊. 蘋(píng)果莖溝病毒的全基因組測(cè)序及其侵染性克隆載體的構(gòu)建[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013：19-21.張高陽(yáng)，鄧接樓，柯維忠，等. 紅麻肌醇加氧酶基因的分離及表達(dá)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（18）：48-50.endprint