李雁斌，靳雙珍，楊玉坤，王德勛，戶艷霞，范志勇，蘇家恩

（1.云南省煙草公司大理州公司，云南 大理 671000；2.云南省煙草公司大理州公司劍川縣分公司，云南 大理 671300）

煙草精氨酸脫羧酶的蛋白質(zhì)特性分析

李雁斌1，靳雙珍1，楊玉坤2，王德勛1，戶艷霞1，范志勇1，蘇家恩1

（1.云南省煙草公司大理州公司，云南 大理 671000；2.云南省煙草公司大理州公司劍川縣分公司，云南 大理 671300）

為了研究參與煙草多胺合成的精氨酸脫羧酶的蛋白特性，運(yùn)用生物信息學(xué)的方法分析了煙草精氨酸脫羧酶的理化特性、系統(tǒng)進(jìn)化、氨基酸序列、保守區(qū)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：煙草精氨酸脫羧酶的等電點(diǎn)為4.99～6.78，氨基酸數(shù)為558～733，疏水性為-0.050～0.079，脂肪指數(shù)為88.04～92.08，不穩(wěn)定指數(shù)為39.54～44.14；經(jīng)進(jìn)化樹分析，煙草精氨酸脫羧酶分為2組，組1為NtCAD1、NtCAD2和NtCAD5，組2為NtCAD3和NtCAD4；經(jīng)序列比對(duì)分析，NtCAD1、NtCAD2和NtCAD5的同源性較高，NtCAD3和NtCAD4的同源性較高，且組2均具有1個(gè)精氨酸脫羧酶保守序列和2個(gè)丙氨酸消旋酶/Ⅳ組脫羧酶保守序列；煙草精氨酸脫氫酶各成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比例均為α-螺旋＞無規(guī)則卷曲＞β-折疊＞β-轉(zhuǎn)角。

煙草；精氨酸脫羧酶；蛋白特性；生物信息學(xué)

煙草是以收獲煙葉組織為主的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)物，煙葉在整個(gè)煙草植株上相對(duì)敏感的部位，易受到生物和非生物脅迫的危害，影響其產(chǎn)量與質(zhì)量，進(jìn)而損害煙農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收益。在生物或非生物脅迫條件下，多胺在植物防御反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。例如，多胺具有調(diào)節(jié)離子平衡的作用，主要為K+、Na+、Ca+等離子[1]；多胺可通過與核酸物質(zhì)的結(jié)合，調(diào)節(jié)應(yīng)激蛋白的翻譯和轉(zhuǎn)錄，參與氨基酸序列空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[2]。從原始底物精氨酸到生成多胺需要經(jīng)過多步酶促反應(yīng)，精氨酸脫氫酶是多胺合成反應(yīng)的第一個(gè)限速酶[3]。目前，關(guān)于精氨酸脫羧酶的研究，主要集中在康乃馨[4]、桃樹[5]、水稻[6]、棉花[3]等植物上，對(duì)于煙草精氨酸脫羧酶的研究，尤其是分子水平的研究報(bào)道較為鮮見。筆者從煙草精氨酸脫羧酶的理化特性、系統(tǒng)進(jìn)化、氨基酸序列、保守區(qū)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行分析，以期揭示煙草精氨酸脫羧酶的蛋白特性，為探索該蛋白的結(jié)構(gòu)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 煙草精氨酸脫氫酶基因家族成員的獲取

在Pfam[7]的數(shù)據(jù)庫中獲取具有精氨酸脫氫酶的序列文件（PF06314），且在NCBI[8]的蛋白數(shù)據(jù)庫檢索煙草精氨酸脫氫酶的氨基酸序列。以PF06314文件為參考，運(yùn)用HMMER[9]程序篩選已獲取的氨基酸序列，并除去重復(fù)序列，確定煙草精氨酸脫氫酶基因家族成員。

