魏 冰，王志中，任鵬飛，張成娟，馬 杰(鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院分子病理科，河南 鄭州 450008)

首診非小細胞肺癌患者癌胚抗原與表皮生長因子受體突變狀態(tài)相關(guān)性分析

魏 冰，王志中，任鵬飛，張成娟，馬 杰
(鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院分子病理科，河南 鄭州 450008)

目的分析首診初治非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體(EGFR)突變狀態(tài)與血清癌胚抗原(CEA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、細胞角蛋白19可溶性片段21-1(CYFRA 21-1)水平的相關(guān)性,尋找可能作為預測EGFR突變?nèi)巳旱淖詈唵瘟畠r的血清學指標。方法應用血清化學發(fā)光法動態(tài)監(jiān)測患者外周血CEA、NSE、CYFRA21-1水平，應用擴增阻礙突變系統(tǒng)方法檢測同一患者組織EGFR突變狀態(tài)，并對EGFR突變狀態(tài)及患者腫瘤標志物水平進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果關(guān)聯(lián)性分析顯示，EGFR突變與性別、吸煙、病理類型、CEA水平、CYFRA21-1水平有關(guān)(P<0.05)。非條件Logistic回歸分析結(jié)果顯示，性別和CEA與EGFR突變相關(guān)(P<0.05)。CEA升高患者較CEA正常患者EGFR突變的可能性更大，并且EGFR突變率隨著CEA的升高而增加(P<0.05)。CEA檢測對EGFR突變預測的AUC>0.7。結(jié)論在其他因素不變的情況下，EGFR突變優(yōu)勢人群篩選為亞裔、女性、非吸煙、肺腺癌且初始血清CEA水平較高患者，CEA檢測對EGFR突變預測的診斷價值中等。

非小細胞肺癌；表皮生長因子受體；癌胚抗原；神經(jīng)元特異性烯醇化酶；細胞角蛋白19可溶性片段21-1

肺癌惡性程度高，在世界范圍內(nèi)是腫瘤致死的首要原因[1]，非小細胞肺癌約占肺癌的85%[2]，非小細胞肺癌發(fā)現(xiàn)晚，預后差，在接受治療的患者中5 a生存率只有15%左右，其中肺腺癌約有60%屬非吸煙病例，是由EGFR基因突變引起，近年來引入的基因檢測，按基因特性將肺癌分類成不同亞型，對個體化的靶向治療提供了科學化的指導[3]。

血清腫瘤標志物癌胚抗原(commodity exchange authority，CEA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、細胞角蛋白19可溶性片段21-1(cytokeratins21-1，CYFRA21-1)三聯(lián)法檢測已經(jīng)作為臨床常規(guī)檢測項目，通過腫瘤標志物水平結(jié)合其他檢查達到對肺癌患者初篩及輔助診斷的目的。然而對腫瘤標志物與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變狀態(tài)的研究還為數(shù)不多。而與EGFR突變狀態(tài)對應的靶向治療藥物已經(jīng)成為肺癌患者一線治療的新選擇。目前臨床主要應用患者氣管鏡活檢組織標本進行EGFR突變檢測，費用高，周期長，往往受限于標本取材不夠，或標本前期處理不當造成假陰性結(jié)果。對于EGFR突變優(yōu)勢人群的篩選定義為亞裔、女性、非吸煙的肺腺癌患者，此結(jié)果已經(jīng)得到多個大型臨床試驗的證實。如若篩選出一種或幾種較敏感和特異的血清腫瘤標志物，同時參考上述幾種因素，可以更快速準確預測患者的腫瘤突變狀態(tài)，無疑為臨床患者的后續(xù)治療提供更大的幫助。為了更清楚CEA、NSE、CYFRA21-1與EGFR突變狀態(tài)在首診早期非小細胞肺癌患者中的分布狀態(tài)，病理特征及特性，本文對368例非小細胞肺癌患者進行了回顧性研究，以明確血清腫瘤標志物水平與EGFR突變的關(guān)系。也試圖尋找腫瘤標志物檢測可以作為一種快捷、廉價、無創(chuàng)的指標反映肺癌患者突變狀態(tài)的證據(jù)。

1 資料與方法

1.1入組患者的血液和組織收集入組標準定義為：適合入組患者為亞裔，首診初治，>18周歲，組織學確診為非小細胞肺癌?；颊叩呐R床信息包括性別、年齡、吸煙狀態(tài)、腫瘤EGFR突變狀態(tài)等。每例患者入院采集EDTA抗凝血，分離血清檢測腫瘤標志物。獲得手術(shù)或活檢的腫瘤組織學樣本檢測EGFR，腫瘤組織檢測出EGFR耐藥突變(如20外顯子T790M和20外顯子的插入突變，單獨或和敏感突變結(jié)合的情況)被排除入組。

