王宗瑩

立題背景

干酪乳桿菌作為益生菌的一種，能夠耐受有機(jī)體的防御機(jī)制，其中包括胃液中低pH值、口腔中的酶和小腸的膽汁酸等。所以干酪乳桿菌進(jìn)入人體后可以在腸道內(nèi)大量存活，起到促進(jìn)人體消化吸收、調(diào)節(jié)腸內(nèi)菌群平衡等作用 。

目前已知乳酸菌發(fā)揮主要生理功能特性的機(jī)理，除了主要代謝產(chǎn)物（如乳酸等）改善腸道內(nèi)環(huán)境外，乳酸菌的次生代謝產(chǎn)物如細(xì)菌素、SOD、胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）等也具有重要的作用。乳酸菌胞外多糖（LAB EPS）即是這類細(xì)菌在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外的粘液或夾膜多糖。自20世紀(jì)40年代成功開發(fā)出由腸明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)生右旋糖酐以來，新的微生物胞外多糖的研究與開發(fā)在世界范圍內(nèi)已成為研究的熱點(diǎn)。而乳酸菌胞外多糖因具有理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值已經(jīng)引起了許多學(xué)者的興趣。許多乳酸菌是歷史悠久的工業(yè)生產(chǎn)菌，乳酸菌EPS不僅對(duì)乳制品的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味具有重要影響，而且有可能成為食品級(jí)多糖的一個(gè)極好的來源而廣泛應(yīng)用于各種食品的增稠、乳化、穩(wěn)定、膠凝及保濕。

干酪乳桿菌

干酪乳桿菌的生長特性。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）屬于乳桿菌屬（Lactobacillus），是革蘭氏陽性菌，不產(chǎn)芽孢，不運(yùn)動(dòng)，無鞭毛，兼性異型發(fā)酵乳糖，不液化明膠；最適生長溫度為37℃；菌體兩端呈方形，長短不一，常成鏈；菌落粗糙，灰白色，有時(shí)呈微黃色，能發(fā)酵多種糖。干酪乳桿菌存在于人的腸道、口腔內(nèi)含物和大便及陰道中，也常常出現(xiàn)在牛奶和飼料、乳制品、面團(tuán)、干酪和垃圾中。

干酪乳桿菌的生理功能。（1）抗菌作用。研究表明，干酪乳桿菌不僅對(duì)很多細(xì)菌有拮抗作用，有的菌株還可以抑制酵母及霉菌的生長。Nemcova等報(bào)道L.paracasei可顯著降低剛斷奶幼豬體內(nèi)梭菌屬和腸桿菌的數(shù)量；雷虹等值乳酸菌發(fā)酵泡菜液中分離得到的干酪乳桿菌HD1-7對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、沙門氏菌等很多致病菌均有抑制作用。

（2）免疫作用。研究表明，干酪乳桿菌可增強(qiáng)宿主對(duì)微生物病原體的非特異性抵抗力，加快腸道內(nèi)病原體的清除，能夠改善腸道菌群紊亂和腸道通透性增強(qiáng)等，從而防止食物過敏和急性腹瀉，使抗低密度氧化脂抗體和CD4T-淋巴細(xì)胞增加，粒細(xì)胞的噬菌作用明顯增強(qiáng)，對(duì)宿主進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，防止腫瘤的產(chǎn)生。

多糖及其結(jié)構(gòu)

多糖。多糖屬于碳水化合物的一種，是由10個(gè)以上單糖分子通過糖苷鍵縮合而成的高聚物。多糖不是一種純粹的化學(xué)物質(zhì)，而是聚合程度不同的物質(zhì)的混合物。多糖類一般無甜味，不溶于水，不能形成結(jié)晶，無變旋現(xiàn)象和還原性。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解過程中，往往產(chǎn)生一系列的中間產(chǎn)物，最終完全水解得到單糖。

目前在多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析中大多采用化學(xué)方法與物理方法相結(jié)合，可基本闡明某一多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)的大致特征。而目前用于多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)分析的方法主要是物理方法， 諸如核磁共振、X-射線纖維衍射、電子衍射等。綜上所述，多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)本身就很復(fù)雜。由于多糖結(jié)構(gòu)的微觀不均一性， 或分子量分散， 或是結(jié)構(gòu)鍵中有缺陷，使多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析難以得出完全正確的結(jié)構(gòu)式。

