黃 瓊，向 陽(yáng)

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院,湖北 恩施 445000)

【實(shí)驗(yàn)研究】

獨(dú)正桿接骨膏外用對(duì)家兔骨折愈合過程中BMPR-1A、BMPR-1BmRNA表達(dá)的影響?

黃 瓊，向 陽(yáng)

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院,湖北 恩施 445000)

目的：探討?yīng)氄龡U接骨膏外用對(duì)家兔骨折愈合過程中BMPR-1A、BMPR-1B mRNA表達(dá)的影響，分析其促進(jìn)骨折愈合的作用機(jī)理。方法：建立30只家兔橈骨骨折模型按隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各15只。實(shí)驗(yàn)組在其患處外敷獨(dú)正桿接骨膏并用小夾板固定，對(duì)照組不使用藥物僅常規(guī)消毒后進(jìn)行小夾板固定。分別于治療后第3、6、10周每組隨機(jī)抽取5只行X線觀察骨折愈合情況。處死家兔取患處組織標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定家兔骨組織中BMPR-1A、BMPR-1B mRNA的含量，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組家兔第3、10周患處骨組織標(biāo)本中BMPR-1A、BMPR-1B mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：獨(dú)正桿接骨膏外用可在骨折愈合早期促進(jìn)骨組織中BMPR-1A、BMPR-1B mRNA的表達(dá)，同時(shí)可以維持晚期的表達(dá)量，延緩衰減趨勢(shì)，促進(jìn)骨折愈合。

獨(dú)正桿接骨膏；骨折；愈合；家兔

獨(dú)正桿接骨膏(鄂藥制字Z20110140)是湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院治療四肢骨折、跌打損傷、筋骨疼痛等多種骨傷疾病的自制膏劑，具有活血化瘀、接骨療傷、通絡(luò)止痛等功效。臨床應(yīng)用40多年來，其療效確切、副作用小、廉價(jià)方便，治愈大量骨折及筋傷患者，在恩施州及周邊地區(qū)具有較高的社會(huì)知名度。早在 1978 年該藥就獲得了全國(guó)衛(wèi)生醫(yī)藥科技成果獎(jiǎng)，此后部分學(xué)者對(duì)其部分藥效機(jī)制、制劑工藝等方面進(jìn)行了一些探索[1]。本研究旨在前人研究的基礎(chǔ)上，探討?yīng)氄龡U接骨膏外用對(duì)家兔骨折愈合過程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1 A(BMPR-1 A)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B(BMPR-1B) mRNA表達(dá)的影響，分析其促進(jìn)骨折愈合的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通成年日本大耳白兔30只，5～8月齡，平均體質(zhì)量(2.0±0.5) kg/只，雌雄各半，購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心(許可證號(hào)SCXK(鄂)2008-0005)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

獨(dú)正桿接骨膏由湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院制劑室生產(chǎn)(鄂藥制字Z20110140，生產(chǎn)批號(hào)20100406)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑

TRIZOL試劑(Invitrogen公司，批號(hào)15596-018)，cDNA第一鏈合成試劑盒(Fermentas公司，批號(hào)#K1622)；SYBR Green/Flouresceinq PCR Master Mix(2X)(Fermentas公司，批號(hào)#K0242)；Ex TaqTM(TAKARA公司，批號(hào)DRR100 A)；DL2000 DNA Marker(TAKARA公司，批號(hào)D502 A)；引物合成(南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司)。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司，型號(hào)Viia7)，分光光度計(jì)(上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)752)，電熱恒溫水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表有限公司，型號(hào)HW-SY11-K P2)，水平電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號(hào)JY300)，紫外分析儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號(hào)JY02S)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)DHG 9203 A)，PH計(jì)(德國(guó)Metter-Toledo GmbH公司，型號(hào)LP115)，PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，型號(hào)EDC-810)。

