王意程，王楠，許海峰，張宗營(yíng)，姜生輝，張靜，曲常志，陳學(xué)森

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紅肉蘋(píng)果分裂素響應(yīng)基因的克隆與表達(dá)分析

王意程，王楠，許海峰，張宗營(yíng)，姜生輝，張靜，曲常志，陳學(xué)森

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)科與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271018）

細(xì)胞分裂素是調(diào)控植物花青苷合成的重要激素，從新疆紅肉蘋(píng)果雜種一代優(yōu)系‘紫紅3號(hào)’中克隆得到分裂素響應(yīng)基因，研究其在細(xì)胞分裂素調(diào)控蘋(píng)果花青苷合成中的作用，為進(jìn)一步完善紅肉蘋(píng)果育種的理論與技術(shù)體系提供參考。以紅肉蘋(píng)果‘紫紅3號(hào)’（新疆紅肉蘋(píng)果與‘富士’雜交1代）的紅色幼嫩葉片為外植體誘導(dǎo)的紅色愈傷組織為試材，設(shè)計(jì)引物利用PCR克隆，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；并用不同濃度細(xì)胞分裂素處理，采用熒光定量PCR分析及花青苷合成相關(guān)基因的表達(dá)；通過(guò)酵母雙雜交試驗(yàn)、熒光雙分子互補(bǔ)試驗(yàn)驗(yàn)證MdMYB308與MdbHLH3的互作關(guān)系。在‘紫紅3號(hào)’中克隆獲得全長(zhǎng)，其包含768 bp完整的開(kāi)放閱讀框，編碼255個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)分子量為28.37 kD，等電點(diǎn)為8.94；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，與、、在同一個(gè)進(jìn)化枝上，氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，MdMYB308蛋白存在EAR抑制序列；提高6-BA濃度有利于蘋(píng)果愈傷組織花青苷的累積，與無(wú)細(xì)胞分裂素處理相比，1 mg·L-16-BA處理愈傷花青苷合成結(jié)構(gòu)基因、、與轉(zhuǎn)錄基因、的表達(dá)量升高，而表達(dá)被抑制；酵母雙雜交與熒光雙分子互補(bǔ)試驗(yàn)表明，MdMYB308與MdbHLH3能相互作用。細(xì)胞分裂素（6-BA）可能通過(guò)抑制的表達(dá)影響MdMYB308與MdbHLH3的結(jié)合從而促進(jìn)花青苷的累積。

蘋(píng)果；分裂素；；酵母雙雜；雙分子熒光互補(bǔ)

0 引言

【研究意義】新疆紅肉蘋(píng)果（f.(Dieck) Langenf）是新疆野蘋(píng)果的變型，其富含花青苷等次生代謝產(chǎn)物，具有花、果、葉、枝均為紅色的特點(diǎn)，是現(xiàn)代蘋(píng)果品質(zhì)育種的重要種質(zhì)；但其高花青苷性狀缺乏挖掘與利用，成為制約單一傳統(tǒng)栽培品種向特色多樣化發(fā)展的重要因素[1]。因此，以新疆紅肉蘋(píng)果與栽培蘋(píng)果品種的雜交分離群體為試材，積極探討響應(yīng)外源分裂素調(diào)控花青苷合成代謝機(jī)制，完善蘋(píng)果紅色性狀遺傳與發(fā)育機(jī)理，對(duì)傳統(tǒng)品種的性狀改良及豐富栽培蘋(píng)果遺傳基因庫(kù)具有重要意義[2-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】花青苷生物合成是植物類(lèi)黃酮合成途徑的重要分支。利用模式植物同源克隆技術(shù)已從大多數(shù)植物中分離鑒定了花青苷合成酶及相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因[4-7]。然而，除了植物本身的種性（遺傳性）外，花青苷的合成同時(shí)受到外界環(huán)境（光、溫度、激素等）的調(diào)控[8-12]。細(xì)胞分裂素作為調(diào)控花青苷合成的重要激素之一，已在擬南芥、甘藍(lán)、蘿卜等植物中篩選與驗(yàn)證[13-15]。研究發(fā)現(xiàn)，6-BA可以誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因、和的表達(dá)，促進(jìn)擬南芥葉片花青苷的累積，且過(guò)表達(dá)分裂素合成基因的植株比野生型花青苷含量高[15]。在轉(zhuǎn)錄水平上，外源細(xì)胞分裂素有利于MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)從而間接促進(jìn)植物花青苷的積累[16]。此外，AtMYBL2轉(zhuǎn)錄因子是具有EAR結(jié)構(gòu)的MYB類(lèi)抑制子，研究表明細(xì)胞分裂素可以抑制的表達(dá)而增強(qiáng)擬南芥中花青苷的代謝合成[17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者課題組于2006年率先建立了以新疆野蘋(píng)果及其紅肉變性為親本的雜種分離群體[18]。針對(duì)雜交一代中果實(shí)質(zhì)地、類(lèi)黃酮含量、香氣等性狀遺傳變異特點(diǎn)，對(duì)其不同株系間品質(zhì)性狀比較及相關(guān)基因表達(dá)分析，并深入探討激素與氮對(duì)花青苷生物合成的影響[19-22]，但外源分裂素調(diào)控蘋(píng)果花青苷代謝機(jī)理及相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究，尚未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用不同濃度6-BA處理紅肉愈傷組織，并進(jìn)行花青苷相關(guān)基因的熒光定量分析，通過(guò)酵母雙雜交與雙分子熒光互補(bǔ)（BIFC）試驗(yàn)研究MdMYB308與MdbHLH3的關(guān)系，探討外源分裂素對(duì)蘋(píng)果花青苷MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制，為研究紅肉蘋(píng)果花青苷代謝分子機(jī)理與高品質(zhì)蘋(píng)果品種選育提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料及處理

