韓卓然，孫敬鋒，通信作者，劉軍鋒，郭永軍，邢克智，呂愛軍，YEONG Yiksung，尤宏爭

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毛蚶血細胞分類及吞噬功能研究

韓卓然1，孫敬鋒1，通信作者，劉軍鋒2，郭永軍1，邢克智1，呂愛軍1，YEONG Yiksung1，尤宏爭3

（1. 天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津300384；2. 天津市漁生堂生物技術(shù)有限公司，天津300404；3. 天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221）

通過光鏡觀察毛蚶血細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)，對其分類進行研究，分析不同類型血細胞吞噬能力，并研究溫度對血細胞吞噬功能的影響。結(jié)果鑒定出毛蚶血細胞中有3種類型：（1）大透明細胞，大小為（12.97±1.22）μm，核質(zhì)比為0.311±0.016，所占比例為（46.40±8.73）%；（2）顆粒細胞，大小為（9.98±1.85）μm，核質(zhì)比0.390±0.058，所占比例為（41.48±8.63）%；（3）小透明細胞，大小為（7.60±1.17）μm，核質(zhì)比為0.499±0.049，所占比例為（12.12±4.00）%。毛蚶血細胞在血淋巴液中的平均密度為（7.69±0.98）×106cell/mL。體外吞噬活性試驗表明，大透明細胞和顆粒細胞對酵母聚糖的吞噬率顯著高于小透明細胞，吞噬率分別為（61.77±3.30）%、（61.32±3.62）%、（16.59±3.88）%。于15、20、25、30、35 ℃溫度下進行毛蚶血細胞的吞噬試驗，結(jié)果表明溫度變化對血細胞吞噬能力產(chǎn)生明顯的影響，30 ℃條件下，血細胞的吞噬活性最強，吞噬率達到（51.49±4.22）%。

毛蚶；血細胞；分類；吞噬功能

貝類屬于低等無脊椎動物，不具有依賴淋巴細胞和抗體的獲得性免疫防御機制。血細胞是貝類抵御外來微生物侵襲的主要承擔者。貝類血細胞的吞噬作用是一種基本的原始防御機制，對貝類的免疫防御具有更為重要的意義。近年來，學者們對貝類血細胞的分類已有不少研究，目前，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、核質(zhì)比、免疫功能特點常常被用作貝類血細胞分類的重要依據(jù)[1]。但由于貝類種間的差異性和研究方法的不同，難以獲得統(tǒng)一的標準，所以造成了貝類血細胞分類上的復雜化，目前不同研究者的觀點存在很大分歧。

毛蚶（Lischke）屬軟體動物門，瓣鰓綱，蚶目，蚶科，毛蚶屬。在已有的毛蚶血細胞分類研究中，報道的結(jié)果目前并不統(tǒng)一。劉志鴻[2]通過形態(tài)學觀察，認為毛蚶血細胞可分為紅細胞、透明細胞、顆粒細胞和未知小細胞4個亞群。許秀芹等[3]利用流式細胞術(shù)分析毛蚶血細胞的側(cè)向角散射光信號和前向角散射光信號特征，認為可分為顆粒細胞和透明細胞2個亞群。本文以毛蚶血細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)特征為基礎(chǔ)進行分類，首次分析不同類型血細胞的核質(zhì)比和吞噬能力，并研究溫度對血細胞吞噬功能的影響，以期為毛蚶血細胞的亞群鑒定及免疫功能深入研究提供新的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

健康毛蚶（殼高30.0～42.0 mm；殼寬28.0～40.0 mm；殼長34.5～56.0 mm）購自天津市某水產(chǎn)批發(fā)市場，于實驗室暫養(yǎng)5 d，水溫20～25 ℃，每天換水一次。

1.2 血細胞分類和形態(tài)觀察

選取40只健康毛蚶，撬開貝殼，濾紙吸收水分后，用1 mL注射器從每只毛蚶閉殼肌血竇中抽出血淋巴液0.1～0.3 mL，加入到裝有等量Alsever抗凝劑[4]的Eppendorf（EP） 管中，然后將每個個體的血淋巴液混合均勻后分裝到EP管中。采用Neubauer氏血球計數(shù)板對血細胞進行活體觀察和計數(shù)。用瑞氏染液染色血細胞涂片，光學顯微鏡40×物鏡下觀察血細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)，計算不同類型血細胞的比例，在3張染色的涂片上，隨機測量25個不同類型血細胞的細胞核和細胞直徑，計算核質(zhì)比。