1.5 方法

1.5.1 模型建立及分組 動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，術(shù)前禁食8 h。固定于兔架，腹腔注射麻醉，無菌條件下在橈骨前內(nèi)側(cè)中下1/3交界處縱行依次切開皮膚、淺筋膜、深筋膜約3 cm，鈍性分離肌肉充分暴露橈骨，用不銹鋼鋸造成左側(cè)橈骨中段3 mm的橫行骨缺損。生理鹽水沖洗傷口，皮膚消毒后逐層縫合，無菌紗布包扎，自由飲食、一般飼料、分籠飼養(yǎng)，術(shù)后3 d每天給予青霉素鈉40萬(wàn)單位預(yù)防感染，肌肉注射每天1次[2-4]。按隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功后的30只家兔分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各15只。

1.5.2 干預(yù)方法 實(shí)驗(yàn)組家兔每只按照5 g/kg的標(biāo)準(zhǔn)[5]將獨(dú)正桿接骨膏均勻地涂抹在無菌紗布?jí)K上，并將紗布?jí)K覆蓋切口上下5 cm左右的范圍，采用夾板外固定，每2 d換藥1次；對(duì)照組僅用碘伏常規(guī)消毒后普通無菌紗布?jí)K包扎，夾板固定。

1.5.3 標(biāo)本取材及處理 分別于給藥后第3、6、10周，每批每組隨機(jī)抽取5只，行X線攝片觀察骨折愈合情況后處死動(dòng)物，無菌條件下以患處為中心，兩端各取長(zhǎng)約1 cm骨組織為標(biāo)本，液氮保存。

1.5.4 PCR法檢測(cè)BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA表達(dá)水平 取液氮中保存的新鮮冰凍骨組織，質(zhì)量約為100 mg研成粉末，采用Invitrogen公司TRIZOL試劑，按照說明書提取動(dòng)物組織中總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。表1顯示，參照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA?；騾⒖夹蛄行畔⒂肞rimer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，以兔β-actin 作為內(nèi)參。反應(yīng)體系：依次加入上游引物(10 μmmol/L)×0.5 μL，下游引物(10 μmol)×0.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸(2.5 mmol/L)×μL 2，Ex Taq×0.25 μL，10×Ex Taq E buffer×2.5 μL，cDNA×1μL，加雙蒸水至25，反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s；30 cycles，72 ℃ 4 min，4 ℃ 4 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA有無降解，取2 μLRNA溶液加1 μL上樣，緩沖液混勻，樣品加入樣品孔，接通電源80 V電壓電泳30 min，紫外燈下觀察結(jié)果并照相掃描，將結(jié)果存入電腦進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Real time Q-PCR檢測(cè)：cDNA做10倍稀釋。反應(yīng)體系：cDNA(10×稀釋)×4，上游引物(100 μmol/L)×0.4，下游引物(100 μmol/L)×0.4，H2O×5.2，SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2X)× 10，反應(yīng)條件： 50℃2 min 1個(gè)循環(huán)，95℃10 min，隨后40個(gè)循環(huán)，95℃30 s，60℃30 s。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔct法進(jìn)行計(jì)算。

表1 BMPR-1 A/BMPR-1B及Rabbit β-actin引物序列表

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況及X線片觀察結(jié)果

術(shù)后第1天各組實(shí)驗(yàn)家兔能在籠中自如活動(dòng)，正常進(jìn)食及飲水。術(shù)后1周實(shí)驗(yàn)組家兔傷口紅腫情況逐漸消退、無滲液；對(duì)照組組織紅腫未見明顯改善，無滲液，呈一期愈合，提示獨(dú)正桿接骨膏外用在骨折愈合過程中具有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的作用。

圖1顯示，術(shù)后3周2組家兔骨折患處均可見到的骨缺損，實(shí)驗(yàn)組可見云霧狀陰影；術(shù)后6周2組均可見到骨痂形成，實(shí)驗(yàn)組骨缺損被骨痂填滿且周圍有大量外骨痂形成，對(duì)照組骨缺損處可見低密度骨痂填充，無外骨痂；第10周實(shí)驗(yàn)組骨缺損消失、骨皮質(zhì)重建、骨干外形已恢復(fù)、骨髓腔已通，對(duì)照組骨缺損模糊，有少量外骨痂，髓腔未通。

