商 惠, 徐心源, 梁靜鷗, 程 磊, 李建樹*(1. 四川大學 a. 高分子科學與工程學院 高分子材料工程國家重點實驗室,b. 華西口腔醫(yī)院 口腔疾病國家重點實驗室，四川 成都 610065)

·研究論文·

一種長鏈叔胺pH敏感抗菌牙體修復材料的合成與抗菌性能

商 惠1a, 徐心源1a, 梁靜鷗1b, 程 磊1b, 李建樹1a*
(1. 四川大學 a. 高分子科學與工程學院 高分子材料工程國家重點實驗室,b. 華西口腔醫(yī)院 口腔疾病國家重點實驗室，四川 成都 610065)

口腔粘結劑常被用于粘結復合樹脂和牙本質或牙釉質，但由于殘留細菌會導致繼發(fā)齲病從而使得粘結劑修復體不能提供長期療效，目前市場上使用的粘結劑均無法避免細菌滋生。本文采用兩步法合成了一種甲基丙烯酸酯基封端的長鏈叔胺，通過柱層析進行純化，其結構經1H NMR和FT-IR表征，并對其抗菌性能進行了研究。結果表明：該材料可通過質子化作用提升口腔pH值抑制細菌滋生。

長鏈叔胺; 合成; pH敏感; 抗菌性能; 牙體修復

近年來，“最小損傷”的口腔修復理念深入人心，在口腔修復領域占據著主導地位。促進完善“最小損傷”理論的一個重要技術進步就是粘結劑修復技術[1]。自1955年，Buonocore[2]將釉質酸蝕技術應用于口腔粘結劑后，修復就開始步入歷史舞臺。至今，口腔粘結劑已經歷了七代變革，從實際操作到產品性能均有了質的飛躍。但由于繼發(fā)齲的生成、修復體的斷裂以及邊緣微滲漏等使得口腔粘結劑修復無法長時間保持有效。修復材料引起細菌滋生和黏附是引發(fā)繼發(fā)齲的主要原因[3-4]。

因此，針對改善口腔粘結劑抗菌性的研究越來越多，其基本原則是不損傷粘結性能，添加某種具有抗菌性單體，例如季銨鹽、納米顆粒和其他具有抗菌作用單體等等。有研究者在粘結劑體系中引入了納米顆粒，在不影響原材料物理機械性能的前提下，利用納米顆粒的緩慢釋放達到長期有效抗菌的目的[5-8]。同時，也有研究者嘗試將一種新的季銨鹽單體加入粘結劑中，利用季銨鹽單體的碳碳雙鍵以光固化的方式與商業(yè)化粘結劑交聯在一起，能有效避免抗菌單體從粘結劑中滲出且這種單體有較好的抑菌能力[9]。季銨鹽的抗菌性優(yōu)異，但其細胞毒性和生物相容性不好。Palermo等[10]的研究中提到伯胺和叔胺的抗菌性及溶血性能與其質子化程度有關，即具有pH敏感性，而口腔粘結劑的應用環(huán)境存在著酸堿變化，使得叔胺的pH敏感性可以得到充分應用。

本文采用兩步法合成了一種甲基丙烯酸酯基封端的長鏈叔胺(MADMAE)，通過柱層析進行純化，其結構經1H NMR和FT-IR表征。并研究了其抗菌性能進行了研究。該材料可通過質子化作用提升口腔pH值繼而抑制細菌滋生，同時利用其叔胺基團質子化產生的正電荷吸附表面帶負電荷的細菌，并利用其長鏈破壞細胞膜的完整性達到殺菌效果。調節(jié)口腔微環(huán)境抑制細菌的滋生同時在細菌滋生的同時由具備殺菌作用為改性粘結劑提供了新的思路和途徑，另外叔胺類較低的細胞毒性也是一個不可忽略的優(yōu)勢。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UNITY INOVA-400型核磁共振儀(氘代氯仿為溶劑，TMS為內標)；Nicolet 6700型傅里葉紅外光譜儀(涂膜)；PHS-3C型pH計。

甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA， 98%)， 1-溴十二烷(98%)，N-甲氨-2-羥基乙胺(98%)，甲基丙烯酰氯(分析純)，對苯二酚(分析純)，上海阿拉??；三乙胺(分析純)，四氫呋喃(分析純)，二氯甲烷(分析純)，無水碳酸鈉(99%)，乙醇(分析純)，偶氮二異丁腈(98%)，堿性氧化鋁(98%)，石油醚(分析純)，四川海宏；4?分子篩，科龍試劑公司；實驗用水為去離子水。

1.2 合成

(1) DMAE的合成

在反應瓶中依次加入1-溴十二烷11.98 mL(49.9 mmol)、N-甲基-2羥基乙胺6.02 mL(76.5 mmol)、無水碳酸鈉6.00 g(56.6 mmol)和乙醇30 mL，攪拌下回流(60 ℃)反應8 h。抽濾除去溴化鈉和碳酸，濾液于50 ℃旋蒸使溶液中的溴化鈉和碳酸鈉析出，并除去乙醇和過量N-甲基-2-羥基乙胺，抽濾，濾液于25 ℃真空干燥過夜除去乙醇，經硅膠柱層析[洗脫劑：V(甲醇) ∶V(二氯甲烷)=1 ∶7,加入體積比4‰氨水]純化得DMAE。

(2) MADMAE的合成

將反應瓶用熱風槍烘烤以除去氧氣和水分，加入DMAE 0.805 g、三乙胺0.549 g、對苯二酚4.4 mg(摩爾比為1 ∶1.5 ∶0.01)和二氯甲烷10 mL，冰浴冷卻下滴加甲基丙烯酰氯0.386 mL，滴畢，于0 ℃避光回流反應8 h。旋蒸除去二氯甲烷，用四氫呋喃萃取，抽濾除去三乙胺鹽，濾液于30 ℃旋蒸除去四氫呋喃(析出三乙胺鹽)，抽濾除去三乙胺鹽，濾液通15 min氬氣，置于-20 ℃冰箱保存，經硅膠出層析[洗脫劑：V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=7 ∶1，加入體積比4‰氨水]純化得MADMAE。

1.3 pKa測試

DMAEMA、 DMAE和MADMAE在不同條件下的質子化程度及pKa值通過酸堿滴定實驗測得。測試方法：取 DMAEMA 30 mg溶解在5 mL去離子水中，并用0.1 mol·L-1鹽酸標準液調節(jié)pH至1.5，用0.1 mol·L-1NaOH標準液通過微量進樣泵按一定間斷時間滴加到溶液中并快速攪拌。通過pH計實時監(jiān)測隨著NaOH滴加產生的pH值變化并作圖得到pH滴定曲線。pKa值為pH滴定曲線上的兩個拐點的平均值。DMAE和MADMAE的pKa測試方法與上述方法一致，同時計算不同pH條件下物質質子化程度(α)。

1.4 抗菌性能測試

最小抑菌濃度(MIC)根據國家臨床實驗室標準委員會(NCCLS)制定的標準微稀釋法測定。將測試單體溶解于腦心浸液(BHI)液體培養(yǎng)基中，使用0.2 μm過濾器濾過抗菌液備用，挑選變異鏈球菌菌落3～5個，接種于4～5 mL BHI液體培養(yǎng)基中，于37 ℃兼性厭氧環(huán)境孵育12 h，增菌后的對數生長期菌液使用BHI液體培養(yǎng)基稀釋至0.33麥氏濃度，約為 108CFU·mL-1。將菌懸液進行1 ∶100稀釋后備用，取96孔板，加入2倍梯度稀釋的抗菌液，每組設置3個平行組100 μL，于每孔內加入100 μL菌液，于37 ℃兼性厭氧環(huán)境孵育24小時，以肉眼觀察藥物最低濃度無細菌生長者，即為該物質的MIC。