1.3 不同類型血細胞的吞噬活性

根據(jù)Bachère等[5]的方法制備酵母聚糖（Sigma公司）懸液。用PBS配制7 mg/mL濃度的酵母聚糖懸液，煮沸30 min，洗滌2次，最后懸浮在相同體積的PBS中，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。血淋巴液?jīng)過180 g，5 min，4 ℃條件下離心，收集血細胞，用PBS調(diào)整血細胞懸液濃度為1×106cells/mL。在血細胞懸液中加入酵母聚糖混勻，使酵母聚糖與血細胞數(shù)量的比例大約為5∶1，然后在室溫孵育60 min。吞噬試驗設置3個重復。隨機選取20個視野在油鏡下觀察，分別計算不同類型血細胞吞噬率。

吞噬率＝（有吞噬活性的血細胞數(shù)/被計數(shù)血細胞總數(shù)）×100％

1.4 不同溫度下的血細胞吞噬活性

于15、20、25、30、35 ℃溫度下進行毛蚶血細胞的吞噬試驗，每個溫度下設置3個重復。按1.3所述方法進行試驗，并計算吞噬率。

1.5 統(tǒng)計方法

應用SPSS統(tǒng)計軟件，方差分析和檢驗比較不同類型血細胞大小、細胞核大小、核質(zhì)比、吞噬率之間的差異顯著性，Duncan檢驗比較在不同溫度下血細胞吞噬率的差異顯著性。數(shù)據(jù)用平均值±標準差（）表示，＜0.05代表具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 血細胞形態(tài)學特征及分類

在瑞氏染色的血涂片上，根據(jù)形態(tài)特征不同，可以鑒定出毛蚶血細胞中有大透明細胞、顆粒細胞和小透明細胞3種類型（圖1：A，B，C，D）。除3種類型血細胞外，在涂片中還可觀察到少量血細胞由于受到理化因素作用導致胞漿崩解溶失之后殘留的細胞核（圖1：C，D）。表1顯示3種類型血細胞大小、細胞核大小和核質(zhì)比。統(tǒng)計分析表明細胞直徑、細胞核直徑和核質(zhì)比在3種類型血細胞之間都存在顯著性差異。

大透明細胞：細胞大多數(shù)呈卵圓形，體積最大，直徑在10.5～14.9 μm之間。細胞質(zhì)豐富，染色較淡，細胞質(zhì)外周多有不規(guī)則透明區(qū)域；胞質(zhì)內(nèi)顆粒較少，在靠近細胞核區(qū)域有少量藍紫色嗜堿性顆粒，偶爾能觀察到嗜酸性紅色顆粒。細胞核呈圓形，直徑在3.4～4.7 μm之間，居中或靠近細胞一端，核質(zhì)比最小，在0.29～0.35之間（圖1：C；表1）。

顆粒細胞：細胞大多數(shù)呈圓形，細胞直徑在6.8～12.6 μm之間，細胞質(zhì)通常較稠密，染色較深，胞質(zhì)中有大量大小不一的藍紫色嗜堿性顆粒。細胞核呈圓形，直徑在2.9～4.6 μm之間。大部分細胞的細胞核呈圓形，居中存在，核質(zhì)比在0.32～0.52之間（圖1：D；表1）。

小透明細胞：細胞大多數(shù)呈圓形，體積最小，細胞直徑在5.9～9.6 μm之間。細胞質(zhì)稀薄，染色較淺，胞漿內(nèi)無顆?；蚝苌佟＜毎|(zhì)內(nèi)有一顯著的細胞核占據(jù)細胞中央，核直徑在2.8～4.7 μm之間，核質(zhì)比最大，在0.42～0.57之間（圖1：B；表1）。

圖1 光鏡下毛蚶3種類型血細胞

（注：A為10×物鏡下3種類型血細胞；B為小透明細胞放大圖片；C為大透明細胞放大圖片；D為顆粒細胞放大圖片。LH 示大透明細胞，SH示小透明細胞，G示顆粒細胞，粗箭頭示殘留的細胞核，黑色細箭頭示藍紫色嗜堿性顆粒，白色細箭頭示紅色嗜酸性顆粒）

表1 毛蚶不同類型血細胞的細胞大小、核大小和核質(zhì)比（平均數(shù)±標準差）

毛蚶血細胞在血淋巴液中的平均密度為（7.69±0.98）×106cells/mL，其中大透明細胞、顆粒細胞、小透明細胞所占百分比分別為46.40±8.73、41.48±8.63、12.12±4.00。