以新疆紅肉蘋(píng)果與富士雜交F1代分離群體中選出的‘紫紅3號(hào)’優(yōu)株幼嫩葉片誘導(dǎo)的紅色愈傷組織為試材，將正常培養(yǎng)（0.3 mg?L-1NAA+0.6 mg?L-16-BA）的愈傷組織轉(zhuǎn)接到NAA濃度為0.3 mg?L-1、6-BA濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mg?L-1的MS培養(yǎng)基（Solarbio）上。每天進(jìn)行16 h的光照培養(yǎng)，光強(qiáng)為2 000—2 500 lx，溫度設(shè)置為（24±2）℃。處理20 d后取樣，液氮速凍，-80℃保存。

1.2 植物總RNA的提取與qRT-PCR

總RNA的提取方法參照TianGen RNA Plant Reagent 操作說(shuō)明。反轉(zhuǎn)錄利用Fermentas公司生產(chǎn)的ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA。熒光定量使用伯樂(lè) CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀，總反應(yīng)體系20 μL，包括10 μL 2.5×RealMasterMix/ 20×SYBR Solution，1 μL cDNA模板（50 ng·μL-1），上下游引物各1 μL （5 μmol·L-1），7 μL ddH2O。運(yùn)行程序?yàn)椋孩?5.0℃預(yù)變性 30 s；②95.0℃變性5 s；③58℃退火10 s；④72.0℃延伸30 s（②—④共45個(gè)循環(huán)）；⑤65℃孵育 20 s；⑥溶解溫度從55℃到95℃每升高0.5℃保持1 s；⑦停止反應(yīng)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。以蘋(píng)果肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)的分析采用2-ΔΔCT方法。

1.3 蘋(píng)果MdMYB308的克隆、生物信息學(xué)分析

在蘋(píng)果基因組中根據(jù)擬南芥中AtMYBL2蛋白序列進(jìn)行Blast比對(duì)得到了一個(gè)基因序列號(hào)為MDP0000249611的基因，分別設(shè)計(jì)上下游引物F：5′-ATGGGAAGGTCTCCTTGC-3′，R：5′-TCATTTCA TCTCCAAGCTTCT-3′。具體反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，上下游引物各2.5 μL，5×HFbuffer 10 μL，10 mmol·L-1dNTP 1 μL，酶0.5 μL，ddH2O 31.5 μL。PCR程序?yàn)椋?8℃30 s；98℃10 s，56℃30 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并回收目的條帶，連接PLB零背景載體（VT205）進(jìn)行測(cè)序。

MdMYB308蛋白通過(guò)Expasy網(wǎng)站（http://web. expasy.org/protparam/）進(jìn)行理化性質(zhì)分析，NCBI軟件Blast比對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸序列，MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 花青苷含量的測(cè)定

