吳晨奇++徐良++司文會(huì)

ε-聚賴氨酸（ε-PL）是一種由25-30個(gè)L-賴氨酸殘基通過α-羧基和ε-氨基連接而成的多肽。由于它具有抑菌譜廣、安全性能高、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，使它成為了目前最具潛力的生物防腐劑。ε-PL已在美國、日本和韓國等地被廣泛使用，而我國也已經(jīng)逐漸把ε-PL作為食品添加劑使用。此外，ε-PL還可用作基因載體、可降解性材料和高吸水材料等。因此，ε-PL具有廣闊的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)通過正交試驗(yàn)方法對(duì)ε-PL的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，提高了發(fā)酵產(chǎn)量，為今后的研究提供一些依據(jù)。

材料與方法

材料與儀器。白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）FQQ-5，本實(shí)驗(yàn)室誘變篩選保藏；甲基橙、酵母粉、葡萄糖、硫酸銨、MgSO4 ·7H2O、K2HPO4 、KH2PO4（分析純），購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨（化學(xué)純），購于阿拉丁試劑（上海）有限公司。

紫外-可見光分光光度計(jì)（UV-2450 ），日本島津企業(yè)管理（中國）有限公司；滅菌烘箱（UNE500），德國MEMMERT公司；超凈臺(tái)（SW-CJ-2FD），蘇州凈化設(shè)備有限公司；搖床（TS-2102），上海天呈科技有限公司；實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

實(shí)驗(yàn)方法。

（1）培養(yǎng)基配制

種子和發(fā)酵培養(yǎng)基為（g/L）：葡萄糖（50） 、酵母粉（5）、（NH4）2SO4（10）、MgSO4 ·7H2O（0.5）、K2HPO4（0.8）、KH2PO4（1.36）、FeSO4 ·7H2O（0.03）、ZnSO4·7H2O（0.04），pH 6.8，121 ℃滅菌 20 min。

（2）培養(yǎng)方法

①種子培養(yǎng)

250 mL錐形瓶中裝50 mL種子培養(yǎng)基，接入一環(huán)孢子，200 r/mim，30 ℃培養(yǎng)24 h。

②搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

250 mL錐形瓶中裝50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按10%接種量接入種子液，200 r/mim，30 ℃培養(yǎng)72 h。

（3）指標(biāo)的測定

ε-PL產(chǎn)量測定方法參照Itzhaki F R方法。

（4）發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

①發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)選擇了葡萄糖、酵母粉和硫酸銨這三種對(duì)發(fā)酵影響較大的成分，分別考察不同濃度對(duì)FQQ-5發(fā)酵產(chǎn)ε-PL的影響。其中，選擇最佳的葡萄糖濃度時(shí)，葡萄糖濃度（g/L）設(shè)為20、30、40、50、60，其他同發(fā)酵培養(yǎng)基；選擇最佳的酵母粉濃度時(shí)，酵母粉濃度（g/L）設(shè)為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5，其他同發(fā)酵培養(yǎng)基；選擇最佳的硫酸銨濃度時(shí)，硫酸銨濃度（g/L）設(shè)為4、6、8、10、12，其他同發(fā)酵培養(yǎng)基。

②發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選用葡萄糖、酵母粉及硫酸銨為考察因素，采用正交試驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，其正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表1。

（5）數(shù)據(jù)處理方法 所有實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行，Excel進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差分析。

結(jié)果與分析

葡萄糖濃度對(duì)ε-PL產(chǎn)量的影響。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)葡萄糖濃度低于40 g/L時(shí)，ε-PL產(chǎn)量不斷增加，并達(dá)到最大的1.503 g/L，繼續(xù)加大葡萄糖的濃度，ε-PL產(chǎn)量反而降低，這可能是由于過多的葡萄糖容易在發(fā)酵過程中引起“葡萄糖效應(yīng)”，從而影響菌體生長和代謝產(chǎn)物的形成。所以本實(shí)驗(yàn)選擇最佳的葡萄糖濃度為40 g/L。

酵母粉濃度對(duì)ε-PL產(chǎn)量的影響。實(shí)驗(yàn)表明，隨酵母粉濃度的增加，ε-PL產(chǎn)量也隨之增加； 當(dāng)酵母粉濃度達(dá)到7.5 g/L時(shí)，ε-PL產(chǎn)量達(dá)到最大的1.552 g/L； 而繼續(xù)加大酵母粉濃度時(shí)，ε-PL產(chǎn)量開始下降，這可能是由于酵母粉成分復(fù)雜，后期底物消耗不完，會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生一些酶降解白色鏈霉菌菌絲體，故在本實(shí)驗(yàn)的考察范圍內(nèi)酵母粉的最佳濃度為7.5 g/L。

硫酸銨濃度對(duì)ε-PL產(chǎn)量的影響。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)硫酸銨濃度為6 g/L時(shí)，ε-PL產(chǎn)量達(dá)到最大的1.514 g/L，當(dāng)繼續(xù)加大硫酸銨濃度時(shí)，ε-PL產(chǎn)量開始降低，這說明太多的硫酸銨并不利于ε-PL的形成，因此，確定硫酸銨的最佳濃度為6 g/L。

正交實(shí)驗(yàn)確定各培養(yǎng)基成分用量。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，采用正交試驗(yàn)對(duì)葡萄糖、酵母粉、硫酸銨進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

由表1可知，對(duì)ε-PL產(chǎn)量的影響排序?yàn)椋浩咸烟?酵母粉>硫酸銨。最后選擇的最優(yōu)組合為：葡萄糖35g/L、酵母粉7.5g/L、硫酸銨6g/L，在此條件下，F(xiàn)QQ-5的ε-PL產(chǎn)量達(dá)1.853 g/L，比優(yōu)化前的產(chǎn)量提高了19.4%。

通過本實(shí)驗(yàn)，對(duì)ε-PL的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分為（g/L）：葡萄糖（35）、酵母粉（7.5）、（NH4）2SO4（6）、MgSO4 ·7H2O（0.5）、K2HPO4（0.8）、KH2PO4 （1.36）、FeSO4·7H2O（0.03）、ZnSO4·7H2O （0.04），在此條件下，F(xiàn)QQ-5的ε-PL產(chǎn)量達(dá)1.853 g/L，比優(yōu)化前的產(chǎn)量提高了19.4%。今后將在5 L發(fā)酵罐上采用此優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵工藝的研究，以期進(jìn)一步提高發(fā)酵產(chǎn)量，為ε-PL的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定依據(jù)。

基金項(xiàng)目：江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（16KJD55002）。endprint