鄭 宇，常燕鋼，白曉磊，牟 俊，楊 帥，宋 佳，王 敏*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

混合微生物發(fā)酵生產(chǎn)啤酒醋及飲料開發(fā)

鄭 宇，常燕鋼，白曉磊，牟 俊，楊 帥，宋 佳，王 敏*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

以大麥芽為主要原料，進行啤酒醋發(fā)酵，調(diào)配制備麥香啤酒醋飲料。優(yōu)化后的啤酒醋發(fā)酵工藝條件為：麥芽糖化后接種啤酒酵母進行酒精發(fā)酵，24 h后接種生香酵母，繼續(xù)發(fā)酵4 d，啤酒酵母和生香酵母的添加比例為4∶1；醋酸發(fā)酵階段醋酸菌接種量為10%，30℃條件下發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束時啤酒醋酸度為（3.21±0.09）g/100 mL，乙醇含量＜0.05%vol。開發(fā)麥香啤酒醋飲料，最佳配方為啤酒醋12%，麥芽汁70%，白砂糖3%，橙色素0.04‰，最終產(chǎn)品的酸度為（0.38±0.07）g/100 mL，糖度為（84.32±0.05）g/L，酸糖比為1∶22。感官評定表明，該方法制備的麥香啤酒醋飲料色澤金黃、澄清透明、酸甜爽口，醋香和麥芽香氣濃郁。

大麥芽；生香酵母；啤酒醋；麥香啤酒醋飲料

食醋不僅是全球應(yīng)用廣泛的酸性調(diào)味料[1]，而且具有多種保健功能。明代李時珍的《本草綱目》中記載“醋能開胃、養(yǎng)肝、醒酒、消食”。醋飲料作為一種發(fā)酵型飲料產(chǎn)品，集食醋、飲料的優(yōu)點和營養(yǎng)價值于一身，深受廣大消費者青睞，近年來迅速發(fā)展，成為繼碳酸飲料、茶飲料、乳飲料之后的第四代飲料[2-3]。但是目前市場上出現(xiàn)的醋飲料多以果醋飲料為主，品種較為單一[4-5]。

啤酒是以大麥芽、酒花、水為主要原料，經(jīng)酵母發(fā)酵釀制而成的低酒精度酒，具有淡淡的麥芽香氣，被稱為“液體面包”[6]，深受消費者喜愛。風(fēng)味是評價啤酒質(zhì)量的指標(biāo)之一，啤酒的風(fēng)味口感受許多因素的影響（如酵母類型、麥芽型和發(fā)酵參數(shù)等），而啤酒中醇和酯的比例決定了啤酒的獨特口感；啤酒中酯類雖然含量較低但可以影響其他風(fēng)味成分的生成[7-9]。近年來，又特別針對駕車人群，開發(fā)了無醇啤酒（酒精度＜0.5%vol），雖然酒精度很低，但飲用較多無醇啤酒后，其血液檢測酒精含量仍在酒后駕車范圍之內(nèi)[10-11]。并且采用減壓蒸發(fā)、膜過濾等方法除去啤酒中酒精的同時會導(dǎo)致風(fēng)味物質(zhì)的損失[12-13]。以啤酒為原料進行醋酸發(fā)酵可以制備啤酒醋，工業(yè)上啤酒醋的生產(chǎn)中多采用醋酸菌進行純菌液態(tài)深層發(fā)酵，雖然生產(chǎn)效率較高，但存在風(fēng)味單一，口感較差等缺點。本研究以大麥芽為主要原料，經(jīng)糖化處理后利用釀酒酵母和生香酵母混合發(fā)酵的方法，改善啤酒醋的香氣，進一步開發(fā)一種無醇、酸甜適口、香氣濃郁的麥香啤酒醋飲料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

漢遜酵母（Hanseniaspora）S-04（上面酵母）、安琪生香釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurium）AC2005：天津科技大學(xué)工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室保存。

