任廣明，徐黎明，趙景壯，尹家勝，盧彤巖

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

香菇多糖提取物體外抗IHNV的機(jī)制

任廣明，徐黎明，趙景壯，尹家勝，盧彤巖

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

本研究以虹鱒性腺細(xì)胞（rainbowtrout gonad cell，RTG）為細(xì)胞模型，采用MTT法體外測(cè)定香菇多糖提取物的細(xì)胞毒性及其對(duì)傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）直接滅活、預(yù)防與生物合成的影響，探討香菇多糖提取物抗IHNV的作用機(jī)制。結(jié)果顯示：香菇多糖提取物對(duì)RTG細(xì)胞沒有毒性作用。濃度為100μg/mL時(shí)，香菇多糖提取物對(duì)IHNV的直接滅活能力為52.48%，預(yù)防效果為50.38%，抑制IHNV生物合成的能力達(dá)84.41%。結(jié)果表明：香菇多糖提取物具有一定的抗IHNV作用，該作用主要與抑制IHNV在細(xì)胞內(nèi)的生物合成有關(guān)。

香菇多糖提取物；抗IHNV；抗病毒機(jī)制

傳染性造血器官壞死病（Infectious hematopoietic necrosis，IHN）是影響我國(guó)鮭鱒漁業(yè)發(fā)展最為致命的病毒性疾病，其病原為傳染性造血器官壞死病病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）[1,2]。該病毒一旦侵入魚體，首先在魚體腎臟和脾臟造血組織增殖，進(jìn)入血液循環(huán)后便在魚體各個(gè)器官中繁殖，引發(fā)鮭鱒突發(fā)性死亡[3]。近些年來，我國(guó)鮭鱒主產(chǎn)區(qū)多次暴發(fā)大規(guī)模的IHNV事件。2009年甘肅省某大型虹鱒養(yǎng)殖場(chǎng)稚魚突然出現(xiàn)大面積死亡，死亡率約為90%[4]。2011年青海省大部分養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)IHN疫情，造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)47.1萬(wàn)元。2013年吉林省與遼寧省部分養(yǎng)殖場(chǎng)虹鱒大量死亡[5,6]。2014年北京市、四川省、山東省等地陸續(xù)暴發(fā)IHN疫情。中國(guó)農(nóng)業(yè)部《獸醫(yī)公報(bào)》發(fā)布的中國(guó)水生動(dòng)物疫病狀況報(bào)告顯示，2015年對(duì)10?。ㄊ校┰O(shè)置的253個(gè)監(jiān)測(cè)場(chǎng)點(diǎn)的監(jiān)測(cè)表明，陽(yáng)性樣品檢出率平均為5.4%[7]?？梢姡S著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，IHNV對(duì)冷水魚養(yǎng)殖業(yè)危害不斷擴(kuò)大，嚴(yán)重威脅健康養(yǎng)殖的發(fā)展。

多糖（polysaccharide）是一種天然的生物活性成分，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等作用[8]。研究表明，多糖可以激活T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞參與機(jī)體免疫，尤其是可以誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生、活化補(bǔ)體而抵抗病毒的侵襲[9]。多糖糖鏈中含有的模擬配體結(jié)構(gòu)與病毒具有一定的相似性，能夠阻斷病毒與宿胞表面結(jié)合，加強(qiáng)細(xì)胞修復(fù)及細(xì)胞膜的穩(wěn)定，抑制病原體的侵入。多糖還能夠通過阻止病毒在機(jī)體內(nèi)的復(fù)制起到抗病毒的作用。目前多糖在抑制和治療肝炎病毒、帶狀皰疹病毒、Abelson病毒、流感病毒中都顯示出誘人的應(yīng)用前景[10]。本研究以RTG細(xì)胞系為細(xì)胞模型，通過不同給藥方式分析香菇多糖Lentian提取物抗IHNV的能力，探索其抗IHNV機(jī)制，為香菇多糖提取物抗IHNV機(jī)制的深入研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 香菇多糖提取物

香菇多糖提取物由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院微生物系曲娟娟教授惠贈(zèng)。香菇多糖提取物用雙蒸水配成10mg/mL母液，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20℃保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)采用M199維持液稀釋至所需濃度。