1.2 煙草精氨酸脫氫酶的蛋白質(zhì)特性分析

采用protParam[10]的理化特性分析工具，分析煙草精氨酸脫羧酶各成員的等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)、親水性、脂肪指數(shù)和不穩(wěn)定指數(shù)。利用ProbCons 1.12[11]在線服務(wù)，對(duì)煙草精氨酸脫氫酶的氨基酸序列進(jìn)行分析，并通過PhyML 3.1[12]工具將解析后的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，其迭代次數(shù)為100，獲得進(jìn)化樹。以Clustal[13]軟件對(duì)精氨酸脫氫酶的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并根據(jù)MEME[14]工具分析保守區(qū)域在序列上的分布。通過SOPMA[15]分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組成及其比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 精氨酸脫氫酶蛋白家族成員的篩選及理化特性

通過在線工具分析煙草精氨酸脫氫酶，結(jié)果表明如表1所示。煙草精氨酸脫氫酶具有5個(gè)家族成員，其等電點(diǎn)均小于7，以NtCAD4的等電點(diǎn)最大，為6.78，而NtCAD1的值最小，為4.99；各成員蛋白序列的氨基酸數(shù)目波動(dòng)范圍較大，處于558（NtCAD3）至733（NtCAD1）之間；NtCAD1、NtCAD2和NtCAD5的親水性均小于0，表明這3個(gè)蛋白質(zhì)具有親水性，NtCAD3和NtCAD4的親水性大于0，說明這2個(gè)蛋白具有疏水性；NtCAD3和NtCAD4的脂肪指數(shù)相對(duì)較大，具有較高耐熱性；因NtCAD2和NtCAD5的不穩(wěn)定指數(shù)小于40，屬于穩(wěn)定性蛋白，而NtCAD1、NtCAD3和NtCAD4的不穩(wěn)定指數(shù)大于40。各成員蛋白質(zhì)的氨基酸組成以絲氨酸（Ser）所占比例較大（除NtCAD1外）。綜上所述，煙草精氨酸脫氫酶各成員的理化特性存在差異，但NtCAD1、NtCAD2和NtCAD5較為相似，NtCAD3和NtCAD4較為相似。

表1 煙草精氨酸脫氫酶蛋白家族成員的信息

2.2 精氨酸脫氫酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹

以擬南芥的NP_195197和NP_179243蛋白序列，水稻的 XP_015631971、XP_015631972、XP_015631973、XP_015633833和XP_015643038蛋白序列與煙草精氨酸脫氫酶各成員的蛋白序列進(jìn)行同源比較，通過PhyML進(jìn)行聚類，結(jié)果如圖1所示。依據(jù)進(jìn)化樹的排布，將煙草精氨酸脫氫酶成員劃分為兩組，1組的成員為NtCAD1、NtCAD2和NtCAD5，2組成員為NtCAD3和NtCAD4；依據(jù)各分支的親緣關(guān)系，1組的煙草精氨酸脫氫酶與擬南芥的親緣關(guān)系較近，可信度為64%；2組的成員與水稻的親緣關(guān)系較近，可信度的100%。煙草精氨酸脫氫酶在單子葉植物和雙子葉植物植物中均有分布，說明該蛋白的分化較早，分化時(shí)間先于單子葉和雙子葉。

圖1 煙草精氨酸脫氫酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 精氨酸脫氫酶的序列比對(duì)

將煙草精氨酸脫氫酶的5個(gè)成員進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果如圖2所示。5個(gè)成員的蛋白序列中，既含有相同的氨基酸殘基，又存在氨基酸殘基數(shù)量和排列順序的差異，以NtCAD1、NtCAD2和NtCAD5的同源性較高，NtCAD3和NtCAD4的同源性較高。通過對(duì)序列保守區(qū)域的進(jìn)一步分析，每個(gè)序列均至少含有3種保守基序，分別為A、B和C；其中，NtCAD1、NtCAD2和NtCAD5蛋白的保守區(qū)域A位于68～107，保守區(qū)域B位于223～272，保守區(qū)域C位于490～540；而NtCAD2和NtCAD5的保守區(qū)域a位于601～648、保守區(qū)域b位于258～309，保守區(qū)域c位于355～409；保守區(qū)域A、C、a和c均具有丙氨酸消旋酶/Ⅳ組脫羧酶，保守區(qū)域B和b為精氨酸脫羧酶保守結(jié)構(gòu)域。NtCAD1、NtCAD2和NtCAD5的丙氨酸消旋酶/Ⅳ組脫羧酶保守區(qū)域分別分布在蛋白序列的兩端，即A保守域位于N-端，C保守域?yàn)镃-端，而NtCAD3和NtCAD4 的保守域均位于C-端，且保守域a位于C-末端。