2 結果與討論

2.1 表征

(1)1H NMR

1H NMR譜圖能為研究分子的化學結構提供很多的信息，將原始的信號經過一系列的處理和傅里葉變換得到最直觀的信息就是化學位移。圖1為DMAE的1H NMR譜圖，從圖中可以看出，DMAE骨架上面的亞甲基、甲基a、 b、 c、 d、 e、 f、 g在核磁圖上分別出現特征峰，且通過積分得出a、 b、 c、 d、 e、 f、 g峰面積分別為0.58、 0.63、 0.68、 0.94、 0.62、 0.58、 0.96，峰面積比約為2 ∶2 ∶2∶3 ∶2 ∶2 ∶3，與實際DMAE碳鏈上碳原子所帶的氫原子比例相符合。通過核磁數據表明1-溴十二烷與N-甲氨-2羥基乙胺反應成功合成了DMAE。

圖2為MADMAEN的1H NMR譜圖。從圖中可以看出，DMAE與甲基丙烯酰氯反應后出現了雙鍵特征峰，并且通過積分得出了各個峰面積，與a、 b、 g三個碳原子所帶的氫原子比例相符合。表明形成了產物MADMAE合成成功。

δ圖1 DMAE的1H NMR譜圖Figure 1 1H NMR spectrum of DMAE

δ圖2 MADMAE的1H NMR譜圖Figure 2 1H NMR spectrum of MADMAE

(2) FT-IR

圖3為DMAE和MADMAE的FT-IR譜圖。由圖3可以看出，DMAE的特征峰是3 356.63 cm-1處的O—H伸縮振動峰和1 040.07 cm-1處的C—N伸縮振動峰；MADMAE的特征峰分別為1 722.61 cm-1處的C=O伸縮振動峰，1 162.95 cm-1處C—O伸縮振動峰以及1 638.78 cm-1處的C=C伸縮振動峰，同時伴隨著3 356.63 cm-1處的O—H伸縮振動峰消失。

ν/cm-1圖3 DMAE和MADMAE的FT-IR譜圖Figure 3 FT-IR spectra of DMAE and MADMAE

2.2 pKa測試結果

pKa是評價pH敏感材料潛在應用一個最為重要的參數。在本文研究中，為了測定不同分子準確的pKa值，我們通過標準酸堿滴定實驗來測定。如圖4a所示，隨著NaOH的滴加，DMAEMA的滴定圖中在pH=7.69和pH=8.91處有兩個轉折點，基于這兩點的可知DMAEMA的pKa值為8.29。根據對應的質子化程度圖圖4b可以看出在pH小于6時DMAEMA基本能完全質子化，進而說明在口腔的酸性pH環(huán)境下DMAEMA能完全質子化，隨著質子化程度的增加產生抗菌性。

V(NaOH)/μL

α圖4 電位計的酸堿滴定實驗，DMAEMA的滴定曲線(a)和質子化程度曲線(b)Figure 4 Titration curve(a) and protonation degree curve(b) of DMAEMA

圖5為DMAE的滴定曲線(a)和質子化程度曲線(b)。由圖5a所示，DMAE滴定曲線在pH=6.03和pH=7.22處有兩個轉折點，DMAE的pKa值為6.63。圖5b表明在外界環(huán)境pH低于5時，DMAE能完全質子化，這非常符合口腔齲病環(huán)境的應用條件。

圖6為MADMAE的滴定曲線(a)和質子化程度曲線(b)。由圖6a可見，在pH=4.15和pH=4.55處存在兩個轉折點，基于這兩點得到MADMAE的pKa值為4.43。圖6b表明MADMAE質子化程度要達到50%需要環(huán)境pH低于4.5，而完全質子化則需要pH低于3，如此極大地限制了MADMAE在口腔環(huán)境中的應用，也在一定程度上解釋了MADMAE缺乏抗菌性的原因。