圖1 2組家兔左側(cè)橈骨骨折處X線影像注：第一行依次為對(duì)照組3、6、10周，第二行依次為實(shí)驗(yàn)組3、6、10周

2.2 BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

表2圖2、3顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組第3、10周家兔骨組織標(biāo)本中BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA的表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第6周家兔骨組織標(biāo)本中BMPR-1 A、BMPR-1BmRNA的表達(dá)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。

表2 2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各時(shí)間點(diǎn)BMPR-1AmRNA、BMPR-1BmRNA表達(dá)量

注：與對(duì)照組比較:*P<0.05

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)家兔骨折患處骨組織中BMPR-1AmRNA RT-PCR電泳結(jié)果注：泳道1：DL2000;泳道2-4：對(duì)照組3、6、10周；泳道5-7：實(shí)驗(yàn)組3、6、10周

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)家兔骨折患處骨組織中BMPR-1BmRNA RT-PCR電泳結(jié)果注：泳道1-3：對(duì)照組3、6、10周；泳道4-6：實(shí)驗(yàn)組3、6、10周;泳道7：DL2000

3 討論

骨折愈合是骨折斷端間的組織修復(fù)反應(yīng)，是成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及其他多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的復(fù)雜過程。研究認(rèn)為，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)為骨折愈合的啟動(dòng)因子，被公認(rèn)為是目前最強(qiáng)的骨誘導(dǎo)分化因子。BMPs并不直接作用于靶基因，而是通過BMPs受體、信號(hào)途徑和靶細(xì)胞基因組成的一個(gè)較為完整的信號(hào)系統(tǒng)，并發(fā)揮成骨誘導(dǎo)作用[6]。BMPs誘導(dǎo)成骨的機(jī)理主要是先與骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體(BMPR)結(jié)合，BMPR分為I型、Ⅱ型受體，主要介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)BMP信號(hào)的傳導(dǎo)。其過程為BMP首先與II型受體和I型受體結(jié)合，I型受體磷酸化細(xì)胞內(nèi)Smad蛋白，在細(xì)胞內(nèi)Smad1、5、8能被I型受體激活后形成異聚體，與共同介質(zhì)型Smad蛋白(Co-Smads)形成復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核并與轉(zhuǎn)錄活化物或阻遏物形成復(fù)合物，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)BMP信號(hào)由細(xì)胞外經(jīng)細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)靶基因的傳遞過程，然后再通過下游核心結(jié)合因子α1(Cbfα1)、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix、遠(yuǎn)端缺失基因5(Dlx5)、同源域基因c8(Hoxc8)和肌肉片段同源盒2(Msx2)等正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與相應(yīng)的OB特異蛋白ALP、骨鈣素(OC)、骨橋蛋白(OPN)和骨涎蛋白(BSP)等基因啟動(dòng)子連接，促進(jìn)細(xì)胞向成骨方向分化，其中I型受體包括BMPR1A、BMPR1B，決定了信號(hào)傳遞的特異性[7]。BMPR 是 BMP 信號(hào)通路的重要環(huán)節(jié)，當(dāng)BMP受體表達(dá)受到抑制時(shí)就會(huì)在一定程度上阻斷BMP的信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)分化[8]。有研究表明，在胚胎早期軟骨雛形形成過程中 BMPR-1B 表達(dá)增加，隨后在軟骨膜內(nèi)成骨時(shí)其表達(dá)迅速下降，而此時(shí)BMPR-1 A表達(dá)增加，提示BMPR-1B在軟骨雛形形成過程中發(fā)揮重要作用，BMPR-1 A則主要參與骨的進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育[9-10]。