1.2血液樣本的腫瘤標志物檢測所有樣本分離血清，使用化學發(fā)光法檢測CEA(正常參考值0～3.5 ng·mL-1)，CYFRA21-1(正常參考值0～3.3 ng·mL-1)，NSE(正常參考值0～15 ng·mL-1)。

1.3腫瘤組織的EGFR檢測所有樣本使用TIANamp FFPE DNA Kit提取DNA，DNA濃度范圍在 20～50 ng·μL-1，OD260/OD280范圍在1.8～2.0之間。EGFR突變運用擴增受阻突變檢測系統(tǒng)(ARMS)，檢測試劑使用ACCB Human EGFR Gene Mutations Detection Kit,該試劑檢測范圍為EGFR基因18、19、21、20號外顯子45種已知突變。EGFR基因18、19、21及20外顯子中S768I突變與酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKI)療效有重要關(guān)系，檢測靈感性為1%(5 ng·μL-1DNA)。儀器使用Agilgent Mx3000P。

1.4數(shù)據(jù)收集臨床信息收集方法：設計調(diào)查問卷后，由經(jīng)過統(tǒng)一培訓后的調(diào)查員從病歷中提取信息，使用Epidata 3.0錄入信息，信息錄入采用雙錄入方式完成。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)處理，分類資料組間比較用χ2檢驗、校正χ2檢驗、Fisher確切概率法；分類資料的相關(guān)分析使用秩相關(guān)分析，篩選與EGFR突變相關(guān)變量的多因素分析時使用二分類非條件Logistic回歸分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1EGFR突變與病理特征及常用腫瘤標志物的關(guān)聯(lián)性分析EGFR突變狀態(tài)與性別(P<0.001)、吸煙史(P<0.001)、病理類型(P<0.001)、CEA(P=0.038)和CYFRA211(P=0.044)有相關(guān)性。而家族史、病理分期、轉(zhuǎn)移情況和NSE與EGFR狀態(tài)無關(guān)(P>0.05)。見表1。

2.2EGFR突變亞型與血清標志物CEA、NSE、CYFRA211的關(guān)聯(lián)性在EGFR野生型及EGFR18、19、21外顯子3種突變亞型分析中，對于EGFR19外顯子的缺失突變(19M)，CEA陽性與陰性比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.004)，對于EGFR21外顯子突變(21M)，CYFRA211陽性與陰性比較差異有統(tǒng)計學意(P=0.007)。見表2。

表1 EGFR突變與病理特征及常用腫瘤標志物關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果

2.3EGFR19外顯子亞型、21外顯子亞型狀態(tài)與CEA和CYFRA211的關(guān)聯(lián)性在EGFR19、21外顯子4種突變亞型分析中，顯示CEA陽性與陰性和EGFR19外顯子的2種亞型19M1、19M2缺失突變相關(guān)(P=0.070、0.010)，CYFRA211陽性與陰性和EGFR21外顯子2種突變亞型21M1、21M2相關(guān)(P=0.030、0.040)。見表3。

表2 EGFR突變亞型與腫瘤標志物的關(guān)聯(lián)性分析

2.4非條件Logistic回歸分析EGFR突變與性別、CEA、NSE、CYFRA211腫瘤標志物等變量的關(guān)聯(lián)性研究對象中同時檢測EGFR突變、CEA、NSE和CYFRA211等4種指標，并有年齡和性別等信息者共有368例。以EGFR是否發(fā)生突變?yōu)橐蜃兞?，以CEA、NSE、CYFRA211、年齡和性別為自變量，從中篩選與EGFR發(fā)生有關(guān)聯(lián)的因素，構(gòu)建回歸模型時采用逐步回歸中的向后法。結(jié)果顯示，性別和CEA與 EGFR突變相關(guān)，而年齡和CYFRA211被剔除出回歸方程，說明與EGFR突變無關(guān)。見表4。

表4 Logistic回歸分析結(jié)果

注：性別分為男、女，CEA分為陽性、陰性

2.5比較不同范圍等級CEA檢出值與EGFR突變的關(guān)系將EGFR野生組及突變組的CEA按照第25、50、75百分位數(shù)分為4段。采用4段分析法可以看出，CEA>9.9區(qū)間，EGFR突變頻率明顯升高(P<0.05)，且隨著CEA水平的升高，EGFR突變率增加。見表5。

表5 CEA濃度不同范圍EGFR突變發(fā)生率比較

2.6ROC曲線法確定腫瘤標志物CEA對患者EGFR突變的預測價值以非小細胞肺癌患者是否存在EGFR突變?yōu)橐蜃兞?，以CEA作為自變量，探索CEA對EGFR突變及各突變亞型的預測價值，嘗試確定能夠預測突變的截斷值。一般認為AUC >0.5～0.7診斷價值較低，>0.7～0.9診斷價值中等，>0.9診斷價值較高。以上數(shù)據(jù)分析顯示，本研究中CEA檢測對EGFR突變預測的AUC>0.7，可認為診斷價值中等。見圖1～3、表6。

