林小能

（福建省安溪縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，福建安溪 362400）

小反芻獸疫抗體檢測(cè)注意事項(xiàng)及結(jié)果分析

林小能

（福建省安溪縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，福建安溪 362400）

小反芻獸疫（PPR）又稱“羊瘟”，是傳入我國(guó)的外來(lái)動(dòng)物疫病，2007年7月首次在我國(guó)西藏阿里地區(qū)暴發(fā)，至今我國(guó)的遼寧、貴州、廣西等20多個(gè)省份均發(fā)生過(guò)小反芻獸疫疫情，死亡率最高可達(dá)100%，給疫情發(fā)生地區(qū)的養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。目前，該疫病尚無(wú)有效的治療方法，主要預(yù)防措施是做好免疫預(yù)防工作，因此如何評(píng)價(jià)免疫效果在該疫病的防控工作中具有重要的意義。

小反芻獸疫；競(jìng)爭(zhēng)ELISA；注意事項(xiàng)；結(jié)果分析

小反芻獸疫是一種急性、高度接觸性傳染病，主要感染山羊和綿羊，其中山羊比綿羊的易感性更強(qiáng)，潛伏期一般為3～10d，多數(shù)為4～5d，最長(zhǎng)也可以達(dá)到21d，多數(shù)羊發(fā)病后10d內(nèi)死亡；急性暴發(fā)期間發(fā)病率和死亡率均可達(dá)到100%；溫和發(fā)病期間，發(fā)病率仍然較高，但死亡率一般不超過(guò)50%。牛多呈亞臨床感染，并能產(chǎn)生抗體；豬表現(xiàn)為亞臨床感染，無(wú)癥狀，不排毒；野生動(dòng)物也偶然發(fā)生。山羊和綿羊接種小反芻獸疫弱毒疫苗后免疫力可持續(xù)36個(gè)月以上，為做好小反芻獸疫的免疫效果評(píng)價(jià)工作，本文主要介紹小反芻獸疫競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng)，并對(duì)安溪縣山羊養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）的免疫抗體水平進(jìn)行分析，旨在為做好小反芻獸疫抗體監(jiān)測(cè)工作提供幾點(diǎn)意見。

1 樣品來(lái)源

安溪縣以飼養(yǎng)山羊?yàn)橹?，本次?shí)驗(yàn)共隨機(jī)采集來(lái)自于全縣不同地理位置的小反芻獸疫免疫場(chǎng)（戶）43個(gè)（其中50只以上山羊養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）19個(gè)，每場(chǎng)（戶）采集血清樣品10份；10～50只的山羊養(yǎng)殖散戶24個(gè)，每戶采集血清樣品5份；采集時(shí)間為2017年5月17日至6月28日），共310份。樣品采集使用5ml/次性注射器和離心管，采集后放入便攜式冷藏箱中；樣品當(dāng)天室溫（20℃）放置1h（依室溫而定），待全血凝固并析出血清后，使用臺(tái)式高速離心機(jī)（型號(hào)：200TG16～WS）離心（8000轉(zhuǎn)離心4min，血清樣品均無(wú)溶血、無(wú)腐敗，符合檢測(cè)要求），離心后的血清樣品放入冰箱冷凍層（-15℃）保存待檢。

2 實(shí)驗(yàn)儀器

10ml量筒、200ml量筒、250ml燒杯、、96孔離心管架、普力菲爾超純水機(jī)（型號(hào)：FST-I-20）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)：DHG-9070）、快速混勻器（型號(hào)：SK-1）、酶標(biāo)分析儀（型號(hào)：RT-6000）、單道移液器（10～100uL）、單道移液器（100～1000ul）、8道移液器（30～300uL）、300ul移液槍頭、5ml離心管、一次性洗液皿、一次性吸水紙。

3 實(shí)驗(yàn)試劑

小反芻獸疫競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào)：20170504118，有效期：2017年11月3日）：已包被的ELISA板（96孔/板）、洗滌液（25×PBST）60ml/瓶、血清稀釋液50ml/瓶、陰性對(duì)照血清400uL/瓶、陽(yáng)性對(duì)照血清400uL/瓶、單克隆抗體150uL/瓶、兔抗鼠IgG-HRP結(jié)合物（酶標(biāo)二抗）150uL/瓶、底物溶液（TMB）15ml/瓶、終止液25ml/瓶。

