陳琪　閔晶晶　王霄一

[摘要] 目的 探討MiR-30c-2-3p對足細胞活力及Nephrin和Podocin蛋白的表達影響。 方法 采用嘌呤霉素（PAN）誘導(dǎo)的足細胞體外模型，將足細胞分成4組，即空白組、PAN組、陰性質(zhì)粒+PAN組、陽性質(zhì)粒+PAN組。通過LipofectamineTM 2000瞬時轉(zhuǎn)染MiR-30c-2-3p mimic。通過Cell Counting Kit-8（CCK-8）法檢測細胞活力、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測細胞中MiR-30c-2-3p表達、Western blot檢測Nephrin和Podocin蛋白的表達。 結(jié)果 ①CCK-8結(jié)果提示PAN組足細胞活力明顯低于空白組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），陰性質(zhì)粒+PAN組較PAN組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），陽性質(zhì)粒+PAN組足細胞活力與PAN組和陰性質(zhì)粒+PAN組相比均有所提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。②qRT-PCR顯示PAN組MiR-30c-2-3p的表達較空白組明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；陰性質(zhì)粒+PAN組較PAN組表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），而陽性質(zhì)粒+PAN組MiR-30c-2-3p的表達較PAN組和陰性質(zhì)粒+PAN組均提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。③Western blot提示PAN組Nephrin和Podocin蛋白的表達較空白組明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；與PAN組相比，陰性質(zhì)粒+PAN組兩者蛋白的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），而陽性質(zhì)粒+PAN組Nephrin和Podocin蛋白的表達較單純PAN組和陰性質(zhì)粒+PAN組均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 PAN對足細胞的活力，MiR-30c-2-3p含量及Nephrin和Podocin蛋白的表達有抑制作用，而通過外源性增加MiR-30c-2-3p表達后可提高足細胞的活力，同時可增加Nephrin和Podocin蛋白的表達。

[關(guān)鍵詞] MiR-30c-2-3p；足細胞；嘌呤霉素；細胞活性；Nephrin；Podocin

[中圖分類號] R692 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（a）-0017-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of MiR-30c-2-3p on podocyte viability and Nephrin and Podocin protein expression. Methods The model of mice podocyte injury was induced by puromycin aminonucleoside （PAN） in vitro， the podocytes were divided into four groups： blank group， PAN group， negative plasmids+PAN group， positive plasmids+PAN group. The MiR-30c-2-3p mimics were transiently transfected with LipofectamineTM 2000， the cell viability was detected by Cell Counting Kit-8 （CCK-8）， the expression of MiR-30c-2-3p was detected by real-time quantitative PCR （qRT-PCR）， the expression of Nephrin and Podocin protein was detected by Western blot. Results ①CCK-8 showed that the viability of PAN group was significantly lower than that of the blank group， the differences were statistically significant （P < 0.01）. There was no significant difference between the negative plasmid+PAN group and the PAN group （P > 0.05）. The viability of positive plasmid+PAN group was significantly increased than that of the PAN group and the negative plasmid+PAN group， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. ②The expression of MiR-30c-2-3p in the PAN group was significantly lower than that in the blank group， the differences were statistically significant （P < 0.01）. There was no significant difference between the negative plasmid group and the PAN group （P > 0.05）. The content of MiR-30c-2-3p in the positive plasmid+PAN group was significantly higher than that of the PAN group and the negative plasmid+PAN group， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. ③The expression of Nephrin and Podocin in the PAN group were significantly lower than those in the blank group， the differences were statistically significant （P < 0.01）. There was no significant difference between the negative plasmid+PAN group and the PAN group （P > 0.05）. Compared with the PAN group and the negative plasmid+PAN group， the expression of Nephrin and Podocin in the positive plasmid+PAN group increased， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The PAN intervention inhibits the podocyte activity， MiR-30c-2-3p content， and the Nephrin and Podocin expression， but the exogenous expression of MiR-30c-2-3p can improve the viability of podocytes and increase the expression of Nephrin and Podocin protein.endprint

