李 賀， 姜 君， 蔣曉龍， 劉冠甫, 廉美蘭, 樸炫春

(延邊大學長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林 延吉 133002 )

東北刺人參不定根對LPS誘導小鼠腹腔巨噬細胞促炎介質的影響

李 賀， 姜 君， 蔣曉龍， 劉冠甫, 廉美蘭, 樸炫春*

(延邊大學長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林 延吉 133002 )

東北刺人參是五加科兼具觀賞和藥用價值的珍貴瀕危植物。為了促進東北刺人參產品的開發(fā)，在抗炎相關產品生產中以不定根代替短缺的野生植株作為植物材料。該研究利用誘導子未處理和處理的生物反應器培養(yǎng)的東北刺人參不定根水提物處理小鼠腹腔巨噬細胞，通過檢測巨噬細胞中一氧化氮(NO)和腫瘤壞死因子-(TNF-)及白細胞介素-1(IL-1)3種促炎介質的水平，探明不定根的抗炎活性。研究表明：2種東北刺人參不定根提取物中總酚和總黃酮含量有很大差異，誘導子處理的不定根水提物(E 2)中總酚含量是誘導子未處理不定根水提物(E 1)的3.2倍，而總黃酮含量是2.7倍。2種不定根提取物對NO和TNF-及IL-1的影響不同，E2對3種促炎介質均有顯著的抑制作用，但E1只抑制NO的生成，對TNF-及IL-1沒有影響，E2的抗炎效果高于E1。因此，今后在進行抗炎相關產品生產中，可利用在生物反應器培養(yǎng)中經誘導子處理的東北刺人參不定根作為原材料。

不定根；誘導子；巨噬細胞；促炎介質

東北刺人參(OplopanaxelatusNakai)又名刺參，五加科多年生落葉灌木，屬于國家二級保護植物，是兼具觀賞和藥用價值的珍貴植物[1]。東北刺人參分布區(qū)域較狹窄，國內主要分布于吉林省長白地區(qū)，國外僅在朝鮮和俄羅斯有少量分布[2]。東北刺人參具有極高的藥用功效，對神經衰弱、低血糖、糖尿病、心血管病、風濕等疾病有一定療效，并具有抗氧化、抗真菌、抗炎和抗癌[3-5]等作用。然而，近年來東北刺人參野生資源遭到嚴重破壞，且人工栽培體系尚未建立，植物材料嚴重短缺，因此，對東北刺人參的活性及其成分分離等方面研究的開展面臨困難，導致產品的開發(fā)和生產也受到限制。針對這些問題，采用植物細胞培養(yǎng)工程手段，將培養(yǎng)的細胞、組織或器官作為新植物材料源應用于產品生產中具有重要意義。目前，利用生物反應器大量培養(yǎng)植物細胞生產代謝產物的技術受到越來越多的關注，已報道的有貫葉連翹[6]、紫錐菊[7]等多種植物。東北刺人參的不定根生物反應器的培養(yǎng)方法方面，我們團隊進行了研究報道[8-9]。與其他生物活性研究受限一樣，目前尚無東北刺人參抗炎方面的研究報道。因此，該研究利用生物反應器培養(yǎng)的東北刺人參不定根提取物處理小鼠腹腔巨噬細胞，通過檢測巨噬細胞產生的一氧化氮(NO)和腫瘤壞死因子-(TNF-)及白細胞介素-1(IL-1)等促炎介質水平，初步探明東北不定根的抗炎活性，為今后東北刺人參抗炎特性和機制研究及其相關產品的開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

按李慧娟等[10]的方法用東北刺人參無菌播種苗誘導并增殖不定根。

1.2藥品

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)(Gibco公司，美國)、青霉素、鏈霉素和3-(4,5-二甲基噻唑-2 ) -2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(Sigma公司，美國)，IL-1β抗體(Cell Signaling Technology公司，美國)，脂多糖(LPS)和ATP(Invivogen公司，美國)，茉莉酸甲酯(Sigma，美國)，沒食子酸(上海遠慕生物科技有限公司，中國)和蘆丁(北京索萊寶科技有限公司，中國)。其余試劑均為市售分析純。