獨(dú)正桿接骨膏由獨(dú)正桿、刺五加、刺老苞3味土家族藥物調(diào)和蜂蜜配制而成，主治跌打損傷、筋骨疼痛、閉合性骨折等多種病癥[1]。方中獨(dú)正桿性涼、味辛甘，具有活血散瘀、消腫止痛之功。刺五加[11]性溫、味辛，功能祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨；刺老苞[12]性平、味苦，有小毒，功能祛風(fēng)除濕、散瘀消腫、止血止痛，三藥合用共奏接骨療傷、活血化瘀、通絡(luò)止痛之功[13]。作為一個(gè)優(yōu)秀的民族醫(yī)藥制劑，獨(dú)正桿接骨膏臨床用于治療腳踝部閉合性骨折療效顯著，同時(shí)對(duì)于急性軟組織損傷、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、膝骨關(guān)節(jié)炎等疾病具有良好的治療效果[1]。前期研究結(jié)果表明，獨(dú)正桿接骨膏外敷給藥可對(duì)多項(xiàng)骨折愈合相關(guān)因子產(chǎn)生影響，如促進(jìn)BMP-2、BMP-7、BMP-9、Smad1/5基因的表達(dá)，抑制Smad-6基因的表達(dá)[14-17]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組家兔第3周骨組織中BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA表達(dá)量明顯高于同期對(duì)照組的表達(dá)量，提示在骨折愈合早期過程中接骨膏可促進(jìn)該受體的表達(dá)，加速介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)BMP信號(hào)的傳導(dǎo)過程，促進(jìn)骨折愈合；而實(shí)驗(yàn)組第6周的表達(dá)水平與對(duì)照組相當(dāng)，提示在骨折愈合中期獨(dú)正桿接骨膏可能通過其他信號(hào)途徑加速骨折的愈合，有待進(jìn)一步研究；實(shí)驗(yàn)組第10周的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組同期水平，提示接骨膏在骨折晚期運(yùn)用可維持BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA的表達(dá)量，延緩衰減趨勢(shì)，促進(jìn)骨折的全面愈合。據(jù)此可以推測(cè)，獨(dú)正桿接骨膏促進(jìn)BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA在患處骨組織中的表達(dá)可能是其良好療效的作用機(jī)制之一。

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EffectofExternalApplicationofDuzhengJieguPasteontheExpressionofBMPR-1AandBMPR-1BmRNADuringFractureHealinginRabbits

HUANG Qiong1,XIANG Yang

(MedicalCollegeofHubeiInstituteforNationalities,Hubei,Enshi445000,China)

Objective: To investigate the effect of expression of BMPR-1B mRNA and BMPR-1A in the healing process of Duzheng Jiegu Paste on rabbit fracture, and to analyze the mechanism of promoting fracture healing. Methods: 30 rabbits were randomly divided into experimental group and control group, with 15 rabbits in each group. The experimental group in the affected area with Duzheng Jiegu Paste and small splint fixation, The control group without of drugs, only after routine disinfection of small splint fixation. On 3rd and 6, 10 weeks after the treatment, respectively, each group of 5 randomly selected, x-ray observation of fracture healing. Death affected area from the tumor specimens of rabbits, rabbit bone tissue was determined by real-time fluorescent quantitative PCR method in the BMPR-1A and BMPR-1B mRNA content, statistical analysis of the data. Results: Real time fluorescent quantitative PCR showed that the expression of rabbits of BMPR-1A and BMPR-1B mRNA were higher than those in the control group in the experimental group third and tenth weeks, the affected area of bone tissue specimens, the difference was statistically significant. Conclusion: Duzheng Jiegu Paste can also promote fracture healing in the early expression of BMPR-1A and BMPR-1BmRNA in bone tissue, it can maintain the expression of late, slow attenuation trend, promote fracture healing.

Duzhenggan Jiegu Paste; Fracture; Heal; Rabbits

R285.5

B

1006-3250(2017)10-1391-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360570)-土家族藥接骨膏對(duì)骨折愈合過程中BMP/VEGF表達(dá)調(diào)控的機(jī)理研究

黃 瓊(1975-)，女(土家族)，湖北恩施人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)基礎(chǔ)理論與土家族驗(yàn)方開發(fā)應(yīng)用研究。

2017-04-06