崔金娟，謝漫媛，趙麗冰

(廣東省城市建設技師學院，廣州 510520)

紫外分光光度法測定醬油中苯甲酸含量的實驗優(yōu)化探究

崔金娟，謝漫媛，趙麗冰

(廣東省城市建設技師學院，廣州 510520)

苯甲酸(鈉)是醬油中的常用添加劑，國家標準對其使用量有嚴格限制。紫外分光光度法測定醬油中苯甲酸含量在實驗影響因素探究和樣品前處理方法優(yōu)化方面還有很大的研究空間。實驗對不同酸堿條件下苯甲酸溶液紫外吸收光譜、吸收峰波長及固定波長下的吸光度進行了實驗探究，用不同前處理方法進行樣品處理并進行了檢測結(jié)果的對比和分析，從提高分析結(jié)果準確度和精密度的角度提出了224 nm波長下測定的最佳酸堿性條件，以簡化方法、節(jié)約資源、提高效率為目標提出了樣品前處理優(yōu)選方案并進行了回收率測定和精密度實驗。

紫外分光光度；醬油；苯甲酸

近年來，用紫外分光光度法進行醬油中苯甲酸含量的測定取得了一定的研究進展。王金貴等[2]對所選擇的前處理方法中飽和氯化鈉溶液加入量、鹽酸加入量、振蕩時間、靜置時間等的影響進行了實驗研究并用紫外分光光度法在224 nm波長下進行了醬油中苯甲酸含量測定。汪曉璇等[3]采用多元線性回歸方法在225 nm波長下實現(xiàn)了醬油中苯甲酸和山梨酸含量的紫外分光光度法測定。吳勤民[4]通過蒸餾的方法進行樣品前處理，將對在樣品氧化的水浴溫度、蒸餾液體積、水浴時間等進行了實驗研究，將225 nm波長下采用紫外分光光度法和熒光光譜法測定醬油和食醋中苯甲酸含量的方法進行了比較。于曉萍[5]在223 nm波長下用紫外分光光度法對蜜餞中苯甲酸含量進行了測定。上述研究表明：紫外分光光度法測定苯甲酸含量是可行的，采用較多的醬油前處理方法是蒸餾法和萃取法，存在不同學者采用的測定波長不一樣、前處理添加的試劑種類和添加量各異、步驟繁瑣、耗時較長等方面的不足。

為了對紫外分光光度法測定醬油中苯甲酸含量的實驗條件和前處理方法進行優(yōu)化，提高測定效率、準確度和精密度，本實驗進行了不同酸堿條件下苯甲酸溶液紫外吸收光譜、吸收峰波長及固定波長下吸光度的探究，提出了測定的最佳波長及該波長下測定的適宜酸堿度條件；用不同前處理方法進行樣品處理并進行了檢測結(jié)果的對比和分析，提出了樣品前處理優(yōu)選方案并進行了回收率測定和精密度實驗。

1 實驗儀器和試劑

1.1 實驗儀器

島津UVmini-1240 紫外分光光度計(規(guī)格：190～1100 nm)、石英比色皿(1 cm)、電子天平、水浴鍋、精密pH試紙、玻璃儀器(不同規(guī)格容量瓶、燒杯、移液管、分液漏斗等)。

1.2 樣品和試劑

樣品：醬油樣品(超市購買)。

藥品：苯甲酸(AR)、6 mol/L鹽酸溶液、NaOH(AR)、NaCl(AR)、NaHCO3(AR)、乙醚等。

苯甲酸標準儲備液的配制(0.1000 mg/mL)：準確稱取0.1000 g苯甲酸，用15 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液溶解后轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻。

2 實驗方法和步驟

2.1溶液酸堿性對吸收光譜和吸收峰波長的影響實驗

準確移取含苯甲酸0.1000 mg/mL的苯甲酸標準儲備液8.00 mL 5份分別至5個100 mL容量中，其中1個容量瓶用超純水定容至刻度、搖勻，編號③，該溶液苯甲酸含量為8.00 μg/mL。另外4個容量瓶中依次加入6 mol/L HCl溶液1 mL、0.06 mol/L HCl溶液5 mL、0.01 mol/L NaOH溶液5 mL、1 mol/L NaOH溶液1 mL后用超純水定容至刻度、搖勻，依次編號①，②，④，⑤。