2.2 不同類型血細胞的吞噬活性

光鏡下觀察顯示，大透明細胞、顆粒細胞和小透明細胞都對酵母聚糖顯示吞噬活性（圖2）。大透明細胞吞噬率最高，其次是顆粒細胞和小透明細胞，吞噬率分別為（61.77±3.30）%、（61.32±3.62）%、（16.59±3.88）%。結(jié)果表明，大透明細胞與顆粒細胞的吞噬率較強，兩者之間差異不顯著。小透明細胞吞噬率最低，與其他兩種類型血細胞比較，吞噬率具有顯著性差異（圖3）。

圖2 毛蚶3種類型血細胞的吞噬活性

（注：LH示大透明細胞，SH示小透明細胞，G示顆粒細胞，細箭頭示酵母聚糖顆粒，粗箭頭示殘留在玻片上的細胞核）

圖3 毛蚶3種類型血細胞的吞噬率

（注：柱狀圖上方字母不同表示兩者之間吞噬率具有顯著性差異）

2.3 不同溫度下的血細胞吞噬活性

分別在15、20、25、30、35 ℃溫度條件下測定毛蚶血細胞吞噬活性。如圖4所示，30 ℃條件下，血細胞的吞噬活性最強，依次是25 ℃、20 ℃、35 ℃和15 ℃，吞噬率分別為（51.49±4.22）%、（48.37±7.24）%、（42.37±2.85）%、（40.89±3.08）%、（34.87±2.99）%。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，25 ℃和30 ℃時的吞噬率沒有顯著性差別，15 ℃時的吞噬率分別與25 ℃、30 ℃時的吞噬率具有顯著性差別，35 ℃和30 ℃時的吞噬率也具有顯著性差別。

圖4 不同溫度下毛蚶血細胞的吞噬率

（注：柱狀圖上方標注如有相同字母表明兩者之間差異不顯著）

3 討論

目前普遍認為，蚶類血細胞中一些類群能夠參與氧的運輸。而且，已有研究從毛蚶血細胞裂解液中分離到血紅蛋白[6]。因此，在蚶類血細胞中存在能夠產(chǎn)生血紅蛋白的紅細胞亞群。Hartman等[7]認為，細胞形狀與其氣體交換能力有關(guān)，相同體積下，橢圓形的細胞比圓形細胞更利于氧的運輸。本試驗中觀察到，大透明細胞大多呈橢圓形，筆者認為這種大透明細胞在功能上對應的是具有氧運輸能力的紅細胞，其細胞質(zhì)外周有不規(guī)則透明區(qū)域可能與氧的運輸過程有關(guān)。大透明細胞細胞質(zhì)豐富，染色較淡，胞質(zhì)內(nèi)顆粒較少，在靠近細胞核區(qū)域有少量藍紫色嗜堿性顆粒，偶爾能觀察到嗜酸性紅色顆粒。顆粒細胞胞質(zhì)稠密，染色較深，胞質(zhì)內(nèi)顆粒較多，能夠觀察到大量大小不一的藍紫色嗜堿性顆粒。根據(jù)張維翥等[8]的觀點，嗜堿性顆粒多數(shù)為細胞吞噬的異物，嗜酸性顆粒反映了水解酶的特性。本研究中還觀察到體積最小、核質(zhì)比最大的透明細胞，其顯著特點是一個突出的細胞核外圍包裹一層薄的細胞質(zhì)，這與大多數(shù)雙殼貝類中發(fā)現(xiàn)的透明細胞類似。在蚶類血細胞分類中，劉志鴻[2]將毛蚶的血細胞分為紅細胞、顆粒細胞、透明細胞、未知小細胞4種類型；許秀芹等[3]用流式細胞儀檢出毛蚶具有顆粒細胞和透明細胞2個細胞類型；朱澤聞等[9]對泥蚶分為紅色顆粒細胞、嗜堿性顆粒細胞和透明細胞3種類型。本研究通過光學顯微鏡觀察毛蚶血細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，將其分為3種不同類型，分別是大透明細胞、顆粒細胞、小透明細胞。這與劉志鴻[2]在毛蚶、朱澤聞等[9]在泥蚶中的研究結(jié)果基本一致。從形態(tài)上看，本研究中報道的毛蚶紅細胞比劉志鴻[2]報道的要小，而其他類型則相對大一些。目前人們對貝類血細胞的發(fā)生、多態(tài)性等方面了解的還很少，導致對貝類血細胞各亞型的劃分具有很大的人為性。在試驗過程中，血細胞預處理條件的不同可能會影響細胞的大小和形態(tài)，而且貝類年齡的差異或者血細胞處于不同發(fā)育階段也可能導致報道的毛蚶不同類型血細胞大小存在差異。