稱(chēng)取愈傷組織0.25 g，液氮研磨至粉末加入10 mL 1%HCL甲醇，4℃浸提24 h，12 500 r/min離心25 min，吸取上清液進(jìn)行測(cè)定。以鹽酸甲醇為空白，利用分光光度計(jì)測(cè)定樣品提取液在530 nm下的吸光值，每g樣品的吸光值為花青苷含量（Abs·g-1FW）。

1.5 酵母雙雜試驗(yàn)

用引物5′-CCATATGATGGGAAGGTCTCCTTGC -3′和5′-CGGATCCTCATTTCATCTCCAAGCTTCT-3′擴(kuò)增MdMYB308的編碼框序列，用引物5′-GGAATTC ATGGCTGCACCGCC-3′和5′-GGATCCTTAAGAGTC AGATTGGGGTATAATTT-3′擴(kuò)增MdbHLH3的編碼框序列，將膠回收產(chǎn)物連接PLB零背景載體。酶切連接構(gòu)建pGBKT7-MdbHLH3和pGADT7- MdMYB308重組載體。將重組載體質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化到酵母Y2H感受態(tài)細(xì)胞，分別培養(yǎng)在二缺-Leu/Trp與四缺-Ade/-His/ -Leu/-Trp選擇性培養(yǎng)基中，并在四缺培養(yǎng)基中添加X(jué)-α-gal進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)

用引物5′-CGGGATCCATGGGAAGGTCTCCTT GC-3′和5′-GCGTCGACTTTCATCTCCAAGCTTCTG TA-3′擴(kuò)增MdMYB308的編碼框序列，用引物5′-GGA TCCATGGCTGCACCGCC-3′和5′-GGGGTACCAGA GTCAGATTGGGGTATAATTTG-3′擴(kuò)增MdbHLH3的編碼框序列，之后連接PLB零背景載體。用H I和I對(duì)MdMYB308-PLB和pSPYNE分別進(jìn)行雙酶切，用H I和I對(duì)MdbHLH3-PLB和pSPYCE分別進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建NYFP-MdbHLH3和CYFP-MdMY308重組載體。將這兩個(gè)重組載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.8，洋蔥內(nèi)表皮浸入農(nóng)桿菌菌液30 min，轉(zhuǎn)入附加乙酰丁香酮（100 μmol·L-1）的MS固體培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)1—2 d。在激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，Zeiss 510 Meta）下觀察、掃描。

2 結(jié)果

2.1 蘋(píng)果MdMYB308的克隆與生物信息學(xué)分析

如圖1所示，以‘紫紅3號(hào)’誘導(dǎo)愈傷組織cDNA為模板，克隆得到一條大小約800 bp的條帶。對(duì)克隆片段回收測(cè)序發(fā)現(xiàn)，該基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為768 bp，編碼255個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為28.37 kD，理論等電點(diǎn)為8.94。

圖1 MdMYB308編碼區(qū)全長(zhǎng)的RT-PCR擴(kuò)增

如圖2所示，對(duì)來(lái)自不同物種的MYB家族基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。其中，蘋(píng)果與、、在同一進(jìn)化枝上，因此推測(cè)蘋(píng)果中與、、功能相似。利用NCBI蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，MdMYB308具有EAR抑制序列（圖3）。

2.2 愈傷組織花青苷積累對(duì)細(xì)胞分裂素濃度的響應(yīng)試驗(yàn)

從圖4、5可以看出，隨著培養(yǎng)基6-BA濃度的升高，愈傷組織中的顏色逐漸變深，花青苷含量也呈上升趨勢(shì)，6-BA濃度到達(dá)1 mg?L-1時(shí)，花青苷含量最高。

如圖6所示，愈傷組織在含1mg?L-16-BA的培養(yǎng)基培養(yǎng)20d后，與無(wú)分裂素培養(yǎng)基（對(duì)照）相比，花青苷合成相關(guān)基因表達(dá)量都有不同程度的上升，其中表達(dá)量約為對(duì)照的3—4倍，轉(zhuǎn)錄基因、的表達(dá)量是對(duì)照的4倍左右，而表達(dá)明顯被抑制。

圖2 花青苷合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化樹(shù)分析

圖3 花青苷合成MYB轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列比對(duì)