用紫外分光光度計在190～280 nm波長下測定上述溶液的吸收光譜及吸收峰波長。用精密pH試紙測定溶液pH。

2.2 溶液酸堿性對固定波長下吸光度的影響實驗

根據(jù)2.1實驗結(jié)果選擇合適的波長測定溶液①，②，③，④，⑤的吸光度，探究固定波長下不同酸堿性溶液的吸光度差異。

2.3 標準曲線的繪制

準確移取0.1000 mg/mL的苯甲酸標準儲備液 4.00，5.00，6.00，8.00，10.00，12.00 mL至100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度、搖勻，制成含苯甲酸濃度依次為4.00，5.00，6.00，8.00，10.00，12.00 μg/mL的苯甲酸標準溶液。根據(jù)2.1和2.2的實驗結(jié)果選擇合適波長，用紫外分光光度計以超純水為空白測吸光度并繪制標準曲線。

2.4 樣品前處理方法對比實驗

方法1：準確稱取10.00 g醬油樣品于100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻。準確吸取該樣品稀釋液10.00 mL于250 mL分液漏斗中，加入5 mL 6 mol/L HCl酸化，用無水乙醚萃取3次，每次20 mL，每次振蕩1 min，合并乙醚層于250 mL分液漏斗中，用飽和氯化鈉溶液洗滌2次，每次10 mL，將乙醚層置于40 ℃水浴鍋中揮發(fā)去除乙醚，用冷凝裝置回收乙醚。去除乙醚后用20 mL 5% NaHCO3溶液溶解，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，制成測試液①-0。吸取等量樣品稀釋液按相同前處理方法進行平行實驗，制得的測試液編號①-1和①-2。

方法2：準確稱取10.00 g醬油樣品于100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻。準確吸取該樣品稀釋液10.00 mL于250 mL分液漏斗中，加入5 mL 6 mol/L HCl酸化，用無水乙醚萃取3次，每次20 mL，每次振蕩1 min，合并乙醚層于250 mL分液漏斗中，加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液充分振蕩3次，每次10 mL。水層轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，制成測試液②-0。吸取等量樣品稀釋液按相同前處理方法進行平行實驗，制得的測試液編號②-1和②-2。

方法3：準確稱取10.00 g醬油樣品于100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻。準確吸取該樣品稀釋液10.00 mL于250 mL分液漏斗中，加入10 mL飽和氯化鈉溶液，加入5 mL 6 mol/L HCl酸化，用無水乙醚萃取3次，每次20 mL，每次振蕩1 min，合并乙醚層于250 mL分液漏斗中，加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液充分振蕩3次，每次10 mL。水層轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，制成測試液③-0。吸取等量樣品稀釋液按相同前處理方法進行平行實驗，制得的測試液編號③-1和③-2。

樣品經(jīng)3種前處理方法處理后分別用紫外分光光度計在選定的波長和檢測條件下進行測定，對結(jié)果進行分析和對比。

2.5 前處理優(yōu)選方案回收率的測定

準確稱取10.00 g醬油樣品于100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻。取10.00 mL該醬油樣品稀釋液3份，依次加入2.00，4.00，6.00 mL，0.1000 mg/mL的苯甲酸標準儲備液，用前處理優(yōu)化方案處理后用紫外分光光度計在選定的波長和檢測條件下測定并計算回收率。每種加標量進行2次平行實驗。

2.6 前處理優(yōu)選方案精密度實驗

采用前處理優(yōu)選方案進行5次平行實驗，計算分析結(jié)果的相對標準偏差RSD(%)。

3 實驗結(jié)果及分析

3.1 溶液酸堿性對吸收峰波長的影響

溶液①，②，③，④，⑤的酸性依次減弱，堿性依次增強。在190～280 nm波長下，測定溶液①，②，③，④，⑤的吸收光譜發(fā)現(xiàn)，溶液①，②，③，④吸收光譜圖形狀相似，只是吸收峰的位置發(fā)生變化。中性溶液③和pH為9.5的堿性溶液④都在192，224 nm下有吸收峰；中性溶液③在224 nm處有吸光度為0.5449的吸收峰，pH為3.4的酸性溶液②在附近的吸收峰位置為229 nm，吸光度為0.7062。酸性更強的溶液①在此處的吸收峰位置為230 nm，吸光度為0.7389。堿性較強的溶液⑤在222 nm出現(xiàn)吸收峰，比溶液③和④的吸收峰波長224 nm略小。溶液①，③，⑤光譜圖及吸收峰位置見圖1。吸收峰對應的波長及吸光度見表1。

圖1 溶液①③⑤光譜圖及吸收峰

編號吸收峰波長(nm)吸光度pH1230．00．73891．8195．62．81432273．40．06093．4229．80．7062193．02．32933270．20．03776．7224．20．5449192．42．41134263．40．03989．5224．20．5588192．22．48715263．80．044912．5222．00．5787203．63．0088