1.1.2 原料

麥芽（粉碎至40～60目）：天津科技大學(xué)食品加工中心。

1.1.3 培養(yǎng)基

醋酸菌斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏15 g/L，碳酸鈣20 g/L，瓊脂17 g/L，乙醇28 g/L，自然pH。

醋酸菌種子培養(yǎng)基：將制備好的啤酒過濾除去酵母，稀釋至乙醇28 g/L。

啤酒發(fā)酵培養(yǎng)基：15°Bx麥芽汁。

啤酒醋發(fā)酵培養(yǎng)基：根據(jù)需要將啤酒進行稀釋，用于啤酒醋發(fā)酵。

1.1.4 化學(xué)試劑

氫氧化鈉、無水乙醇：天津市元立化工有限公司；碳酸鈣：天津市天大化學(xué)試劑廠；無水葡萄糖：天津永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉：北京化學(xué)試劑公司；酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀：天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸銅：上海金山亭新化工試劑廠。實驗所用化學(xué)試劑均為分析純及生化試劑。

斐林甲液：稱取15 g硫酸銅（CuSO4·5H2O），0.05 g次甲基藍，用蒸餾水溶解并定容至1 L。

斐林乙液：稱取50 g酒石酸鉀鈉，54 g氫氧化鈉，4 g亞鐵氰化鉀，溶于蒸餾水并定容至1 L。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：天津永大化學(xué)試劑開發(fā)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

HYG-WI型回旋式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；YJ-875S醫(yī)用凈化臺：蘇州凈化設(shè)備廠；WS2-134-75電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市實驗儀器廠；GB204電子分析天平：上海奧豪斯儀器有限公司；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司；SBA-40C生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所；LD5-10型離心機：山東省科學(xué)院生物研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1 無醇啤酒醋飲料的工藝流程

1.3.2 麥芽糖化

（1）糖化：麥芽∶水=1∶4（即1 kg大麥芽加4 L自來水糖化）混合后，在65℃的水浴鍋中糖化1.5 h，不時攪拌。

（2）煮沸：糖化結(jié)束后，用3～6層紗布過濾，除去大麥芽沉淀。麥芽汁煮沸1 h，在煮沸20 min時添加4～5粒酒花，煮沸結(jié)束后，過濾除去漂浮物，得到麥芽汁，115℃滅菌，進行酒精發(fā)酵。

1.3.3 酵母活化

根據(jù)所需添加的酵母量，再加入酵母量的10～15倍的麥芽汁，在35℃的水浴鍋中活化30 min。

1.3.4 啤酒酒精發(fā)酵條件的優(yōu)化

（1）啤酒酵母與生香酵母添加比例的優(yōu)化

以15°Bx的麥芽汁進行啤酒發(fā)酵，分別以只添加啤酒酵母（0.52 g/kg）、啤酒酵母∶生香酵母比例2∶1～5∶1的添加量進行發(fā)酵，21℃靜置培養(yǎng)，每隔12 h進行質(zhì)量測定，連續(xù)兩次質(zhì)量測量差＜0.1 g表示發(fā)酵結(jié)束。比較啤酒酵母與生香酵母添加比例對產(chǎn)品的風(fēng)味、發(fā)酵周期的影響，選擇最優(yōu)的添加比例。

（2）啤酒酵母與生香酵母添加方式的優(yōu)化

初始發(fā)酵時同時接入兩種酵母，在21℃條件下發(fā)酵。或初始添加啤酒酵母，21℃條件下發(fā)酵24 h后，接入生香酵母，25℃條件下發(fā)酵。分析比較啤酒酵母與生香酵母添加順序?qū)Ξa(chǎn)品風(fēng)味的影響，選擇最優(yōu)的酵母添加順序。

1.3.5 啤酒醋酸發(fā)酵條件的優(yōu)化

（1）接種量對啤酒醋酸發(fā)酵的影響

取增香啤酒150 mL裝入500 mL的三角瓶中，分別按體積分?jǐn)?shù)5%、10%、15%的接種量接入巴氏醋桿菌，30℃、180r/min進行發(fā)酵。通過酸度及發(fā)酵時間的變化，分析不同的接種量對醋酸發(fā)酵的影響，并確定最適宜的接種量。