1.1.2 細(xì)胞與毒株

IHNV毒株HLJ-15由黑龍江水產(chǎn)研究所水產(chǎn)病害實(shí)驗(yàn)室分離保存。虹鱒性腺細(xì)胞（rainbowtrout gonad cell，RTG）由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所魚病害研究室曾令兵教授惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 病毒滴度測(cè)定

用M199維持液10倍系列梯度稀釋（10-1～10-9）HLJ-15病毒株，分別加入到生長(zhǎng)良好的RTG細(xì)胞中（96孔板），每孔加入稀釋液體100μL，每個(gè)稀釋度設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，正常細(xì)胞（不接種病毒的細(xì)胞）為對(duì)照組。隨后置于15℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，逐日觀察細(xì)胞病變程度（Cytopathic effect，CPE）。培養(yǎng)終止后，結(jié)晶紫染色，根據(jù)Reed-Münch 公式計(jì)算病毒半數(shù)感染量（TCID50）[11]。lgTCID50=距離比×稀釋度對(duì)數(shù)之差+高于50%病變率的稀釋度的對(duì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 香菇多糖提取物的細(xì)胞毒性測(cè)定

將不同稀釋濃度的香菇多糖提取物溶液（12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL）加入到生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RTG細(xì)胞中（96孔板），每孔加入100μL，每個(gè)稀釋度設(shè)6個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組（不加入香菇多糖提取物稀釋液）和空白對(duì)照組（不接入細(xì)胞，不加入香菇多糖提取物稀釋液）。18℃下5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后取出培養(yǎng)板，MTT法測(cè)定細(xì)胞活性[12]。細(xì)胞存活率 =A香菇多糖組/A正常對(duì)照組×100%。

1.2.3 香菇多糖提取物抗病毒實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 香菇多糖提取物對(duì)病毒的直接滅活作用

將不同倍比稀釋的香菇多糖提取物溶液與100TCID50病毒液等體積混合，15℃孵育2h后，分別加入到已培養(yǎng)至單層的RTG細(xì)胞（96孔板）中，每孔100μL，于15℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后，吸棄培養(yǎng)液換用維持液。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞組（不加入香菇多糖提取物溶液、不接病毒）、病毒對(duì)照組（不加入香菇多糖提取物溶液）與空白對(duì)照組（不接細(xì)胞、不加入香菇多糖提取物溶液、不接病毒），每組設(shè)6孔重復(fù)，15℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察CPE情況，當(dāng)病毒對(duì)照組CPE達(dá)到75%以上時(shí)，記錄各組CPE（CPE判定標(biāo)準(zhǔn)：記錄“-”為正常細(xì)胞，“+”為 25%以上的細(xì)胞出現(xiàn) CPE，“++”為50%以上的細(xì)胞出現(xiàn)CPE?！?++”為75%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE），并采用MTT法測(cè)定香菇多糖提取物對(duì)病毒的直接滅活作用。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。病毒抑制率 =（A香菇多糖組-A病毒組）/（A正常對(duì)照組-A病毒組）×100%。

1.2.3.2 香菇多糖提取物對(duì)病毒的預(yù)防作用

將不同倍比稀釋的香菇多糖提取物溶液分別加入到培養(yǎng)至單層的96孔板RTG細(xì)胞中，每孔接入100μL，18℃培養(yǎng)2h后吸棄上清液，PBS清洗后，每孔分別接入100μL含100TCID50病毒懸液。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞組、病毒對(duì)照組與空白對(duì)照組，每組設(shè)6孔重復(fù)，15℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察CPE情況。當(dāng)病毒對(duì)照組CPE達(dá)到75%以上時(shí)，記錄各組CPE情況，用MTT法測(cè)定香菇多糖提取物對(duì)病毒的預(yù)防作用。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.3 香菇多糖提取物對(duì)病毒生物合成的抑制作用