多糖結(jié)構(gòu)。多糖的結(jié)構(gòu)層次與蛋白質(zhì)基本相似，分為一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)。其中，一級(jí)結(jié)構(gòu)變化較大，研究較為成熟，到目前為止，已經(jīng)建立的分析方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法，例如，高碘酸氧化、甲基化反應(yīng)、Smit11降解、酸水解、高效液相色譜法（HPLC）、質(zhì)譜法（MS）、氣相色譜法（GC） 、核磁共振譜法（NMR）、紅外光譜法（IR）、酶化學(xué)方法等[7]；二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)又合稱為高級(jí)結(jié)構(gòu)（又稱高級(jí)構(gòu)象），在很大程度上取決于一級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)其研究較為困難，目前多糖的立體結(jié)構(gòu)研究一般靠 2D-NMR及X-衍射法，除了常見的這幾類技術(shù)手段外，多處于探索階段。除此之外， 多糖的活性還與溶解度、分子量、粘度等理化性質(zhì)有關(guān)。在研究多糖的構(gòu)效關(guān)系時(shí)， 常用到多糖的分子修飾， 對(duì)多糖進(jìn)行化學(xué)修飾，如硫酸化、化學(xué)降解、烷基化、脫硫酸化、乙酰化、酶降解等等， 有助于深入探討其構(gòu)效關(guān)系。

多糖的結(jié)構(gòu)常因單糖構(gòu)型、糖基化方式、輕基取代情祝、分支度、相鄰單糖基糖鏈位置的不同而不同，其結(jié)構(gòu)的多變性使其成為生物體內(nèi)重要的信息載體。多糖結(jié)構(gòu)描述通常包括單糖組成、單糖構(gòu)型、分子量范圍、糖昔鍵構(gòu)型、重復(fù)單元、連接位點(diǎn)，甚至是空間構(gòu)型。

對(duì)于分子量較大的多糖，對(duì)其結(jié)構(gòu)研究大多停留在一級(jí)結(jié)構(gòu)層面，現(xiàn)目前往往不能得到令人滿意的結(jié)果，因此，探索更為有力的研究手段成為今后發(fā)展的重要方向。

多糖結(jié)構(gòu)的描述包括： ①多糖的分子量范圍；②多糖的單糖組分；③單糖的連接點(diǎn)類型；④單糖和糖苷鍵的構(gòu)型；⑤重復(fù)單位。

干酪乳桿菌胞外多糖

胞外多糖 （Exopolysaccharides ， EPS ）是由細(xì)菌和微型藻類在生長過程中分泌到細(xì)胞外的長鏈多糖，廣泛產(chǎn)生于細(xì)菌與少數(shù)酵母菌及絲狀真菌中。在自然環(huán)境中，EPS通常具有保護(hù)微生物細(xì)胞的作用，如受噬菌體侵染，避免細(xì)胞干燥脫水，還可穩(wěn)定滲透壓，參與細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞構(gòu)成等。EPS常常以莢膜多糖和薪多糖兩種形式存在，但對(duì)于微生物來說，主要是指小與細(xì)胞表面永久粘附的黏多糖[8]。

乳酸菌能分泌多糖于細(xì)胞外，形成莢膜多糖粘附于細(xì)胞表面或以粘質(zhì)多糖形式存在于細(xì)胞周邊培養(yǎng)基中，其形成有利于改善產(chǎn)品的質(zhì)地和黏度。目前報(bào)道的產(chǎn)胞外多糖的主要的乳桿菌菌株有德氏保加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、開菲爾乳桿菌、干酪乳桿菌干酪亞種、嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌和清酒乳桿菌等。

產(chǎn)生胞外多糖的條件不一定是菌株的最佳生長條件。一些研究表明，在不同于干乳桿菌最適生長條件下接種，可以促進(jìn)胞外多糖產(chǎn)量增加。GASSEM M A等認(rèn)為，較低的接種溫度將導(dǎo)致活菌數(shù)量緩慢增加，有利于延長穩(wěn)定期和對(duì)數(shù)期，從而有利于胞外多糖的形成。實(shí)驗(yàn)表明干酪乳桿菌在葡萄糖添加量為4.68%，pH值為3.2，發(fā)酵時(shí)間為27.51h的條件下能夠形成較高產(chǎn)量的胞外多糖聚合物。endprint