（2）發(fā)酵溫度對啤酒醋酸發(fā)酵的影響

按照體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入種子液，分別在28℃、30℃、32℃條件下進行啤酒醋酸發(fā)酵，測定發(fā)酵過程中酸度及菌體量的變化，確定最佳的發(fā)酵溫度。

1.3.6 麥香啤酒醋飲料調(diào)配

為了能使得到的麥香啤酒醋飲料符合消費者的口味，以啤酒醋、麥芽汁為主要原料，加入白砂糖、橙色素進行調(diào)配，確定最佳的調(diào)配比例。殺菌后充入CO2得到最終的麥香啤酒醋飲料。

1.3.7 麥香啤酒醋飲料配方單因素試驗

以感官評分為考察指標(biāo)，選取啤酒醋的添加量分別為8%、10%、12%、14%、16%、18%，麥芽汁添加量分別為55%、60%、65%、70%、75%、80%，白砂糖1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，橙色素0.02‰、0.03‰、0.04‰、0.05‰、0.06‰、0.07‰，調(diào)配后進行感官評價。

1.3.8 麥香啤酒醋飲料配方優(yōu)化

由單因素試驗設(shè)計4因素3水平的L9（34）正交試驗設(shè)計，優(yōu)化麥香啤酒醋飲料的配方，正交試驗因素與水平見表1。

表1 麥香啤酒醋飲料配方優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for malt aroma beer vinegar beverage formula optimization

1.3.9 麥香啤酒醋飲料的品質(zhì)分析

邀請生物工程專業(yè)學(xué)生10名（5男5女）對經(jīng)過調(diào)配的麥香啤酒醋飲料進行評分，滿分100分。感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 麥香啤酒醋飲料感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of malt aroma beer vinegar beverage

糖度測定：手持折光儀[14]?？偹釡y定：參照GB/T12456—2008《食品中總酸的測定》中的方法測定。乙醇含量的測定：SBA生物傳感儀測定[14]。還原糖的測定：參照GB/T 5009.7—2010《食品中總酸的測定》中的方法測定。OD610nm值的測定：紫外分光光度法對發(fā)酵液的菌體濃度進行測定OD610nm[14]。總酯的測定：硫酸反滴定法測定樣品總酯[15]。微生物測定：菌落計數(shù)法，MPN法測定大腸桿菌，致病菌參照GB/T22429—2008《食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速篩選檢驗酶聯(lián)免疫法》中的方法測定[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒酒精發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1 酵母添加比例的優(yōu)化

將活化好的啤酒酵母和生香酵母按表3比例接入15°Bx的麥芽汁進行酒精發(fā)酵。

表3 酵母添加比例對酒精發(fā)酵的影響Table 3 Effects of yeast addition on alcohol fermentation

由表3可知，當(dāng)只添加啤酒酵母時，乙醇含量最高，為6.07%vol，但是酯類物質(zhì)很少，啤酒的風(fēng)味不如添加兩種酵母發(fā)酵得到的啤酒佳，所以選擇添加兩種酵母進行啤酒發(fā)酵。隨著啤酒酵母與生香酵母添加比例的增加，乙醇含量逐漸增加，但變化不大，還原糖和總酯含量降低。經(jīng)過品嘗，酯含量太高和太低的啤酒風(fēng)味都不佳，啤酒酵母∶生香酵母為4∶1時，啤酒風(fēng)味較為合適，綜合考慮，選擇啤酒酵母∶生香酵母最佳比例為4∶1。

2.1.2 酵母添加方式的優(yōu)化

表4 酵母添加方式對酒精發(fā)酵的影響Table 4 Effects of yeast adding methods on alcohol fermentation

由表4可知，添加啤酒酵母后24 h添加生香酵母進行酒精發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束時，酯類物質(zhì)含量高，且啤酒風(fēng)味比同時添加兩種酵母的啤酒要醇香，所以選擇間隔添加兩種酵母進行啤酒發(fā)酵，得到啤酒成品。