圖4 不同分裂素濃度下的蘋(píng)果愈傷組織

圖5 不同分裂素濃度對(duì)蘋(píng)果愈傷組織花青苷含量的影響

CHS：查爾酮合成酶；CHI：查爾酮異構(gòu)酶；DFR：二氫黃酮醇還原酶；UFGT：尿苷二磷酸葡萄糖﹕類(lèi)黃酮-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶；LDOX：花白素雙加氧酶；F3H：黃烷酮-3-羥化酶；MYB10：MYB家族轉(zhuǎn)錄因子；bHLH3：bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子；MYB308：MYB家族轉(zhuǎn)錄因子

2.3 MdMYB308 與 MdbHLH3 酵母雙雜試驗(yàn)

由圖7酵母雙雜交試驗(yàn)可得，空載體pGADT7和MdbHLH3+pGBKT7、空載體pGBKT7和MdMYB308 +pGADT7共轉(zhuǎn)Y2H均在二缺板上生長(zhǎng)，在四缺及四缺+X-α-gal不生長(zhǎng)；而MdbHLH3和MdMYB308共轉(zhuǎn)Y2H在二缺、四缺及四缺+X-α-gal都能生長(zhǎng)，因此推測(cè)其在酵母體內(nèi)能夠相互作用。

2.4 MdMYB308與MdbHLH3 雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)

將MdMYB308-NYFP和MdbHLH3-CYFP共同轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞，如圖8所示，通過(guò)激光共焦顯微鏡掃描得到洋蔥表皮核內(nèi)產(chǎn)生黃色YFP熒光信號(hào)。此外，單獨(dú)用空載CYFP與MdMYB308-NYFP共同轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到Y(jié)FP信號(hào)，因此推測(cè)其在植物體內(nèi)能夠相互作用。

3 討論

外源激素作為環(huán)境因素之一，對(duì)植物花青苷代謝合成具有重要作用[20-22]。其中，細(xì)胞分裂素促進(jìn)植物花青苷合成的研究已有諸多報(bào)道[23-24]。前人研究發(fā)現(xiàn)，6-BA濃度在10-9—10-6μmol?L-1有利于蘿卜細(xì)胞中花青苷的累積，但超過(guò)10-6μmol?L-1將抑制花青苷的合成[13]。在擬南芥中，細(xì)胞分裂素可以激活花青苷結(jié)構(gòu)基因、、、以及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，提高6-BA濃度促進(jìn)紅肉蘋(píng)果愈傷組織的花青苷合成；花青苷結(jié)構(gòu)基因、、與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、都有不同程度上升，而顯著下降，說(shuō)明細(xì)胞分裂素促進(jìn)紅肉蘋(píng)果愈傷組織花青苷的合成與結(jié)構(gòu)基因以及MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)有關(guān)。

SD/-T-L：缺少色氨酸、亮氨酸選擇性培養(yǎng)基；SD/-Trp-Leu-His-Ade：缺少色氨酸、亮氨酸、組氨酸、腺嘌呤選擇性培養(yǎng)基；SD/-Trp-Leu- His-Ade（X-α-gal）：缺少色氨酸、亮氨酸、組氨酸、腺嘌呤選擇性培養(yǎng)基并添加X(jué)-α- gal作為底物檢測(cè)β-galactosidase

CYFP：pSPYCE載體-CYFP熒光；NYFP：pSPYNE載體-NYFP熒光

目前，EAR元件是廣泛存在于植物轉(zhuǎn)錄因子中的一段保守抑制序列，在植物防御及非生物脅迫中具有重要作用[25-27]。MYB蛋白家族是植物中成員最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。在擬南芥中，AtMYB4蛋白首先被報(bào)道其C端存在EAR序列并通過(guò)直接綁定下游結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子發(fā)揮抑制作用[28-29]。在高等植物花青苷合成代謝途徑中，R2R3-MYB家族蛋白中的FaMYB1存在EAR元件，異源表達(dá)FaMYB1抑制煙草中花青苷的合成[30-31]。DUBOS等[17]發(fā)現(xiàn)，AtMYBL2作為一種存在EAR元件的新型抑制子與EGL3、GL3、bHLH轉(zhuǎn)錄蛋白結(jié)合調(diào)控花青苷的合成，而細(xì)胞分裂素可以降低的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，MdMYB308蛋白C端存在EAR元件并與MdbHLH3蛋白互作，說(shuō)明MdMYB308可能與MdbHLH3結(jié)合抑制蘋(píng)果花青苷的合成。