2.4 精氨酸脫氫酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成為蛋白三維結(jié)構(gòu)及功能奠定基礎(chǔ)，因此采用在線工具分別預(yù)測煙草精氨酸脫氫酶β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如表2、圖3所示。NtCAD1、NtCAD2和NtCAD5的N-端二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲，NtCAD1的C-端以α-螺旋為主，NtCAD2和NtCAD5的C-端二級(jí)結(jié)構(gòu)的排布無明顯規(guī)律；NtCAD3和NtCAD4蛋白序列的N-端二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋，C-端以β-折疊為主。由表2可知，煙草精氨酸脫氫酶各成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比例均為α-螺旋＞無規(guī)則卷曲＞β-折疊＞β-轉(zhuǎn)角，而α-螺旋多集中在蛋白序列中部。

表2 煙草精氨酸脫氫酶各二級(jí)結(jié)構(gòu)的比例 （%）

圖2 煙草精氨酸脫氫酶的序列比對(duì)

3 結(jié)論與討論

研究了煙草精氨酸脫氫酶的理化特性、進(jìn)化樹、氨斟酸序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，煙草精氨酸脫氫酶成員NtCAD1、NtCAD2和NtCAD5為一組，NtCAD3和NtCAD4為另外一組，盡管如此，各成員的功能和特異性表達(dá)仍存在差異[3]。經(jīng)比對(duì)序列的保守區(qū)域分析，各成員蛋白序列除具有精氨酸脫羧酶保守結(jié)構(gòu)域外，同時(shí)具有丙氨酸消旋酶/Ⅳ組脫羧酶的保守結(jié)構(gòu)域。因此，該成員也屬于磷酸吡哆醛（PLP）依賴型家族，參與丙氨酸空間結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化[16-17]。經(jīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，煙草精氨酸脫氫酶成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)既有共性也存在差異，使煙草精氨酸脫氫酶的功能具備多樣性[18]。

圖3 煙草精氨酸脫氫酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)

[1] Alcázar R，Tiburcio A F. Polyamines：molecules with regulatory functions in plant abiotic stress tolerance[J]. Planta，2010，231（6）：1237-1249.

[2] Walters D. Resistance to plant pathogens：possible roles for free polyamines and polyamine catabolism[J]. New Phytologist，2010，159（1）：109-115.

[3] 李亞棟，默輝娟，王省芬，等. 棉花精氨酸脫羧酶基因GhADC1克隆與表達(dá)分析[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2013，25（4）：291-299.

[4] Chang K S，Sun H L，Hwang S B，et al. Characterization and translational regulation of the arginine decarboxylase gene in carnation（Dianthus caryophyllus L.）[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology，2000，24（1）：45-56.

[5] Liu J H，Ban Y，Wen X P，et al. Molecular cloning and expression analysis of an arginine decarboxylase gene from peach（Prunus persica）[J]. Gene，2009，429（1-2）：10-17.

[6] Akiyama T，Jin S. Molecular cloning and characterization of an arginine decarboxylase gene up-regulated by chilling stress in rice seedlings[J].Journal of Plant Physiology，2007，164（5）：645-654.

[7] Finn R D，Coggill P，Eberhardt R Y，et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future [J]. Nucleic Acids Research，2016，44（D1）：279-285.

[8] Edgar R，Domrachev M，Lash A E. Gene Expression omnibus：NCBI gene expression and hybridization array data repository[J]. Nucleic Acids Research，2002，30（1）：207-210.

[9] Marchin M，Kelly P T，F(xiàn)ang J. Tracker：continuous HMMER and BLAST searching[J]. Bioinformatics，2005，21（3）：388-389.