將100μL含100TCID50病毒的懸液加入到已培養(yǎng)至單層的96孔板RTG細(xì)胞中，15℃培養(yǎng)2h后吸棄病毒液，PBS清洗后，每孔分別接入100μL含有不同倍比稀釋的香菇多糖提取物溶液。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞組、病毒對(duì)照組與空白對(duì)照組，每組設(shè)6孔重復(fù)，15℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察CPE情況。當(dāng)病毒對(duì)照組CPE達(dá)到75%以上時(shí)，記錄各組CPE情況，采用MTT法測(cè)定香菇多糖提取物對(duì)病毒生物合成的抑制作用。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS19.0軟件包中的單因素方差分析（one-way-ANOVA），樣本間行t檢驗(yàn)（P＜0.05）。采用Probit回歸分析法計(jì)算香菇多糖提取物對(duì)病毒的半數(shù)抑制濃度IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒滴度測(cè)定

據(jù) Reed-Münch法計(jì)算，HLJ-15病毒株的TCID50為10-7.5，即接種滴度為10-7.5的HLJ-15病毒懸液100μL可使50%的RTG細(xì)胞發(fā)生病變，本實(shí)驗(yàn)用病毒為100TCID50。

2.2 香菇多糖提取物對(duì)細(xì)胞的毒性

由圖1可知，香菇多糖提取物濃度為12.5～125μg/mL時(shí)，RTG細(xì)胞存活率達(dá)90%以上，其對(duì)RTG細(xì)胞的增殖作用差異不顯著（P＜0.05），對(duì)RTG細(xì)胞沒有毒性作用。當(dāng)香菇多糖濃度為100μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率達(dá)95%以上，此濃度即為香菇多糖作用于RTG細(xì)胞的最高安全濃度[13]。

圖1 香菇多糖提取物對(duì)細(xì)胞的毒性Fig.1 The cytotoxicity of Lentinan extracts to rainbow trout gonad cell（RTG）

2.3 香菇多糖提取物的抗病毒活性

2.3.1 香菇多糖提取物對(duì)IHNV的直接滅活作用

由表1可知，不同濃度的香菇多糖提取物均具有不同程度減輕細(xì)胞病變的作用，且隨著香菇多糖提取物濃度的增加，IHNV抑制率逐漸增高，表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。這一結(jié)果證明，香菇多糖提取物對(duì)IHNV具有直接滅活作用。當(dāng)濃度為1.56μg/mL時(shí)，香菇多糖提取物對(duì)IHNV的抑制能力達(dá)到9.70%；濃度為100μg/mL時(shí)，香菇多糖提取物對(duì)IHNV的抑制能力提高至52.48%，其IC50為115.94μg/mL。

表1 香菇多糖提取物對(duì)IHNV毒的直接滅活作用Tab.1 Effect of Lentinan extracts on direct inactivation of IHNV

2.3.2 香菇多糖提取物對(duì)IHNV的預(yù)防作用

由表2可知，香菇多糖提取物具有不同程度的預(yù)防細(xì)胞發(fā)生病變的作用，隨著香菇多糖提取物濃度的升高，其預(yù)防能力逐漸提高，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。濃度為1.56μg/mL時(shí)，香菇多糖提取物保護(hù)細(xì)胞免受IHNV侵染的能力為5.54%；隨著香菇多糖提取物濃度的增大，其保護(hù)細(xì)胞免受IHNV侵染的能力升高44.84%，即在濃度為100μg/mL時(shí)，香菇多糖提取物保護(hù)細(xì)胞免受IHNV的侵染能力達(dá)到50.38%?；貧w分析可知，香菇多糖提取物的IC50為91.26μg/mL。

表2 香菇多糖提取物對(duì)IHNV的預(yù)防作用Tab.2 Effect of Lentinan extracts on prevention of IHNV

2.3.3 香菇多糖提取物對(duì)IHNV生物合成的抑制作用

由表3可知，香菇多糖提取物均具有不同程度的抑制IHNV生物合成的作用。濃度為1.56μg/mL時(shí)，香菇多糖提取物抑制IHNV生物合成的作用僅為6.10%；隨著香菇多糖提取物濃度增至6.25μg/mL時(shí)，其抑制作用升高到47.80%；當(dāng)濃度為100μg/mL時(shí)，香菇多糖提取物對(duì)IHNV的生物合成抑制能力達(dá)到84.41%，香菇多糖提取物的IC50為 11.57μg/mL。

表3 香菇多糖提取物對(duì)IHNV生物合成的抑制作用Tab.3 Effect of Lentinan extracts on inhibition of IHNV biosynthesis