針對(duì)果樹(shù)特色種質(zhì)或新品種與傳統(tǒng)栽培品種在品質(zhì)性狀形成與調(diào)控機(jī)理方面的差異特點(diǎn)，借鑒模式植物的最新研究進(jìn)展與成果，結(jié)合現(xiàn)代分子生物技術(shù)與果樹(shù)配套栽培方法，完善理論體系解決生產(chǎn)難題，是近年來(lái)果樹(shù)研究領(lǐng)域理論聯(lián)系實(shí)踐的重要趨勢(shì)。激素調(diào)控植物花青苷代謝合成已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。本研究結(jié)果為蘋(píng)果生產(chǎn)栽培技術(shù)提供理論支持，并為進(jìn)一步選育具有高花青苷的蘋(píng)果品種奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在‘紫紅3號(hào)’葉片誘導(dǎo)的蘋(píng)果愈傷中，克隆了，進(jìn)化樹(shù)分析證明MdMYB308與AtMYB4、FaMYB1、AtMYBL2在同一進(jìn)化枝上，氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)MdMYB308存在EAR抑制序列；的表達(dá)受細(xì)胞分裂素6-BA的抑制；MdMYB308可以與MdbHLH3結(jié)合。結(jié)果表明MdMYB308可能作為抑制子參與細(xì)胞分裂素調(diào)控花青苷的合成。

[1] 王延玲, 張艷敏, 馮守千, 宋楊, 徐玉亭, 張友朋, 陳學(xué)森. 新疆紅肉蘋(píng)果果皮果肉呈色差異機(jī)理. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(13): 2771-2778.

WANG Y L, ZHANG Y M, FENG S Q, SONG Y, XU Y T, ZHANG Y P, CHEN X S. The mechanism of red coloring difference between skin and cortex in.(Dieck) Langenf., 2012, 45(13): 2771-2778. (in Chinese)

[2] ZHANG C Y, CHEN X S, HE T M, LIU X L, FENG T, YUAN Z H. Genetic structure ofpopulation from Xinjiang, China, revealed by SSR markers., 2007, 34(10): 947-955.

[3] 張艷敏, 馮濤, 張春雨, 何天明, 張小燕, 吳傳金, 劉遵春, 王艷玲, 束懷瑞, 陳學(xué)森. 新疆野蘋(píng)果研究進(jìn)展. 園藝學(xué)報(bào), 2009, 36(3): 447-452.

ZHANG Y M, FENG T, ZHANG C Y, HE T M, ZHANG X Y, WU C J, LIU Z C, WANG Y L, SHU H R, CHEN X S. Advances in research of the(Lebed.) Roem., 2009, 36(3): 447-452. (in Chinese)

[4] HU B, ZHAO J, LAI B, QIN Y, WANG H, HU G.is an anthocyanin-related glutathione s-transferase gene insonn., 2016, 35(4): 831-843.

[5] LI W, LIU Y, ZENG S, XIAO G, WANG G, WANG Y, PENG M, HUANG H W. Gene expression profiling of development and anthocyanin accumulation in kiwifruit () based on transcriptome sequencing., 2015, 10(8): e0136439.

[6] TOHGE T, ZHANG Y, PETEREK S, MATROS A, RALLAPALLI G, TANDRON Y A, BUTELLI E, KALLAM K, HERTKORN N, MOCK H P, MARTIN C, FERNIE A R. Ectopic expression of snapdragon transcription factors facilitates the identification of genes encoding enzymes of anthocyanin decoration in tomato., 2015, 83(4): 686-704.

[7] ZHAO X, YUAN Z, FENG L, FANG Y. Cloning and expression of anthocyanin biosynthetic genes in red and white pomegranate., 2015, 128(4): 687-696.

[8] GUAN L, DAI Z, WU B H, WU, J, MERLIN I, HILBERT G, RENAUD C, GOMES E, EDWARDS E, LI S H, DELROT S. Anthocyanin biosynthesis is differentially regulated by light in the skin and flesh of white-fleshed and teinturier grape berries., 2016, 243(1): 23-41.

[9] LU Y,ZHANG M,MENG X,WAN H,ZHANG J,TIAN J,HAO S,JIN K,YAO Y. Photoperiod and shading regulate coloration andanthocyaninaccumulation in the leaves of.,2015, 121(3): 619-632.