2.2 啤酒醋酸發(fā)酵條件的優(yōu)化

圖1 發(fā)酵條件對醋酸發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of fermentation conditions on acetic acid fermentation

由圖1（a）可知，隨著接種量的增加，菌體生長速率增快，產(chǎn)酸速度也加快，但在發(fā)酵后期，接種量為10%和15%的醋酸發(fā)酵產(chǎn)酸沒有明差異，因此巴氏醋桿菌AC2005最佳接種量為10%。由圖1（b）可知，發(fā)酵溫度為30℃時，菌體產(chǎn)酸速速率最快，菌體生長穩(wěn)定，在醋酸發(fā)酵過程中過高的發(fā)酵溫度會增加醋酸對菌體的傷害[17]，因此確定30℃為醋酸發(fā)酵的最佳溫度。

根據(jù)優(yōu)化的發(fā)酵條件進行醋酸發(fā)酵，發(fā)酵過程曲線如圖2所示。

圖2 啤酒醋發(fā)酵過程曲線Fig.2 Fermentation process curves of beer vinegar

由圖2可知，隨著醋酸發(fā)酵的進行，發(fā)酵液中的乙醇含量不斷減小，發(fā)酵72 h結(jié)束時，啤酒醋的酸度達到了（3.21±0.09）g/100 mL，還原糖為（14.90±0.12）g/L，總酯含量（2.01±0.04）g/L，乙醇含量＜0.05%vol。

2.3 麥香啤酒醋飲料的調(diào)配

啤酒醋由于酸度較高，不宜直接飲用，所以對啤酒醋進行調(diào)配，以期得到一種風(fēng)味較好、符合大眾口味的啤酒醋飲料。調(diào)配的目標(biāo)主要是酸度比、麥芽汁添加量以及白糖和橙色素的添加量[18]。

2.3.1 麥香啤酒醋飲料配方優(yōu)化單因素試驗

圖3 各組分對啤酒醋飲料風(fēng)味的影響Fig.3 Effect of each component on beer vinegar beverage flavor

由圖3（a）可知，當(dāng)啤酒醋原液添加量＞14%時，醋酸味較重，刺激感明顯，添加量過低則沒有啤酒醋的香氣。麥香啤酒醋飲料中啤酒醋的添加量在10%～14%時，調(diào)配后的醋飲感官評分較高。因此，啤酒醋添加量選擇10%～14%較合適。

由圖3（b）可知，麥芽汁能夠賦予啤酒醋飲料特有的麥芽香氣，麥芽汁添加量過少則醋飲的麥芽香氣不足；添加量過多，則麥芽香氣過重，掩蓋了醋的香氣。麥香啤酒醋飲料中麥芽汁添加量在70%時，調(diào)配后的飲料的感官評分最高，因此，麥芽汁添加量選擇65%～75%較合適。

由圖3（c）可知，白砂糖添加量在2.5%～3.5%時感官評分較高，白砂糖較多時，口感甜度太濃，掩蓋原醋的酸味；含量太少，醋味的刺激較明顯。因此白砂糖添加量選擇2.5%～3.5%較合適。

由圖3（d）可知，橙色素添加量在0.05‰時，啤酒醋飲料色澤金黃，有光澤，透明澄清，調(diào)配后的醋飲料感官評分最高，因此橙色素添加量選擇0.04‰～0.06‰較合適。

2.3.2 麥香啤酒醋飲料配方優(yōu)化正交試驗

麥香啤酒醋飲料配方優(yōu)化L9（34）正交試驗結(jié)果與分析見表5。

由表5的極差分析可知，對麥香啤酒醋飲料產(chǎn)品影響因素由大到小的順序依次為啤酒醋（A）＞麥芽汁（B）＞白砂糖（C）=橙色素（D）；由K值確定最優(yōu)組合是A2B2C2D1，即啤酒醋12%、麥芽汁70%、白砂糖3%、橙色素0.04‰。由于該最優(yōu)組合并未在正交試驗中出現(xiàn)，為了進一步驗證結(jié)果，進行驗證性試驗，即按照最優(yōu)組合A2B2C2D1進行麥香啤酒醋飲料的調(diào)配試驗，感官評分為93分。