由表1可知，苯甲酸(鈉)溶液酸堿性會對吸收峰位置產(chǎn)生一定影響，在酸性條件下，由于主要以苯甲酸的形式存在，在0.2～0.8吸光度范圍內(nèi)的吸收峰波長為230 nm，中性及堿性溶液中主要以苯甲酸鈉形式存在，在0.2～0.8吸光度范圍內(nèi)的吸收峰波長為224 nm，強堿性溶液雖然吸收峰位置為222 nm，但通過光譜圖發(fā)現(xiàn)溶液⑤在224 nm和222 nm附近吸收曲線較為平坦，吸光度變化不大。由于溶液③和溶液④同在224 nm下有吸收峰且該吸收峰下的吸光度很接近，因此，在224 nm波長下測定時，應控制溶液為中性至堿性。

3.2 溶液酸堿性對固定波長下吸光度的影響分析

在224 nm波長下測定溶液①，②，③，④，⑤的吸光度，測定結(jié)果見表2。

表2 溶液在224 nm波長吸光度的差異

由表2可知，在224 nm波長下，酸性溶液①，②的吸光度和堿性溶液④，⑤的吸光度都比溶液③的吸光度高，同一波長下吸光度隨溶液酸性(或堿性)的增強呈增大趨勢，酸性溶液吸光度增加較為明顯，堿性溶液吸光度與中性溶液吸光度差別不大。因此，在進行苯甲酸含量測定時，從提高分析結(jié)果的精密度和準確度的角度考慮，應控制測試溶液和標準溶液酸堿性一致。

3.3 標準曲線的繪制

本實驗所用苯甲酸標準溶液由苯甲酸用氫氧化鈉溶液反應生成苯甲酸鈉并加超純水稀釋而成，沒有添加其他物質(zhì)，經(jīng)對試劑空白和超純水空白進行紫外吸光度檢測對比發(fā)現(xiàn)，用超純水做空白是可行的。

用紫外分光光度計在224 nm下，以超純水為空白對苯甲酸標準溶液的吸光度進行測定，測定結(jié)果見表3，標準曲線見圖2。在吸光度0.2762～0.8309范圍內(nèi)苯甲酸濃度和吸光度線性關系良好。

表3 吸光度測定結(jié)果

圖2 苯甲酸標準曲線

3.4 樣品前處理方法對比實驗

在224 nm波長下，對經(jīng)3種前處理方法分別制得的測試液調(diào)節(jié)pH到6.7～7.5范圍內(nèi)，并以試劑空白溶液為參比測定吸光度，平行實驗測定結(jié)果見表4。

表4 樣品前處理方法對比實驗結(jié)果(n=3)

由表4可知，采用3種前處理方法處理后的苯甲酸含量測定結(jié)果平均值相差在1%以內(nèi)。方法1通過40 ℃水浴使用乙醚揮發(fā)的方式分離乙醚和苯甲酸，耗時較長，且需要回收裝置。方法2利用氫氧化鈉與苯甲酸反應生成苯甲酸鈉且苯甲酸鈉易溶于水的性質(zhì)提取乙醚中的苯甲酸，方法較為簡單且快速。方法3比方法2增加了在乙醚萃取前添加飽和氯化鈉溶液的步驟，目的是降低苯甲酸鈉在水中的溶解度，提高乙醚萃取時的分層效果和萃取效果，實驗結(jié)果表明：方法3處理后的苯甲酸檢測結(jié)果與方法2處理后的苯甲酸檢測結(jié)果相比并沒有什么改變，但方法2比方法3更經(jīng)濟、簡便。從提高測定效率、節(jié)約試劑資源的角度考慮，將前處理方法2作為前處理的優(yōu)選方案并進行回收率和精密度實驗。

3.5前處理優(yōu)選方案回收率的測定

采用前處理優(yōu)選方案處理樣品并進行不同加標量的回收率測定：準確稱取10.00 g醬油樣品于100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，制成醬油樣品稀釋液。在3份10.00 mL醬油樣品稀釋液中分別加入2.00，4.00，6.00 mL，0.1000 mg/mL的苯甲酸標準儲備液，折算成每1 kg醬油樣品的理論加標量依次為0.200，0.400，0.600 g/kg。用前處理優(yōu)選方案進行處理后調(diào)pH至6.7～7.5，并在224 nm波長下進行測定，每個加標量做2次平行實驗?；厥章视嬎憬Y(jié)果見表5。