[10] MORO L, HASSIMOTTO N M A, PURGATTO E. Postharvest auxin and methyl jasmonate effect on anthocyanin biosynthesis in red raspberry (L.)., 2017, 4(1): 1-10.

[11] MOVAHED N, PASTORE C, CELLINI A, ALLEGRO G, VALENTINI G, ZENONI S, CAVALLINI E, DINCA E, TORNIELLI G B, FILIPPETTI I. The grapevine vviprx31 peroxidase as a candidate gene involved in anthocyanin degradation in ripening berries under high temperature., 2016, 129(3): 1-14.

[12] ZHANG H N, LI W C, WANG H C, SHI S Y, BO S, LIU L Q, WEI Y Z, XIE J H. Transcriptome profiling of light-regulated anthocyanin biosynthesis in the pericarp of litchi., 2016, 7(225): 963-976.

[13] OZEKI Y, KOMAMINE A. Induction of anthocyanin synthesis in relation to embryogenesis in a carrot suspension culture: correlation of metabolic differentiation with morphological differentiation., 1981, 53(4): 570-577.

[14] PECKET R C, BASSIM T A H. The effect of kinetin in relation to photocontrol of anthocyanin biosynthesis in., 1974, 13(8): 1395-1399.

[15] DEIKMAN J, HAMMER P E. Induction of anthocyanin accumulation by cytokinins in., 1995, 108(1): 47-57.

[16] DAS P K, DONG H S, CHOI S B, YOO S D, CHOI G, PARK Y I. Cytokinins enhance sugar-induced anthocyanin biosynthesis in., 2012, 34(1): 93-101.

[17] DUBOS C, LE G J, BAUDRY A, HUEP G, LANET E, DEBEAUJON I, ROUTABOUL J M, ALBORESI A, WEISSHAAR B, LEPINIEC L. MYBL2 is a new regulator of flavonoid biosynthesis in., 2008, 55(6): 940-953.

[18] CHEN X S, FENG T, ZHANG Y M, HE T M, FENG J R, ZHANG C Y. Genetic diversity of volatile components in Xinjiang wild apple ()., 2007, 34(2):171-179.

[19] JI X H , WANG Y T , ZHANG R, WU S J , AN M M, LI M, WANG C Z , CHEN X L , ZHANG Y M , CHEN X S. Effect of auxin, cytokinin and nitrogen on anthocyanin biosynthesis in callus cultures of red-fleshed apple (f.)., 2015, 120(1): 325-337.

[20] 劉靜軒, 許海峰, 王得云, 張宗營(yíng), 王意程, 左衛(wèi)芳, 王楠, 姜生輝, 毛志泉, 陳學(xué)森. 兩個(gè)耐貯性不同的紅肉蘋(píng)果株系果實(shí)硬度與香氣成分及相關(guān)酶活性與基因表達(dá)差異分析. 園藝學(xué)報(bào), 2017, 44(2): 330-342.

LIU J X, XU H F, WANG D Y, ZHANG Z Y, WANG Y C, ZUO W F, WANG N, JIANG S H, MAO Z Q, CHEN X S. Changes of firmness, aroma, cell wall-modifying enzyme activities and analysis of related-gene expression in 2 red flesh apple strains during fruit storage., 2017, 44(2): 330-342. (in Chinese)

[21] 許海峰, 王楠,姜生輝,王意程,劉靜軒,曲常志,王得云,左衛(wèi)芳,張晶,冀曉昊,張宗營(yíng),毛志泉,陳學(xué)森. 新疆紅肉蘋(píng)果雜種一代4個(gè)株系類(lèi)黃酮含量比較及其合成相關(guān)基因表達(dá)分析.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2016, 49(16): 3174-3187.

XU H F,WANG N,JIANG S H,WANG Y C,LIU J X,QU C Z,WANG D Y,ZUO W F,ZHANG J,JI X H,ZHANG Z Y,MAO Z Q,CHEN X S. Comparison of content and analysis of biosynthesis-related genes in flavonoid among four strains off.F1population.,2016,49(16): 3174-3187. (in Chinese)

[22] ZHANG Z Y, JIANG S H, WANG N, LI M, JI X H, SUN S S, LIU J X, WANG D Y, XU H F, QI S M, WU S J, FEI Z J, FENG S Q, CHEN X S. Identification of differentially expressed genes associated with apple fruit ripening and softening by suppression subtractive hybridization., 2015, 10(12): e0146061.