表5 麥香啤酒醋飲料配方優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for malt aroma beer vinegar beverage formula optimization

2.4 麥香啤酒醋飲料品質(zhì)分析

2.4.1 感官指標(biāo)

飲料色澤金黃清亮、具有麥芽香氣和啤酒獨特的口感，酸甜可口，感官評分為93分。

2.4.2 理化指標(biāo)

酸度：（0.38±0.07）g/100mL，糖度：（84.32±0.05）g/L，酸糖比為1∶22。

2.4.3 微生物指標(biāo)

菌落總數(shù)＜50 CFU/mL；大腸菌群＜1 MPN/100 mL；致病菌：未檢出。

3 結(jié)論

以大麥芽為主要原料，依次加入啤酒酵母和生香酵母混合發(fā)酵，制得香氣濃郁的啤酒，再經(jīng)過巴氏醋桿菌AC2005的二次發(fā)酵，得到啤酒醋，最優(yōu)的酒精發(fā)酵工藝為添加0.52 g/kg啤酒酵母，24 h后按啤酒酵母和生香酵母的添加比例為4∶1接種生香酵母；醋酸發(fā)酵工藝為接種量10%，發(fā)酵溫度30℃。發(fā)酵制得啤酒醋酸度（3.21±0.09）g/100mL，還原糖（14.91±0.12）g/L，總酯含量（2.01±0.04）g/L，乙醇含量＜0.05%vol。

通過正交試驗最終確定麥香啤酒醋飲料的配方為：啤酒醋12%、麥芽汁70%、白砂糖3%、橙色素0.04‰。最終產(chǎn)品的酸度為（0.38±0.07）g/100mL，糖度為（84.32±0.05）g/L，酸糖比為1∶22，感官評分為93分。

麥香啤酒醋飲料產(chǎn)品不僅保留了啤酒和醋飲料的營養(yǎng)價值和保健功能，還具有麥芽香味、啤酒本身具有的酯香以及醋特有的香味，酸味柔和適口，色澤清亮透明，符合大眾口味。

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Development of beer vinegar and the beverage by mix microorganisms fermentation

ZHENG Yu,CHANG Yangang,BAI Xiaolei,MOU Jun,YANG Shuai,SONG Jia,WANG Min*

(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,School of Biological Engineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Using barely malt as main raw material,beer vinegar was produced by fermentation and then malt aroma beer vinegar beverage was produced by blending.Beer yeast was inoculated to start alcohol fermentation after malt mashing,and then aroma-producing yeast was inoculated after 24 h fermentation which was continued for 4 d.The ratio of beer yeast and aroma-producing yeast was 4∶1.For acetic acid fermentation,acetic acid bacteria inoculum was 10%,fermentation temperature was 30℃,and the acetic acid of the beer was(3.21±0.09)g/100 ml and alcohol content was less than 0.05%vol.Malt aroma beer vinegar beverage was developed and the optimized formula was beer vinegar 12%,malt juice 70%,sugar 3%,citraurin 0.04‰.The acidity of the final product was(0.38±0.07)g/100 ml,the sugar content was(84.32±0.05)g/L,and the ratio of acid to sugar was 1∶22.The sensory evaluation results showed that malt aroma beer vinegar beverage was clear,delightful,in golden color and with malt flavor and vinegar aroma.Key words：barley malt;aroma-producing yeast;beer vinegar;malt aroma beer vinegar beverage

TS264.2

0254-5071（2017）10-0027-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.007

2017-07-19

國家自然科學(xué)基金資助項目（31471722）；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項目（201701180）；天津市科技支撐計劃（16YFZCNC00650）

鄭 宇（1980-），男，副教授，博士，主要從事食品發(fā)酵過程和微生物功能分析等方面的研究工作。

*通訊作者：王 敏（1971-），女，教授，博士，主要從事食品發(fā)酵機理解析與發(fā)酵技術(shù)等方面的研究工作。