4 實(shí)驗(yàn)步驟

4.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

將小反芻獸疫競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒從冷藏冰箱（2～8℃保存）中取出，將待檢血清從冰箱冷凍層中取出，按豎排列于96孔離心管架，并做好記錄（待檢血清設(shè)1孔、另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照血清2孔、陰性對(duì)照血清2孔、單克隆抗體對(duì)照4孔、空白對(duì)照2孔），待試劑和血清樣品恢復(fù)至室溫20～25℃（使用空調(diào)調(diào)節(jié)室溫）才可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)按需取出包被的ELISA板。

4.2 溶液配置

（1）使用量筒將洗滌液（25×PBST）用超純水（普力菲爾超純水機(jī)UP出水口收集）做25倍稀釋（如10ml洗滌液加240ml超純水），放入燒杯中混勻待用。

（2）使用單道移液器（100～1000μl）和單道移液器（10～100μl）將單克隆抗體和兔抗鼠IgG-HRP結(jié)合物（酶標(biāo)二抗）分別用血清稀釋液進(jìn)行1：100稀釋（如10μl單克隆抗體或10μl兔抗鼠IgG-HRP結(jié)合物加990uL血清稀釋液），分別放入5ml離心管中混勻，并做好標(biāo)記待用。

4.3 操作步驟

4.3.1 加樣

（1）取出ELISA板用單道移液器（10～100μl）將待檢血清（50μl）和陰陽(yáng)性血清（50μl）加入相應(yīng)孔中，單克隆抗體孔加入血清稀釋液50μl，空白對(duì)照孔加入血清稀釋液100μl。

（2）除空白對(duì)照孔外，其余各孔用8道移液器加1：100稀釋混勻后的單克隆抗體50μl，加樣完畢后置于快速混勻器中溫柔震蕩混勻，用封板膜封板后置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（溫度設(shè)置恒溫37℃）中孵育60min。

4.3.2 洗液

（1）恒溫37℃孵育60min后取出酶標(biāo)板（ELISA板），將板中的溶液甩干，將稀釋后的洗滌液（25倍稀釋后）混勻后倒入一次性洗液皿，用8道移液器加洗滌液（25倍稀釋后）300μl洗滌3次，并在吸水紙上甩干。

（2）每孔用多道移液器加入1：100稀釋后的兔抗鼠IgG-HRP結(jié)合物50μl，加樣完畢后將酶標(biāo)板置于快速混勻器中溫柔震蕩混勻，用封板膜封板后，再次置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（恒溫37℃）中孵育60min。

（3）恒溫37℃孵育60min后取出酶標(biāo)板，再次將板中的溶液甩干，用8道移液器加混勻后的洗滌液（25倍稀釋后）300uL洗滌3次，并在吸水紙上甩干。

4.3.3 檢測(cè)

（1）最后一次將酶標(biāo)板洗板并甩干后，每孔用8道移液器加入底物溶液50μl，之后置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（恒溫37℃）避光靜置反應(yīng)15min，同時(shí)將酶標(biāo)分析儀接通電源預(yù)熱。

（2）取出靜置反應(yīng)后的酶標(biāo)板，每孔用8道移液器加入終止液50μl，并立即用酶標(biāo)分析儀（設(shè)置450nm波長(zhǎng)）檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（10min內(nèi)測(cè)定）。

5 結(jié)果判定

陰性對(duì)照血清OD450nm值＜40%，陽(yáng)性對(duì)照血清OD450nm值＞60%，空白對(duì)照PI值≥5%，試驗(yàn)有效。PI值=[1-（樣品孔的OD450nm值/單抗對(duì)照孔的OD450nm值）]×100%。待檢血清PI≥45%，抗體陽(yáng)性；PI＜40，抗體陰性；40%＜PI＜45%，則判定可疑，重復(fù)檢測(cè)一次，根據(jù)所測(cè)PI值進(jìn)行判定，如果仍為可疑需再次檢測(cè)，或用其它方法檢測(cè)。診斷或流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，待檢血清PI≥50%，陽(yáng)性；PI＜50%，陰性。