[Key words] MiR-30c-2-3p； Podocyte； Puromycin； Viability； Nephrin； Podocin

局灶節(jié)段性腎小球硬化性腎小球腎炎（FSGS）是兒童、中青年慢性腎臟病最主要的原因之一，其病理特點主要是局灶節(jié)段性腎小球硬化以及足細胞足突融合消失[1]，在過去20年中，F(xiàn)SGS發(fā)病率明顯增加[2]。MiRNAs是一類內(nèi)源性非編碼調(diào)控單鏈小RNA，其在轉(zhuǎn)錄后致使靶mRNA降解或蛋白翻譯抑制，從而參與機體多種生理病理過程。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，MiR-30家族在腎小球內(nèi)特異性的表達于足細胞[3]，給PAN大鼠尾靜脈注射MiR-30a質(zhì)粒后，大鼠足細胞損傷可被逆轉(zhuǎn)[1]，提示MiR-30家族對足細胞具有保護作用。但是，MiR-30家族成員眾多，其中哪個發(fā)揮主要保護作用仍需進一步研究。本課題組前期使用MicroRNA芯片分析比較了FSGS患者和正常人外周血液標本，發(fā)現(xiàn)FSGS患者組外周血MiR-30c-2-3p的表達較正常人組明顯降低[4]，因此有理由推測MiR-30c-2-3p可能在MiR-30家族中對足細胞起主要的保護作用。本研究通過建立嘌呤霉素（PAN）誘導(dǎo)足細胞損傷的體外模型，瞬時轉(zhuǎn)染MiR-30c-2-3p mimics，觀察其對足細胞活力及Nephrin和Podocin蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

mmu-MiR-30c-2* mimics、mmu-MiR-30c-2* mimics陰性組購買自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司，采用LipofectamineTM 2000（invitrogen）轉(zhuǎn)染。嘌呤霉素購買自Solarbio，以無菌PBS溶解，濃度為5 mg/mL，于4℃冷藏備用。重組的小鼠γ干擾素（IFN-γ）購買自Peprotech。Trizol購買自Invitrogen，SYBR？誖PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit購買自TaKaRa，熒光定量PCR上游引物mmu-MiR-30c-2*購買自生工生物工程（上海）股份有限公司。Nephrin和Podocin一抗購自Santa Cruz Biotechnology，山羊抗兔二抗和兔抗山羊兔二抗購買自Jackson，Tubulinβ抗體和GAPDH購買自華壹。

1.2 方法

1.2.1 足細胞培養(yǎng) 小鼠永生化足細胞株由英格蘭倫敦皇家醫(yī)學(xué)院贈送。小鼠足細胞使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素以及0.1 g/L鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，在恒溫37℃、濃度5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。未分化的小鼠足細胞系培養(yǎng)于含10 U/mL小鼠IFN-γ、在恒溫33℃、濃度5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)小鼠足細胞增生，待其長至80%左右，使用0.25%胰蛋白酶消化足細胞后，予傳代。再使用不含小鼠IFN-γ的培養(yǎng)液并置于恒溫37℃、濃度5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，促使足細胞分化，每2天換液1次，10～14 d分化成熟后用于本實驗。

1.2.2 實驗分組 將小鼠足細胞隨機分為4組，分別為空白組、PAN組、陰性質(zhì)粒+PAN組、陽性質(zhì)粒+PAN組。采用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染mmu-MiR-30c-2* mimics，質(zhì)粒終濃度均為50 nmol/L，轉(zhuǎn)染6 h后換液并進行藥物干預(yù)，PAN干預(yù)濃度為45 mg/L，藥物干預(yù)時間為48 h。

1.2.3 Cell Counting Kit-8法檢測足細胞活性 在96孔板中接種足細胞懸液 （濃度100 μL/孔）。每孔中加入10 μL的CCK-8反應(yīng)液。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)（在恒溫37℃，濃度5%CO2）孵育1 h。使用酶標儀測定450 nm處各組的吸光度。

1.2.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測細胞中MiR-30c-2-3p表達 用Trizol提取液提取小鼠足細胞的總RNA。使用SYBR？誖PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit進行反轉(zhuǎn)錄以及熒光定量PCR測量，檢測儀器使用ABI 7000HT熒光定量PCR儀，熒光定量PCR反應(yīng)條件為：先95℃ 30 s，再95℃ 5s，最后60℃ 31 s，40個循環(huán)，先95℃ 15 s，再60℃ 1 min，最后95℃ 15 s，1個循環(huán)。使用U6為內(nèi)參。以2-ΔΔCT值法表示相對定量結(jié)果。