3 討論

IHNV屬于彈狀病毒科Rhabdoviridae諾拉彈狀病毒屬Novirhabdovirus，主要感染鮭鱒，包括虹鱒Oncorhynchus mykiss、大馬哈魚 Oncorhynchus、大西洋鮭 Salmo salar以及硬頭鮭（Steelhead，Salmon Gairdneri）等[14,15]。根據(jù)魚的種類、年齡、病毒株系以及環(huán)境條件的不同，IHN暴發(fā)可導(dǎo)致鮭鱒魚苗死亡率接近100%、成魚死亡率達(dá)到25%～30%[2]。中國(guó)已將IHN列為二類疫病[16]。

目前，我國(guó)尚無(wú)可用于防治IHN的有效藥物，主要以預(yù)防為主。傳統(tǒng)的抗生素類藥物防控IHN的效果甚微，且其在魚體殘留等問題，已經(jīng)被許多國(guó)家禁止使用[17]。由于致病毒株存在變異、受環(huán)境條件以及生物安全性等因素的制約，限制商品化疫苗的引入及其應(yīng)用。多糖為天然活性物質(zhì)，來源廣泛，提取成本低，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、抗病毒、抗炎癥、抑菌等生理功能。它能夠參與生命現(xiàn)象中如細(xì)胞分裂、細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸?shù)戎匾^程[18]。針對(duì)多糖抗病毒的特點(diǎn)，研究學(xué)者已開展大量的科學(xué)研究。目前，多糖對(duì)肝炎病毒、帶狀皰疹病毒、Abelson病毒、流感病毒等都展現(xiàn)出良好的抑制效果[10]。

目前，多糖抗病毒主要應(yīng)用于動(dòng)物病毒、植物病毒的研究，在水產(chǎn)動(dòng)物病毒防治的研究還鮮有報(bào)道。本研究以RTG細(xì)胞系為細(xì)胞模型研究香菇多糖提取物對(duì)IHNV所致細(xì)胞病變的抑制作用。結(jié)果表明：香菇多糖提取物對(duì)IHNV具有直接的滅活作用、預(yù)防作用及抑制病毒生物合成的作用，其中抑制病毒生物合成的作用更為顯著?？梢姡愎蕉嗵翘崛∥镆种艻HNV的作用機(jī)制可能存在多種途徑，抑制IHNV在細(xì)胞內(nèi)生物合成是香菇多糖提取物抗IHNV活性的重要途徑之一。這與已報(bào)道的鈍頂螺旋藻Spirulina platensis多糖[19]抑制單純皰疹病毒，板藍(lán)根Isatis Root多糖[20]抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的作用機(jī)制較為相似。已有研究發(fā)現(xiàn)，多糖能夠通過刺激巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，阻止病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制而起到抗病毒的目的[10]。

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Anti-IHNV Mechanism of Lentinan Extracts in vitro

REN Guang-ming,XU Li-ming,ZHAO Jing-zhuang,YIN Jia-sheng,LU Tong-yan
（Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

Anti-IHNV（Infectious hematopoietic necrosis virus）activity and antiviral mechanism of Lentinan extracts in vitro were investigated,cytotoxicity as an indicator,based on the cytopathic effect and MTT assay using rainbow trout gonad cell（RTG）lines to evaluate the role of Lentinan extracts in direct inactivation,prevention and the biosynthesis inhibition of IHNV.The results showed that the Lentinan extracts had little cytotoxicity to RTG cells,with direct inactivation rate of 52.84%,prevention rate of 50.38%and IHNV inhibition of 84.41%at mushroom extract concentration of 100 μg/mL.It is inferred that Lentinan extracts has the prominent anti-IHNV activity,and its antiviral mechanism might be primarily involved in the inhibition of intracellular IHNV biosynthesis.

Lentinan extracts;anti-IHNV;antiviral mechanism

S943

A

1005-3832（2017）05-0013-05

2017-04-18

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（HSY201514，2016HY-ZD0504）.

任廣明（1984-），女，博士研究生，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖方向研究.E-mail:gmr25@126.com

盧彤巖，研究員，從事水產(chǎn)病害研究.E-mail:lutongyan@hotmail.com