1.3儀器

酶聯免疫檢測儀(UV-2600，日本島津公司，日本)，蛋白質電泳及轉印設備(Bio-Rad公司，美國)，凝膠成像儀(LAS-3000，Fujifilm公司，日本)。

1.4動物

8周齡體重為(22±4) g的C57BL/6雌性小鼠，購于長春億斯實驗動物技術有限責任公司，許可證編號為SCXK(吉) -2011-0004。試驗前，將小鼠置于25 ℃，相對濕度(50±5)%的環(huán)境中進行適應性喂養(yǎng)，給予食物并自由飲水。試驗均符合動物倫理委員會標準。

1.5方法

1.5.1 不定根提取物的制備及其總酚和總黃酮含量的測定

將東北刺人參不定根切成約1 cm大小后，接種至5 L氣升式反應器中，接種量為5 g/L。反應器中加入4 L培養(yǎng)基不定根增殖生長培養(yǎng)基(MS+IBA 3 mg/L+蔗糖50 g/L，pH值5.8)，通入75 mL/min的氣體，在溫度約為25 ℃的條件下暗培養(yǎng)。不定根在反應器中培養(yǎng)30 d后，以茉莉酸甲酯(200M)作為誘導子，用濾膜(0.45m)濾菌后加入到培養(yǎng)基中處理8 d，培養(yǎng)天數共38 d的不定根和未加入茉莉酸甲酯培養(yǎng)38 d后收獲的不定根放置于45 ℃恒溫箱中烘干至恒重。將烘干的不定根樣品磨碎后，取15 g浸泡在200 mL的蒸餾水中超聲1 h后過濾，將收集的濾渣重復超聲2次，3次濾液合并后，45 ℃下進行真空減壓干燥(R206，上海慎科學技術有限公司，中國上海)，得到誘導子處理(E 1)和未處理(E 2)的兩種不定根提取物，放置于4 ℃下貯藏，備用。

將不定根提取物用70%乙醇溶解，并稀釋5 000倍后，以沒食子酸作為標準品利用紫外分光光度計于波長760 nm處測定總酚含量，而總黃酮含量以蘆丁作為標準品在510 nm處測定。

1.5.2 巨噬細胞的獲取

C57BL/6小鼠腹腔注射4%的2 mL巰基醋酸鹽培養(yǎng)液，4 d后獲得腹膜滲出細胞。將細胞培養(yǎng)在含10%FBS和抗生素(100 U/mL 青霉素和100g/mL 鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，過夜后去除上清液，獲得巰基醋酸鹽誘導的巨噬細胞。

1.5.3 不定根提取物對巨噬細胞活力的影響

將巨噬細胞接種于96孔板中，每孔細胞密度為8×104個。將2種不定根提取物E 1和E 2用二甲基亞砜(DMSO)溶解后，配置成25、50、100和200g/mL 4種不同濃度后處理巨噬細胞，孵育8 h后棄去培養(yǎng)基，并在每孔加入含有MTT(500g/mL)的DMEM培養(yǎng)基100L，在37 ℃和5%CO2下孵育4 h，棄去培養(yǎng)基。之后，每孔加DMSO溶解甲臜，用酶聯免疫檢測儀波長550處測吸收度，檢測提取物的細胞毒性，確定進一步抗炎活性試驗中的提取物濃度。