1.2.5 Western blot檢測Nephrin和Podocin蛋白的表達 足細胞裂解后，先冰浴，再4℃下12 000 r/min離心10 min，收集上清液，使用BCA法檢測上清中蛋白濃度。依據(jù)各組蛋白濃度分別加入相應(yīng)體積的總蛋白與5×上樣緩沖液混合后煮沸5～10 min后上樣，然后進行SDS-PAGE 電泳。電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉封閉，加入一抗稀釋液稀釋的Nephrin、Podocin抗體（1∶1000）或Tubulin 抗體（1∶1000）、GAPDH抗體（1∶1000），4℃搖床孵育過夜。洗膜后使用稀釋好的二抗（辣根酶標記山羊抗兔二抗1∶5000）室溫下孵育2 h，洗膜，顯影、定影。最有由自動成像系統(tǒng)成像并分析數(shù)據(jù)。目標條帶與內(nèi)參蛋白的灰度值比值即其表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測細胞活性

各組CCK-8吸光度（OD450值）：空白組0.731±0.084；PAN組0.302±0.076；陰性質(zhì)粒+PAN組0.286±0.080；陽性質(zhì)粒+PAN組0.502±0.013。PAN組足細胞活力明顯低于空白組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），陰性質(zhì)粒+PAN組較PAN組活力比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），陽性質(zhì)粒+PAN組較PAN組及陰性質(zhì)粒+PAN組足細胞活力均提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。CCK-8法檢測結(jié)果提示PAN可以降低足細胞活性，而外源性增加MiR-30c-2-3p表達后可提高足細胞活力。endprint

2.2 實時熒光定量PCR檢測足細胞中MiR-30c-2-3表達

PAN組MiR-30c-2-3p的表達較空白組明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；陰性質(zhì)粒+PAN組較PAN組MiR-30c-2-3p的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），與PAN組及陰性質(zhì)粒+PAN組比較，陽性質(zhì)粒+PAN組MiR-30c-2-3p的表達不同程度增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。qRT-PCR結(jié)果提示PAN對足細胞MiR-30c-2-3p的表達有抑制作用，通過MiR-30c-2-3p mimics可以提高MiR-30c-2-3p表達。見圖1。

2.3 Western blot檢測Nephrin和Podocin蛋白的表達

PAN組Nephrin和Podocin蛋白的表達較空白組明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；陰性質(zhì)粒+PAN組較PAN組兩個蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），與PAN組和陰性質(zhì)粒+PAN組比較，陽性質(zhì)粒+PAN組Nephrin和Podocin蛋白的表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。Western blot結(jié)果提示PAN對足細胞Nephrin和Podocin蛋白的表達有抑制作用，而外源性增加MiR-30c-2-3p表達后可增加其表達。見圖2。

3 討論

MiRNAs是一類內(nèi)源性非編碼調(diào)控單鏈小RNA，通過與靶mRNA的3'端非翻譯區(qū)（3'UTRs）序列相互識別致使靶mRNA在轉(zhuǎn)錄后降解或蛋白翻譯抑制，從而參與機體器官生長分化、細胞增殖凋亡、腫瘤發(fā)生等多種生理病理過程[5]。目前人成熟MiRNAs已發(fā)現(xiàn)2000余個，研究估計MiRNAs調(diào)節(jié)所有蛋白質(zhì)中至少60%的編碼基因的表達[5]，在許多疾病病理發(fā)展過程中MiRNAs表達的異常改變也已被逐漸證實。

隨著對MiRNAs研究的深入，越來越多證據(jù)表明其參與了許多腎臟相關(guān)疾病的病理過程。如MiRNA介導(dǎo)了多囊腎大鼠模型的發(fā)病過程[6]；在致纖維化細胞因子TGF-β刺激的系膜細胞中存在著MiR-192表達的明顯增高；而在糖尿病鼠模型中腎小球MiR-192的表達也明顯增高，且MiR-192可通過下調(diào)E-box抑制物（δEF1或SIP1）的表達導(dǎo)致細胞外膠原沉積，引起腎小球硬化[7]；通過分析已知糖尿病腎病相關(guān)分子Gremlin的MiRNA的結(jié)合序列，發(fā)現(xiàn)了含有相同MiRNA結(jié)合序列的Jagged1及Hes1分子均與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[8]；將狼瘡性腎炎患者和IgA腎病患者同正常人腎組織進行對照后發(fā)現(xiàn)MiRNA表達有所不同[9-10]。有學(xué)者對IgAN患者MiRNAs表達譜進行分析研究后發(fā)現(xiàn)85～132個差異表達的MiRNAs[11-12]。有學(xué)者過對膜性腎病患者MiRNAs表達譜分析研究后發(fā)現(xiàn)326個差異表達的MiRNAs，這其中有286個表達下調(diào)，另有40個MiRNAs表達上調(diào)[13]。在由Dicer酶滅活的小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)多種MiRNAs水平下降，因此導(dǎo)致足細胞融合，系膜細胞基質(zhì)增生，腎小球硬化，以及足細胞Nephrin及Podocin的表達均減少[14]，這些小鼠在出生后4～6周即死于腎衰竭[15]。