V(NaOH)/μL

圖5 電位計的酸堿滴定實驗，DMAE的滴定曲線(a)和質子化程度曲線(b)Figure 5 Titration curve(a) and protonation degree curve(b) of DMAE

2.3 抗菌性能

化合物的MIC測試結果見表1所示。由表1可以看出，DMAE的抑菌濃度顯著低于DMAEMA，而MADMAE幾乎無抗菌性。原因可能是DMAE疏水長鏈的引入提高了叔胺質子化程度，從而提高了其抗菌性，而根據MADMAE的質子化數據可以看出變異鏈球菌在pH 4.5的酸性情況下質子化程度在50%左右，因而未體現出抗菌性。三種物質都是利用叔胺質子化達到抗菌的目的，而不同的結構使得其質子化程度不同從而影響抗菌效果，DMAEMA能在口腔齲病環(huán)境下完全質子化并未體現出其抗菌效果而DMAE在酸性條件下體現出良好的質子化效果和抗菌能力使其非常適合成為牙科粘結材料抗菌分子。

V(NaOH)/μL

圖6 電位計的酸堿滴定實驗：MADMAE的滴定曲線(a)和質子化程度曲線(b)Figure 6 Titration curve(a) and protonation degree curve(b) of MADMAE

表1 化合物的MIC數據Table 1 MIC data of the compounds

合成了一類新的叔胺分子用于牙科粘結材料，利用其叔胺基團質子化產生的正電荷與細菌細胞膜負電的靜電作用，達到與季銨鹽相似的作用機理進行殺菌。合成的DMAE既具有pH敏感性又具有良好的抗菌性，其可以在口腔齲病酸性環(huán)境下完全質子化，同時體現出良好的抗菌性。DMAEMA的pKa測定和抗菌測試結果表明其質子化程度很高但抗菌性卻很微弱。但在DMAE上引入雙鍵后的MADMAE因pKa值過低，而無法在變異鏈球菌的生長環(huán)境下產生較高程度的質子化，從而在抗菌實驗中無法體現抗菌性?；谝陨辖Y果，DMAE在三種分子中的質子化效果和抗菌性最佳，長鏈叔胺結構物質具有很好的pH敏感性可用于微環(huán)境的調控，但其抑菌濃度仍無法與現今常用的季銨鹽抗菌效果相較，還需進一步研究。

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SynthesisandAntibacterialActivityofALongChainTertiaryAmineStructurepH-ResponsiveandAntibacterialMaterialforToothRestoration

SHANG Hui1a, XU Xin-yuan1a, LIANG Jing-ou1b, CHENG Lei1b, LI Jian-shu1a*
(a. State Key Laboratory of Polymer Materials Engineering, College of Polymer Science and Engineering; b. State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, 1. Sichuan University, Chengdu 610065, China)

Dental adhesives are often used for bonding composite resin and dentin or enamel. Nowadays, dental adhesives have achieved strong adhesion stress and easier operation. Nevertheless, the restorative adhesives can not provide long-term efficacy because residual bacteria can cause secondary caries. All current dental adhesives can not resist bacterial growth. In this paper, a long chain tertiary amine structure pH-responsive and antibacterial material based on methylacrylic acid ester was synthesized by two steps reaction and the pure product was obtainedviacolumn chromatography. The structure was characterized by1H NMR and IR. The antibacterial activity was investigated. The results showed that it can maintain oral acid-base balance and avoid bacterial growth through its antibacterial effect.

tertiary amine; synthesis; pH-responsive; antibacterial activity; tooth restoration

2017-03-21;

2017-09-29

國家重點研發(fā)計劃(2016YFC1100404)； 國家自然科學基金資助項目(51573110)

商惠(1990-)，女，漢族，山東菏澤人，碩士研究生，主要從事生物醫(yī)用高分子材料的研究。 E-mail: huishanggz@163.com

李建樹，教授， Tel. 028-85466755， E-mail: jianshu_li@scu.edu.cn

TB324

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.11.17063