1.5.4 促炎介質水平的測定

將巨噬細胞接種于48孔板中，每孔的細胞密度為2.5×105個，并于培養(yǎng)箱(37 ℃和5%CO2)中孵育12 h后，將培養(yǎng)基棄掉，加入25、50和100g/mL的不定根提取物，未用提取物處理的加入DMEM培養(yǎng)基做為空白和對照組，孵育1 h后，提取物處理組和對照組中加入0.1g/mL LPS，空白組不加LPS。為了測定促炎介質NO的釋放量，在LPS刺激24 h后，取細胞上清液，采用Griess還原法于酶標儀450 nm處測定吸光值(OD)。促炎因子TNF-α的釋放量于LPS刺激6 h后，取細胞上清液，利用ELISA試劑盒，按照說明書操作，在酶標儀450 nm處測定。

為了測定促炎因子IL-1β蛋白水平，在48孔板中每孔加入2.5×105個巨噬細胞后，于37 ℃和5% CO2下孵育12 h，棄培養(yǎng)基，加入0.1g/mL LPS刺激3 h后，加入不同濃度的不定根提取物處理1 h，再加入5 mM ATP處理1 h后，離心取上清液。蛋白質經12% SDS-PAGE電泳分離后，用300 mA電流將蛋白質轉移到PVDF膜。用5%脫脂奶粉封閉1 h，并用IL-1β抗體(1∶1 000，4 ℃)中孵育過夜。最后，與HRP標記的二抗(1∶ 5 000，室溫)進行反應，并用ECL化學發(fā)光法顯影(LAS-3000)。

1.5.5 數據分析

試驗數據為平均值±標準差，利用Graphpad Prism 5軟件程序，采用t測驗對數據進行比較。

2 結果與分析

2.1不定根提取物中總酚及總黃酮的含量

利用生物反應器進行東北刺人參不定根培養(yǎng)時，為了提高不定根中活性物質含量，在培養(yǎng)30 d后加入誘導子處理8 d，所獲得的不定根的生物量與未經誘導子處理培養(yǎng)38 d的不定根無明顯差異，每個反應器均可得到約50 g不定根干品(數據沒顯示)。對2種不定根水提物中總酚和總黃酮含量進行測定的結果，E2中總酚和總黃酮含量均高于E1，總酚含量為E1的3.2倍，總黃酮為2.7倍(表1)。說明在生物反應器培養(yǎng)過程中利用誘導子處理東北刺人參不定根可提高活性物質的含量。東北刺人參2種不定根提取物因所含的酚和黃酮含量不同，在進一步的抗炎活性試驗中可能會產生不同的效果。

表1 東北刺人參2種不定根水提物中總酚和黃酮的含量

注：E1為反應器培養(yǎng)38 d的不定根水提物，E2為反應器培養(yǎng)30 d后誘導子處理8 d的不定根水提物，下同；與E 1比較，*P<0.05

2.2東北刺人參不定根提取物對巨噬細胞活性的影響

為了探明2種不定根水提物的抗炎活性，通過檢測不同濃度的提取物對小鼠巨噬細胞活性，確定了無毒性的提取物濃度用于進一步的試驗。由圖1可知，用25～200 μg/mL不定根提取物處理后，小鼠巨噬細胞的活性未出現抑制現象，說明此濃度范圍內的不定根提取物無毒性，在抗炎活性試驗中提取物濃度選擇低于200 μg/mL即可。

注：E1為反應器培養(yǎng)38 d的不定根水提物，E2為反應器培養(yǎng)30 d后誘導子處理8 d的不定根水提物

圖1東北刺人參不定根提取物對細胞活性的影響
Fig.1EffectofO.elatusadventitiousrootextractsoncellviability

2.3東北刺人參不定根水提物對促炎介質水平的影響

E1：為反應器培養(yǎng)38 d的不定根水提物；E2：為反應器培養(yǎng)30 d后誘導子處理8 d的不定根水提物；與LPS組比較，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