MiRNAs與足細胞病變以及腎小球纖維化關(guān)系十分密切，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)AngⅡ通過下調(diào)miR-30s表達，激活calcium/calcineurin 通路，從而導(dǎo)致足細胞損傷[16]。MiR-30家族特異性表達于足細胞，并且在FSGS患者以及PAN大鼠模型中，都可觀察到miR-30家族的表達明顯下降，給PAN大鼠尾靜脈注射miR-30a質(zhì)粒后，其足細胞和腎小球損傷可被部分逆轉(zhuǎn)，且蛋白尿水平明顯下降[1]。而給予人足細胞多種損傷因素刺激后，MiR-30s表達水平明顯下調(diào)，而高表達MiR-30a的人足細胞則可對抗刺激因子所致?lián)p傷[1]。

本課題組前期通過使用高通量的miRCURYLNATM芯片分析對比了FSGS 患者和正常患者血清中差異表達的MiRNAs。經(jīng)初步分析發(fā)現(xiàn)，相較正常組，F(xiàn)SGS患者標本中有95個MiRNAs表達下調(diào)，如hsa-MiR-4520-5p、hsa-MiR-30c-2-3p、hsa-MiR-875-3p、hsa-MiR-583[4]，但并未發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)的差異MiRNAs。之后建立PAN誘導(dǎo)足細胞損傷的體外模型，通過瞬時轉(zhuǎn)染MiR-30c-2-3p mimics，觀察其對足細胞活力及Nephrin和Podocin蛋白表達的影響。通過CCK-8法本研究發(fā)現(xiàn)PAN可以降低足細胞活性，而外源性增加MiR-30c-2-3p表達后可提高足細胞活力。通過qRT-PCR我們發(fā)現(xiàn)PAN對足細胞MiR-30c-2-3p的表達有抑制作用，通過外源性增加MiR-30c-2-3p表達后可增加其表達。另外，Westenr blot結(jié)果提示PAN對足細胞Nephrin和Podocin蛋白的表達有抑制作用，而外源性增加MiR-30c-2-3p表達后可增加其表達。因此，MiR-30c-2-3p明顯對足細胞具有保護作用，其可能是MiR-30家族中對足細胞保護起重要作用的一員。但其具體保護機制目前尚不清楚，需進一步研究。有學(xué)者研究[17]發(fā)現(xiàn)MiR-30s的足細胞保護機制可能主要通過靶向調(diào)控TRPC6、calcineurin（PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1）以及NFATC3實現(xiàn)，對此，還需進一步研究證實。

目前FSGS的診斷主要依靠腎穿刺病理，其診斷準確性有待進一步提高，尤其是在與微小病變性腎?。∕CD）進行鑒別時，特別需要引入一種新型高效的鑒別方法。這些差異表達的MiRNAs可能成為FSGS診斷的新型生物標志物，也可為后期的功能研究奠定基礎(chǔ)。Mitchell等[18]在正常人和轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者血液中探索循環(huán)穩(wěn)定、易于檢測的MiRNAs，其發(fā)現(xiàn)miR-141在這兩組血清中的明顯差異性，證明了MiRNAs用作特異性診斷生物標志物的潛力。而細胞外MiRNAs作為一種新型的肺癌分子生物標志物正在被廣泛的研究[19]，也取得了一些不錯的成果。如果可以找到一種特異性相對較強的外周血MiRNAs無疑可以為FSGS的診斷提高準確性。已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)血清MiR-192，MiR-205，MiR-200a，MiR-200b和MiR-141在FSGS組的表達水平較MCD組與正常對照組均明顯升高[20]，但其特異性有待進一步驗證。本研究組下一步擬通過檢測MiR-30c-2-3p在其它病理類型的腎臟病患者中的表達情況，尤其是MCD的患者外周血液中，以進一步驗證MiR-30c-2-3p可能存在的特異性。endprint

綜上所述，本研究證實了MiR-30c-2-3p對足細胞具有保護作用，其保護作用可能為通過增加足細胞Nephrin、Podocin的表達而實現(xiàn)，但其具體保護機制仍需要進一步研究，本研究也為MiR-30c-2-3p作為足細胞損傷的特異性生物標志物提供了潛在的研究方向。

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（收稿日期：2017-04-14 本文編輯：蘇 暢）endprint