3 討論

CEA、CYFRA21-1、NSE是最早用于肺癌篩選及輔助診斷的重要腫瘤標志物，在臨床已經(jīng)作為常規(guī)檢測項目開展，血清學水平的增高與腫瘤的生長、復發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)[4-5]。CEA與EGFR突變有關(guān)，同時在一定區(qū)間內(nèi)表現(xiàn)為正相關(guān)[6]。

圖1 CEA檢測結(jié)果預測EGFR基因突變的ROC分析

圖2 CEA檢測結(jié)果預測EGFR基因19M1和19M2突變的ROC分析

圖3 CEA檢測結(jié)果預測EGFR基因21M1和21M2突變的ROC分析

表6 ROC曲線分析CEA對EGFR突變的預測價值

EGFR及其家族成員通過調(diào)節(jié)細胞增生、凋亡及腫瘤血管生成發(fā)揮重要的致瘤作用。盡管EGFR突變是通過何種信號途徑致瘤的機制還不清楚，但明確的是EGFR突變能增強酪氨酸激酶活性，活化自身酪氨酸激酶，主要通過2個信號通路調(diào)節(jié)細胞增殖存活，PI3K/AKT/mTOR及RAS/RAF/MEK/MAPK信號通路[7]。這些信號途徑以活化依賴關(guān)鍵信號分子磷酸化而活化。非小細胞肺癌最主要的致瘤機制是活化突變，而調(diào)節(jié)EGFR表達的機制如表觀遺傳學及異常轉(zhuǎn)錄因子的研究尚未得出肯定結(jié)論。

CEA屬于免疫超家族成員，也是目前研究最多的非小細胞肺癌腫瘤標志物，是結(jié)構(gòu)復雜的酸性糖蛋白，為正常胚胎組織所產(chǎn)生的成分，出生后逐漸消失，或僅存極微量。消化道腫瘤、乳腺癌、肺癌等患者均可有CEA的升高[8]。在人類CEA家族有29個基因，其中18個有正常表達，編碼CEA相關(guān)的細胞粘連蛋白。CEA最初在人大腸癌中提取[9]，與細胞粘連相關(guān)的粘連蛋白，在胎兒胃腸道表達，出生后停止分泌，正常血清很低，某些腫瘤增高。CEA是一種糖基化磷脂酰肌醇，是L-選擇素和E-selection的配體，與復發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。文獻顯示：CEA與蛋白酪氨酸磷酸酶(protein-tyrosine-phosphatase nonreceptor type 1，PTPN1)和AnnexinA2有相關(guān)性，PTPN1參與多條信號通路，其中會有RAS/MAPK，PTPN1是一種蛋白質(zhì)酪氨酸激酶磷酸酯酶，在其和酪氨酸激酶的共同作用下調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸脂酶程度和生理作用，從而控制細胞的生長、分化和轉(zhuǎn)化過程，有報道認為肺癌的發(fā)生機制研究顯示，EGFR基因突變可導致酪氨酸激酶的自我活化，激活下游信號通路導致腫瘤細胞的生長、增殖，在激酶-底物-磷酸酯酶循環(huán)過程中，傳遞的信息是由該循環(huán)的速度來決定，推測無論磷酸酯酶的活性對調(diào)節(jié)由激酶活化導致的增生活性增強具有重要意義。CEA作為一種黏附分子，通過與PTPN1的相互作用，在肺癌的生長過程中可能具有重要的標志物作用，本文發(fā)現(xiàn)EGFR突變患者中CEA表現(xiàn)為在一定程度的增高，并且可能與EGFR的突變量有關(guān)。結(jié)果還顯示，CEA在一定范圍內(nèi)與EGFR突變具有良好的關(guān)系。CEA<9.9為預測不敏感區(qū)域，CEA>9.9為預測的敏感區(qū)域。作者認為，可能可以根據(jù)血中CEA表達量的變化推測EGFR突變量的變化，從而預測EGFR-TKI的作用，為臨床提供EGFR-TKI耐藥指標。

血清CEA診斷非小細胞肺癌特異性高但敏感性低，近年來關(guān)于血清CEA聯(lián)合CYFRA21-1及NSE檢測時可提高其敏感性。血清CEA與晚期非小細胞肺癌預后的關(guān)系，Barlési等[10]研究表明CEA、CYFRA21-1、NSE三者聯(lián)合是評估非小細胞肺癌患者預后的獨立因素，其中三者均正常的患者中位生存期為11個月，而三者均高者中位生存期只有3個月，其認為三者作為整體評估患者預后較單項CEA評估預后更有意義。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)單項CEA在非小細胞肺癌中的陽性率為39%，而CEA與血清CYFRA21-1及CA125三者聯(lián)合時陽性率提高到80.7%。