圖2東北刺人參不定根提取物對小鼠腹腔巨噬細胞NO和TNF-釋放量的影響

Fig.2EffectofO.elatusadventitiousrootextractsonNOandTNF-productionofPMs

E1：為反應器培養(yǎng)38 d的不定根水提物，E2：反應器培養(yǎng)30 d后誘導子處理8 d的不定根水提物；與LPS組比較，**P<0.01

圖3東北刺人參不定根提取物對小鼠腹腔巨噬細胞IL-1分泌的影響

Fig.3EffectofO.elatusadventitiousrootextractsonIL-1βproductionofPMs

3 討論與結論

將生物反應器培養(yǎng)的植物細胞、組織或器官作為原材料用于相關產品生產中是解決植物材料短缺的有效方法[11-13]。然而，欲使反應器培養(yǎng)的植物材料中活性物質生產量達到較高水平，在培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎上，使用誘導子最為有效。誘導子作為一種常用的非生物誘導子已在許多植物種的細胞和器官培養(yǎng)中得以應用，并發(fā)現其具有良好的促進活性物質積累的效果[14-16]。本研究中，東北刺人參不定根在生物反應器中培養(yǎng)30 d后，加入誘導子處理8 d，所得到的不定根中總酚和總黃酮含量顯著高于未經誘導子處理的不定根?？梢?，誘導子的使用是東北刺人參不定根生物反應器培養(yǎng)過程中提高活性物質含量的一個重要的措施。

東北刺人參作為具有極高藥用價值的珍稀植物，具有多種生物活性。然而，比起其它五加科植物，因資源的嚴重短缺，東北刺人參的相關研究受到阻礙，使得產品開發(fā)和生產受到限制[17]。 在東北刺人參抗炎方面的研究幾近空白的狀態(tài)下，該研究所進行的東北刺人參不定根抗炎活性的初步研究，對于今后進一步開展其抗炎特性和機制的研究及其相關產品的開發(fā)和生產具有極高的參考價值。研究發(fā)現：誘導子處理和未處理的2種不定根水提物對小鼠巨噬細胞的NO和促炎因子TNF-及IL-1的產生具有不同程度的抑制效果，誘導子處理的不定根水提物(E2)抑制NO、TNF-及IL-1的效果顯著，高于未經誘導子處理的不定根水提物(E1)。這可能與E2中含有的酚及黃酮含量多于E1有關，這種結果與許多研究所闡述的酚和黃酮具有抗炎作用相吻合[18-19]。因此，誘導子處理的不定根可用于東北刺人參抗炎相關產品的生產中，但對不定根的提取方法及抗炎特性及機制等方面需進行進一步的深入研究。

[1] 孫濤,龐立杰,王彥,等.東北刺人參的化學成分藥理作用及食用價值的研究進展[J].人參研究,2009(3):26-28.

[2] 劉迪,劉繼生,沈海龍,等.東北刺人參研究現狀與展望[J].延邊大學農學學報,2012,34(2):177-180.

[3] Kim J H,Eom S H,Lee H S,et al.Assessment on antioxidant properties ofOplopanaxelatusNakai in vitro[J].Kor J Med Crop Sci,2007,15:112-119.

[4] Liu P P,Qu Y,Dou D Q,et al.Determination of anti-cancer constituents inOplopanaxhorridusandOplopanaxelatus[J].J Chem Soc Pak,2012, 34: 417-423.

[5] 王廣樹,楊曉虹,徐景達.東北刺人參葉中四種新三萜皂苷的分離與結構鑒定[J].藥學學報,2004,39(5):354-358.

[6] 于曉坤,樸炫春,代月,等.貫葉連翹不定根反應器培養(yǎng)的初步研究[J].中國中藥雜志,2012,37(4):3808-3811.

[7] 楊世海,畢曉秀,楊慧潔,等.紫錐菊毛狀根誘導及離體培養(yǎng)[J].中國藥學雜志,2011,46(20):1557-1562.

[8] 李慧娟,廉美蘭,高日,等.鹽濃度、碳源和磷酸鹽濃度對東北刺人參不定根懸浮培養(yǎng)的影響[J].安徽農業(yè)科學,2012,40(22):11229-11230,11273.