表5 回收率測定結(jié)果

由表5可知，回收率在96.5%～102%之間，具有良好的準確度。

3.6 前處理優(yōu)選方案精密度實驗

用前處理優(yōu)選方案處理樣品并進行精密度實驗：準確稱取10.00 g醬油樣品于100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，制成醬油樣品稀釋液。準確移取5份稀釋液(每份10.00 mL)按照前處理優(yōu)選方案進行樣品前處理，在相同條件下測定所制得的5份測試液的吸光度，計算苯甲酸含量和相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表6。

表6 精密度實驗結(jié)果及RSD(n=5)

由表6可知，RSD為0.66%，在線性范圍內(nèi)有較好的精密度。

4 結(jié)論

對于苯甲酸含量的測定，溶液酸堿性不同會影響吸收峰波長。酸性環(huán)境中由于主要以苯甲酸的形式存在，吸收峰波長為230 nm，中性和堿性溶液中主要以苯甲酸鈉形式存在，pH為6.7和9.5的溶液吸收峰波長都為224 nm，pH為12.5的強堿性溶液吸收峰波長為222 nm。在224 nm波長下測定時，應控制溶液為中性或堿性。

224 nm波長下酸性溶液吸光度較堿性和中性溶液吸光度高，固定波長下吸光度隨溶液酸性或堿性增強而增大?？刂茰y試溶液和標準溶液酸堿性相近有利于提高分析結(jié)果的精密度和準確度。

所選用的3種樣品前處理方法都能對樣品進行有效處理，測定結(jié)果平均值相差在1%以內(nèi)。鹽酸酸化-乙醚萃取-堿液提取的樣品前處理方法更快速、經(jīng)濟和簡便。

采用鹽酸酸化-乙醚萃取-堿液提取的前處理優(yōu)選方案進行回收率和精密度實驗，得出的回收率在96.5%～102%之間，RSD為0.66%，方法具有良好的準確度和精密度。

[1]GB 2760-2014，食品添加劑使用標準[S].

[2]王金貴，鄭霞.紫外分光光度法測定苯甲酸含量影響因素的探究[J].青海師范大學學報(自然科學報)，2016(1)：21-28.

[3]汪曉璇，汪念秋，劉曉曦.紫外光度法同時測定醬油中苯甲酸和山梨酸含量[J].中國調(diào)味品，2015,40(8)：108-110.

[4]吳勤民.熒光光譜法和紫外分光光度法在發(fā)酵調(diào)味品中苯甲酸含量測定中的應用和比較[J].中國調(diào)味品，2010,35(1)：78-84.

[5]于曉萍.紫外分光光度法快速測定蜜餞中苯甲酸的含量[J].化學工業(yè)與工程技術，2009(6)：42-44.

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2018年《中國調(diào)味品》

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TheExperimentalOptimizationStudyonUltravioletSpectrophotometryDeterminationofBenzoicAcidinSoySauce

CUI Jin-juan, XIE Man-yuan, ZHAO Li-bing

(City Construction Technician College of Guangdong Province, Guangzhou 510520, China)

Benzoic acid is a commonly used additive in soy sauce.National standards have strict limits on its usage.For ultraviolet spectrophotometry determination of benzoic acid in soy sauce,the study on experimental influence factors and the optimization on pretreatment methods has a lot of research space.The ultraviolet absorption spectra and the absorption peak wavelength of benzoic acid in different acid-alkaline conditions are determined.Absorbance at fixed wavelength is also determined.The comparison and analysis of the test results are carried out with different pretreatment methods.The optimum acid-alkaline conditions at 224 nm proposed from the purpose of improving accuracy and precision.In order to simplify the method,save resources and improve efficiency, put forward the sample pretreatment plan.The recovery test and precision experiment are carried out.

ultraviolet spectrophotometry；soy sauce；benzoic acid

TS264.21

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.024

1000-9973(2017)11-0110-05

為了保持醬油的鮮度和良好的品質(zhì)、延長保存期，常在醬油中添加苯甲酸鈉、山梨酸鉀等食品防腐劑。苯甲酸對酵母菌、霉菌、部分細菌作用效果很好，在最大允許使用范圍內(nèi)，在pH值4.5以下，對各種菌都有抑制作用。苯甲酸鈉對微生物的作用與苯甲酸相同，是很常用的食品防腐劑，在世界各國被廣泛使用。然而近年來對其毒性的顧慮使得它的應用受限。《食品添加劑使用標準》規(guī)定了苯甲酸及其鈉鹽在醬油中的最大允許使用量為1.0 g/kg(以苯甲酸計)[1]。

2017-05-16

崔金娟(1983-)，女，山東日照人，碩士，主要從事產(chǎn)品質(zhì)量檢驗相關專業(yè)教學。