6 注意事項(xiàng)

（1）洗滌液稀釋時(shí)應(yīng)使用UP出水口收集的超純水，避免因水質(zhì)不符合洗滌液要求，影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

（2）實(shí)驗(yàn)前應(yīng)注意讓試劑和血清樣品均恢復(fù)至室溫時(shí)才能開始。

（3）實(shí)驗(yàn)時(shí)如96孔ELISA板全部使用，單克隆抗體的稀釋液（1：100）應(yīng)比實(shí)際需要量多配備10份以上，建議配置5200μl以上（50uL*104，空白對(duì)照2孔無(wú)需添加）；兔抗鼠IgG-HRP結(jié)合物應(yīng)比單克隆抗體多配置2份，建議配置5300μl以上（50μl*106，96孔均需添加）；洗滌液（1：25）應(yīng)比實(shí)際需要量多配備一些，需配置172.8ml以上（300μl*96*6，96孔均需添加，共洗滌6次），建議配置250ml；避免因試劑在離心管、一次性洗液皿和移液槍頭中的殘留而導(dǎo)致的試劑量不足，需臨時(shí)配置現(xiàn)象，致使反應(yīng)時(shí)間不同步，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（4）酶標(biāo)板加單克隆抗體的稀釋液（1：100）或兔抗鼠IgGHRP結(jié)合物的稀釋液（1：100），樣品數(shù)量少時(shí)建議使用單道移液器，量多時(shí)可倒入一次性洗液皿，再使用8道移液器添加相應(yīng)試劑，以使反應(yīng)時(shí)間盡量一致。

（5）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)穿實(shí)驗(yàn)服，佩戴手套、口罩，相關(guān)試劑使用后均應(yīng)立即將試劑瓶旋緊，以免造成試劑的污染，影響今后的檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后廢棄的移液槍頭、一次性洗液皿、一次性吸水紙、酶標(biāo)板和用完的相關(guān)試劑瓶等均應(yīng)交由具備相關(guān)資質(zhì)的醫(yī)療廢棄物處理機(jī)構(gòu)回收處理，不得隨意丟棄，以免造成外界環(huán)境的污染。

7 結(jié)果及分析

7.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

7.2 結(jié)果分析

安溪縣有24個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)437個(gè)行政村，有山羊養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）的行政村204個(gè)，50頭以上山羊養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）70個(gè)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，安溪縣養(yǎng)羊場(chǎng)小反芻獸疫免疫抗體水平總體比較高，共檢測(cè)50只以上山羊養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）19個(gè)，其中抗體合格率低于70%的有3個(gè)，70～90%的有12個(gè)，達(dá)100%的有4個(gè)；共檢測(cè)10～50只山羊養(yǎng)殖散戶24個(gè)，其中抗體合格率低于70%的有0個(gè)，80%的有11個(gè)，達(dá)100%的有13個(gè)。總體看來(lái)安溪縣山羊小反芻獸疫的免疫抗體水平較高，免疫屏障穩(wěn)固，能有效降低感染小反芻獸疫的風(fēng)險(xiǎn)，避免疫情爆發(fā)時(shí)的急速擴(kuò)散而導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。個(gè)別養(yǎng)羊場(chǎng)（戶）的免疫抗體水平偏低，可能是免疫注射部位不當(dāng)（小反芻獸疫應(yīng)采用頸部皮下注射）或疫苗冷鏈不完全等因素所致，今后我縣將加強(qiáng)小反芻獸疫的免疫預(yù)防技術(shù)指導(dǎo)和免疫效果監(jiān)測(cè)工作，進(jìn)一步提高全縣的小反芻獸疫免疫抗體水平，鞏固免疫屏障，有效地預(yù)防小反芻獸疫的發(fā)生和流行。

[1]王君瑋，王志亮.生物安全實(shí)驗(yàn)室獸醫(yī)病原微生物操作技術(shù)規(guī)范[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009.

[2]王志國(guó).羊小反芻獸疫的綜合防控措施[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，2017，（4）：85.