[9] 于丹.誘導子對東北刺人參不定根中有效物質含量的影響及抗氧化活性研究[D].延吉：延邊大學,2015.

[10] 李慧娟.東北刺人參不定根反應器培養(yǎng)及其抗氧化活性的研究[D].延吉：延邊大學,2012.

[11] 邊黎明,施季森.植物生物反應器細胞懸浮培養(yǎng)研究進展[J].南京林業(yè)大學學報(自然科學版),2004,28(04):101-104.

[12] 陳海偉.植物組織培養(yǎng)研究進展[J].赤峰學院學報(自然科學版),2007,23(06):16-17.

[13] 岳才軍,劉永春.通過培養(yǎng)毛狀根生產藥物的研究進展[J].黑龍江八一農墾大學學報,2003,15(01):20-24.

[14] 楊靜,孫皓.不同誘導子對黃芪懸浮培養(yǎng)細胞中黃芪多糖積累的影響[J].安徽農業(yè)科學,2014,42(26):8954-8956,8959.

[15] 管桐,李賀,王洪秋,等.茉莉酸甲酯對生物反應器培養(yǎng)高山紅景天愈傷組織有效物質積累的影響[J].延邊大學農學學報,2017,39(01):24-28,34.

[16] 鄒凱,劉澤波,陳繼光,等.甜葉菊毛狀根的誘導培養(yǎng)及茉莉酸甲酯對其綠原酸類物質積累的影響[J].食品科學,2017,38(12)：89-95.

[17] 葛江麗,李成浩,劉芳,等.東北刺人參愈傷組織誘導和繼代的研究[J].安徽農業(yè)科學,2012,40(30):14660,14667.

[18] 蘇力德,代那音臺,烏恩齊,等.蒙藥薺菜總黃酮的提取及其抗炎作用研究[J].內蒙古民族大學學報(自然科學版),2016,31(01):64-67.

[19] 楊建華,孟新源,胡君萍,等.沙棗總酚抗炎作用研究[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(18):263-266.

EffectofOpolopanaxelatusNakaiadventitiousrootsonthelevelsofpro-inflammatorymediatorsinmacrophagesinducedbyLPS

LI He, JIANG Jun, JIANG Xiaolong, LIU Guanpu, LIAN Meilan, PIAO Xuanchun*

(KeyLaboratoryofNaturalResourcesofChangbaiMountain&FunctionalMoleculesofMinistryofEducation,YanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

OplopanaxelatusNakai is a plant of Araliaceae with ornamental and medicinal values. To promote the product development ofO.elatus, the adventitious roots replaced the field grown plants in the anti-inflammatory production. In the present study, the water extracts ofO.elatusadventitious roots, which cultured with the untreated bioreactor (E1) and the treated bioreactor with an elicitor (E2), was used to treat the peritoneal macrophages of the mice. The anti-inflammatory activity was investigated by measuring the levels of NO, TNF-, and IL-1β. In the water extracts of the E1 group and the E2 group, the total phenol and total flavonoid contents was different. The total phenol and the flavonoid contents in E2 group were 3.2 fold and 2.7 fold more than that in the E1 group. The effect of the both extracts on the production of NO, TNF-, and IL-1β was also different, three pro-inflammatory mediators were all inhibited by the E2 group, while only NO was inhibited by the E1 group; the anti-inflammatory activity of the E2 group was higher than that of the E1 group. Consequently, bioreactor cultured adventitious roots treated with elicitor can be used in the anti-inflammatory production ofO.elatusin the future.

adventitious root; elicitor; macrophage; pro-inflammatory mediator

2017-04-11

國家自然科學基金項目(31260182和31660080)

李賀(1991—)，女，吉林松原人，在讀碩士，研究方向為植物組織培養(yǎng)及生物反應器的應用。樸炫春為通信作者，

E-mail: mllian@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)03-0013-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.03.003

R285.5

A