[10] Liu S，Zhao Y，Zhang X，et al. Bioinformatic analysis of fanction and structure of putative nucleocapsid protein sequences of SARS-CoV[J].Progress in Biotechnology，2003，40（6）：454.

[11] Do C B，Brudno M，Batzoglou S. PROBCONS：probabilistic consistency-based multiple alignment of amino acid sequences[J].Genome Research，2004，15（2）：330-340.

[12] Guindon S. PHYML online—a web server for fast maximum likelihoodbased phylogenetic inference[J]. Nucleic Acids Research，2005，33（Web Server issue）：557-559.

[13] Larkin M A，Blackshields G，Brown N P，et al. Clustal W and Clustal X version 2.0[J]. Bioinformatics，2007，23（21）：2947-2948.

[14] Bailey T L，Elkan C. The value of prior knowledge in discovering motifs with MEME[J]. Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol，1995，（Bailey）：21-29.

[15] Geourjon C，Deléage G. SOPMA ：significant improvements in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments[J]. Computer Applications in the Biosciences Cabios，1995，11（6）：681-684.

[16] Mo H，Pua E. Up-regulation of arginine decarboxylase gene expression and accumulation of polyamines in mustard（Brassica juncea）in response to stress[J]. Physiologia Plantarum，2002，114（3）：439-449.

[17] Hao Y J，Kitashiba H，Honda C，et al. Expression of arginine decarboxylase and ornithine decarboxylase genes in apple cells and stressed shoots[J]. Journal of Experimental Botany，2005，56（414）：1105-1115.

[18] Hummel I，Bourdais G，Gouesbet G，et al. Differential gene expression of ARGININE DECARBOXYLASE ADC1 and ADC2 in Arabidopsis thaliana：characterization of transcriptional regulation during seed germination and seedling development[J]. New Phytologist，2004，163（3）：519-531.

Analysis of Protein Characteristics of Arginine Decarboxylase in Tobacco

LI Yan-bin1，JIN Shuang-zhen1，YANG Yu-kun2，WANG De-xun1，HU Yan-xia1，F(xiàn)AN Zhi-yong1，SU Jia-en1
（1. Dali Tobacco Company, Yunnan Tobacco Corporation, Dali 671000, PRC; 2. Jianchuan Tobacco Branch Company,Dali Tobacco Company, Yunnan Tobacco Corporation, Dali 671300, PRC）

In order to test the protein properties of arginine decarboxylase involved in tobacco polyam ine synthesis, the bio-informatics method was used in this study to analyze the physicochemical properties, phylogenetics, amino acid sequence alignment, conservative region and secondary structure of arginine decarboxylase in tobacco. The results showed that, in tobacco arginine decarboxylase, the isoelectric point was 4.99 to 6.78, the number of amino acids was 558 to 733, the hydrophobicity was -0.050 to 0.079, the fat index was 88.04 to 92.08, and the instability index was 39.54 to 44.14; in analysis of the phylogenetic tree, tobacco arginine decarboxylase divided into 2 groups, group 1 was NtCAD1,NtCAD2 and NtCAD5, and group 2 was NtCAD3 and NtCAD4; the sequence homology among NtCAD1, NtCAD2 and NtCAD5 was higher, the sequence homology between NtCAD3 and NtCAD4 was higher, and the two groups had one arginine decarboxylase conserved sequence and two alanine racemase/IVgroup decarboxylase conservative sequences; and the proportion of secondary structure of each member of arginine dehydrogenase in tobacco was that of α-helix ＞ that of random curl ＞ that of β-sheet ＞ that of β-turn.

tobacco; arginine decarboxylase; protein property; bio-informatics

Q557

A

1006-060X（2017）10-0001-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.010.001

2017-08-18

中國煙草總公司云南省公司資助項(xiàng)目（2015YN20；2016 YN10）

李雁斌（1987-），女，云南南澗縣人，助理農(nóng)藝師，主要從事煙葉生產(chǎn)工作。

蘇家恩

（責(zé)任編輯：成 平）