血清CEA治療前基礎水平與靶向治療藥物EGFR-TKI療效的關(guān)系目前尚有爭議。但多項研究對于治療前后CEA變化水平與療效的關(guān)系方面均得出相同結(jié)論。Xu等[11]比較了接受EGFR-TKI治療的非小細胞肺癌患者治療前后4周的CEA變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CEA下降>32%的患者中位生存期較下降<32%的患者長，從而得出可根據(jù)治療前后CEA變化水平來監(jiān)測EGFR-TKIs治療療效。Kappers等[12]也得出了治療后CEA下降是EGFR-TKI有效的一個指標。

從我們的研究得出EGFR突變?nèi)巳涸诟鶕?jù)條件為亞裔、女性、非吸煙、肺腺癌篩選時，其預測率約為50%，如果聯(lián)合CEA水平則預測率可達70%，而在突變亞型分析中，CEA與EGFR19外顯子的缺失相關(guān)(P=0.004)，CYFRA21-1與EGFR21外顯子的L858R相關(guān)P=0.007，如果在突變和野生組別分析，則CEA仍然與EGFR的突變狀態(tài)相關(guān)，由此得出，CEA水平可以作為預測EGFR突變狀態(tài)的一個潛在的血清學指標，如果聯(lián)合其他優(yōu)勢人群特征，則預測價值更大。

從生存分析數(shù)據(jù)顯示，以6個月為隨訪終點，評價患者疾病進展狀況，得出在治療前CEA水平高的患者，經(jīng)靶向治療或化療后，出現(xiàn)2種結(jié)局，治療后CEA依然維持高水平或持續(xù)升高的患者，其疾病進展率率較高；治療后CEA下降的患者，其疾病緩解率和穩(wěn)定率較高，此趨勢在治療前CEA水平低的患者經(jīng)治療后的疾病轉(zhuǎn)歸基本一致，由此可以得出，無論患者采用何種治療方案，通過動態(tài)監(jiān)測外周血CEA水平，可以大致預測非小細胞肺癌患者治療后的療效。

由此看來，CEA作為非小細胞肺癌的輔助診斷手段提高早期診斷率的同時，不僅可以在預測EGFR突變狀態(tài)時體現(xiàn)潛在價值，又可以作為一個療效預測因子在肺癌患者療效評價中具有重要意義。

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AnalysisofCommodityExchangeAuthorityandEpidermalGrowthFactorReceptorMutationsCorrelationinthePrimaryNon-smallCellLungCancer

WEI Bing， WANG Zhizhong， REN Pengfei, ZHANG Chengjuan, MA Jie
(DepartmentofMolecularPathology,theCancerHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Zhengzhou450008,China)

ObjectiveTo analyze the correlation of epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation status and serum commodity exchange authority(CEA), neuron-specific enolase(NSE), cytokeratins21-1(CYFRA21-1) level in the primary non-small cell lung cancer.MethodsChemiluminescence method was used for the dynamic monitoring of peripheral blood serum CEA, NSE, CYFRA21-1 levels in the patients with primary non-small cell lung cancer, amplification-refractory mutation system method was applied to detect the same tissue in patients with EGFR mutations, and levels of tumor markers in patients with EGFR mutations was analyzed.ResultsEGFR mutations in the correlation analysis was related with gender, smoking, pathological type, initial CEA level, CYFRA21-1 level(P<0.05).The results of non-conditional Logistic regression analysis showed that CEA and gender were related with EGFR mutation(P<0.05).The EGFR mutation incidence in the patients with CEA increase was higher than that patients with CEA normal.The AUC of CEA was >0.7 in the EGFR mutation prediction.ConclusionUnder the condition of the other factors unchanged, EGFR mutations advantage population screening for asians, women, no smoking, lung adenocarcinoma and patient with higher initial serum CEA level, CEA detection has the medium diagnostic value for EGFR mutations.

non-small cell lung cancer； epidermal growth factor receptor；commodity exchange authority；neuron-specific enolase；cytokeratins21-1

河南省醫(yī)學科技攻關(guān)計劃項目(編號：51010205)

魏冰(1974-)，女，碩士，副主任技師，主要從事腫瘤相關(guān)基因檢測及臨床應用研究工作。E-mail:weibing1999@hotmail.com

馬杰(1963-)，男，碩士，主任技師，碩士生導師，主要從事腫瘤分子病理診斷及研究工作。E-mail:majie@medmail.com.cn

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.05.006

R734.2;R730.4

A

1673-5412(2017)05-0385-06

2017-01-23)