貝類血細胞的數(shù)量可能因種類不同而存在較大差異。即使同一種類也可能因不同的年齡、生理狀態(tài)、環(huán)境協(xié)迫和不同的研究方法而出現(xiàn)差異[10]。本試驗中，毛蚶血細胞計數(shù)為（7.69±0.98）×106cell/mL。與已報道的泥蚶[9]（3.29±0.82）×106cell/mL、櫛孔扇貝[11]（3.03±0.11）×106cell/mL、雜色鮑[12]（1.52±0.5）×106cell/mL等數(shù)據(jù)都有比較大的差別。在毛蚶中，大透明細胞所占比例最高，其次是顆粒細胞和小透明細胞。這與朱澤聞等[9]對泥蚶的研究結(jié)果基本一致。

吞噬作用是血細胞免疫防御相關(guān)的重要功能之一。本試驗結(jié)果表明，毛蚶不同類型血細胞都具有吞噬活性，但顆粒細胞與大透明細胞的吞噬活性較強。嗜堿性顆粒在大透明細胞和顆粒細胞中都有存在，可能與這兩種細胞具有較強的吞噬活性有關(guān)。貝類中顆粒細胞的吞噬作用已得到廣泛認同，如在近江牡蠣[13]、櫛孔扇貝[14]、泥蚶[9]等都報道了顆粒細胞的吞噬活性。在毛蚶大透明細胞中有少量的嗜堿性顆粒，偶爾能觀察到嗜酸性顆粒，在功能上除了具有運輸氧的能力外，還具有較強的吞噬活性。這是由于貝類免疫系統(tǒng)不完善，大透明細胞已經(jīng)分化出通常紅細胞具有的攜氧功能，但還需保留吞噬功能發(fā)揮抗菌作用[15]。

毛蚶血細胞的體外吞噬活性與溫度有明顯的相關(guān)性。在15 ℃條件下吞噬率最低；隨溫度升高，吞噬率逐漸增高，30 ℃時吞噬率最高；35 ℃時又有所降低。試驗結(jié)果與Fisher[16]關(guān)于牡蠣血細胞吞噬率隨溫度變化的研究結(jié)果基本一致。這種影響與溫度對貝類生長及生活狀態(tài)的影響規(guī)律一致。所以，可以參考不同溫度下吞噬活性來摸索貝類的最佳生長溫度條件。

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責任編輯：張愛婷

Studies on Hemocytes Types and their Phagocytic Ability in

HAN Zhuo-ran1, SUN Jing-feng1, Corresponding Author, LIU Jun-feng2, GUO Yong-jun1, XING Ke-zhi1, Lü Ai-jun1, YEONG Yiksung1, YOU Hong-zheng3

（1. Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Yushengtang Biotechnology Co. Ltd., Tianjin 300404, China; 3.Tianjin Fisheries Research Institute, Tianjin 300221, China）

Light microscopical studies were carried out to characterize the hemocytes of. According to the size, shape, and some structural characteristics of the cells, three types of hemocytes were identified：（1）Large hyalinocytes, with a size of（12.97±1.22）μm, N/C ratio of 0.311±0.016, and percentage of（46.40±8.73）%;（2）Granulocytes, with a size of（9.98±1.85）μm, N/C ratio of 0.390±0.058 and percentage of（41.48±8.63）%;（3）Small hyalinocytes, with a size of （7.60±1.17）μm, N/C ratio of 0.499±0.049, and percentage of（12.12±4.00）%. The mean hemocytes concentration was about（7.69±0.98）×106cell/mL. Phagocytic response to the zymosan showed that the phagocytic rate of large hyalinocytes （61.77±3.30）%, and granulocytes（61.32±3.62）%was significantly higher than that of small hyalinocytes（16.59±3.88）%. The influence of temperature at 15, 20, 25, 30and 35 ℃ on hemocyte phagocytosis was studied and the results showed percentage of phagocytosing hemocytes was highest at 30 ℃, reaching to（51.49±4.22）%.

; hemocytes; classification; phagocytosis

1008-5394（2017）03-0050-05

S 917.4

A

2016-09-30

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目“國家貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系天津綜合試驗站”（CARS-48）；天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊項目“現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系-水產(chǎn)-對蝦病害崗位”（ITTFRS2017009）及“現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系-水產(chǎn)-貝類養(yǎng)殖崗位”（ITTFRS2017013）；天津市科技計劃項目“天津市海水養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展戰(zhàn)略研究”（16ZLZXZF00210）

韓卓然（1992-），女，天津市人，碩士在讀，研究方向為水產(chǎn)動物免疫學。E-mail：hzr_0714@163.com。

孫敬鋒（1976-），男，山東東平人，教授，博士，研究方向為水產(chǎn)動物免疫學。E-mail：sun_jf@163.com。