[23] AN X H, TIAN Y, CHEN K Q, LIU X J, LIU D D, XIE X B. MdMYB9 and MdMYB11 are involved in the regulation of the JA-induced biosynthesis of anthocyanin and proanthocyanidin in apples., 2015, 56(4): 650-662.

[24] SUN J J, WANG Y C, CHEN X S, GONG X J, WANG N, MA L, QIU Y F,WANG Y L, FENG S Q. Effects of methyl jasmonate and abscisic acid on anthocyanin biosynthesis in callus cultures of red-fleshed apple (f.)., 2017, 130:227-237.

[25] CIFTCI-YILMAZ S, MORSY MR, SONG LH, COUTU A, KRIZEK BA, LEWIS MW, WARREN D, CUSHMAN J, CONNOLLY EL, MITTLER R. The EAR-motif of the Cys2/His2-type zinc finger protein Zat7plays a key role in the defense response ofto salinitystress., 2007, 282(21):9260-9268.

[26] HIRATSU K, OHTA M,MATSUI K, OHME-TAKAGI M. The SUPERMANprotein is an active repressor whose carboxy-terminalrepression domain is required for the development of normalflowers., 2002,514(2):351-354.

[27] KAZAN K. Negative regulation of defence and stress genesby EAR-motif-containing repressors., 2006, 11(3):109-112.

[28] HEMM M R, HERRMANN K M, CHAPPLE C. AtMYB4:A transcription factor general in the battle against UV., 2001, 6(4): 135-136.

[29] JIN HL, COMINELLI E, BAILEY P, PARR A, MEHRTENS F, JONES J, TONELLI C. Transcriptional repression by AtMYB4 controls productionof UV-protecting sunscreens in., 2000, 19(22):6150-6161.

[30] AHARONI A, De VOS C, WEIN M, Sun Z, GRECO R, KROON A, MOL JN,O’CONNELL AP. The strawberry FaMYB1 transcription factorsuppresses anthocyanin and flavonol accumulation in transgenictobacco., 2001, 28(3):319-332.

[31] PAOLOCCI F, ROBBINS MP, PASSERI V, HAUCK B, MORRIS P, RUBINI A ARCIONI S, DAMIANI F. The strawberry transcription factorFaMYB1 inhibits the biosynthesis of proanthocyanidins in Lotuscorniculatus leaves., 2011, 62(3):1189-1200.

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Molecular Cloning and Expression Analysis of Cytokinins Responsive Gene

WANG Yicheng, WANG Nan, XU Haifeng, ZHANG Zongying, JIANG Shenghui, ZHANG Jing, QU Changzhi, CHEN Xuesen

(College of Horticultural Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an 271018, Shandong)

Cytokinin is an important hormone in the regulation of anthocyanin synthesis in plants. To develop the theory and technology for red flesh apple breeding, the function in the cytokinin regulating anthocyanin metabolism of MYB transcription factor genef.F1population was studied.The callus induced from the leaves of ‘Zihong No.3’ apple was used as materials. Theand anthocyanin biosynthesis related genes in callus which grown on different concentrations of 6-BA was studied by the qRT-PCR. Meanwhile, the interaction between MdbHLH3 and MdMYB308 was verified by yeast two-hybrid system and bimolecular fluorescence complementation assay.The full length of,,andare located in the same evolutionary branch. The aligned protein sequences revealed that MdMYB308 contain the EAR motif. Furthermore, the content of anthocyanin rose as 6-BA concentration increased as well. The transcript levels of anthocyanin structural genes (,,) and transcription factors (,) were significantly higher in callus grown on 1 mg?L-16-BA compared with 6-BA-deprived callus. In contrast, the expression ofwas inhibited. The results of yeast two hybrid experiments and bimolecular fluorescence complementation assays showed that the MdMYB308 could interact with MdbHLH3.Cytokinin (6-BA) could promote anthocyanin accumulation by down-regulating the expression ofwhich may destroy the combination of MdMYB308 and MdbHLH3.

apple; cytokinin;; yeast two hybrid experiments; bimolecular fluorescence complementation assays

2017-05-07；接受日期：2017-08-24

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFC0501505）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31730080）

王意程，Tel：18206381380；E-mail：2270841499@qq.com。通信作者陳學(xué)森，Tel：0538-8249338；E-mail：chenxs@sdau.edu.cn