干酪乳桿菌胞外多糖結(jié)構(gòu)的鑒定

多糖結(jié)構(gòu)的鑒定一般采用化學(xué)方法和波譜分析?；瘜W(xué)方法主要包括酸解、甲基化、Smith降解過碘酸氧化等。波譜分析包括紅外吸收光譜、質(zhì)譜、核磁共振氫譜（1H NMR ）、二維核磁共振（2D NMR） 、核磁共振碳譜（13C NMR ）和X射線衍射法等。

對(duì)EPS進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析時(shí)多采用以下幾種方法：經(jīng)過完全的或部分水解后，將單糖或寡糖乙酰化衍生化，通過HPLC或GC-MS方法檢測(cè)單糖組成；采用甲基化法測(cè)定糖連接位置，通過各甲基化物之間的比例，還可以推斷出糖鏈重復(fù)單元中各種單糖的數(shù)目；糖并鍵構(gòu)型的確定方法有酶解法、分子旋光差法、紅外法、核磁共振法等，其中目前最常用的是核磁共振法；糖的氧環(huán)確定方法有13C NMR法、1H NMR法、甲醇解法、紅外法、Smith降解法等。

研究內(nèi)容

測(cè)定胞外多糖的總糖含量和蛋白質(zhì)含量，重點(diǎn)分析多糖中單糖組成及其比例。主要利用紫外分光光度法，凝膠色譜法和氣相色譜質(zhì)譜分析法。

材料與設(shè)備

干酪乳桿菌胞外多糖。

干酪乳桿菌胞外多糖樣品由實(shí)驗(yàn)室提供。

試劑。

單糖標(biāo)準(zhǔn)品（葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖），苯酚，濃硫酸，酪蛋白，考馬斯亮藍(lán)，乙醇，磷酸，三氟乙酸，甲醇，硼氫化鈉，乙酸酐，吡啶，氯仿。

儀器與設(shè)備。

電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9082 上海一恒科學(xué)儀器有限公司

DELTA 320 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司

分析天平XP205 瑞士梅特勒-托利多公司

紫外可見分光光度計(jì)UV-2550 日本島津公司

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agillent 6890-5973色譜系統(tǒng)，色譜柱DB-5 （60m×0.25mm×0.20μm））。

凝膠色譜柱及檢測(cè)器（色譜柱為Agilent PL aquagel-OH mixed柱（300mm×7.5mm，i.d.8?m），示差折光檢測(cè)器）。

實(shí)驗(yàn)方法

單糖的含量總量測(cè)定。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。準(zhǔn)確稱取葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分別吸取1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6及0.4ml，各以蒸餾水補(bǔ)至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml，搖勻冷卻，室溫放置20分鐘以后于490nm測(cè)光密度，以2.0ml水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為多糖微克數(shù)，縱坐標(biāo)為光密度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品的測(cè)定。吸取2 ml的樣品液，然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml，搖勻冷卻室溫放置20分鐘以后于490nm測(cè)光密度。

總糖%=測(cè)得總糖含量/樣品總量×100%

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

（1）酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備與保存

取0.1mg/ml的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，4.0℃～5.0℃冰箱中保存。

（2）考馬斯亮藍(lán)G-250溶液的制備

精密稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 100.00mg加入95%乙醇50ml，再加入85%磷酸100ml，然后用蒸餾水定容至1000ml。最終試劑為含0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250，4.7%乙醇，8.5%磷酸，置于棕色瓶中備用。

（3）樣品的制備

精確稱取干酪乳桿菌胞外多糖100.00mg加蒸餾水溶解定容至100ml，即為1mg/ml樣品溶液。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0ml于10ml試管中，各管加水調(diào)整至1ml，加入已配置好的考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5ml，混勻，放置10min，以空白試劑參比，于595nm處測(cè)定其吸光度。并記錄且繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（5）樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

取樣品溶液各1ml，同時(shí)做三個(gè)重復(fù)，以空白試劑為參比，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定法，分別測(cè)定他們吸光度值，計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量。

凝膠色譜分析多糖中單糖構(gòu)成。

（1）干酪乳桿菌胞外多糖的水解。精確稱取1份干酪乳桿菌胞外多糖20. 0mg于試劑瓶中，加入2.0 mol/ L TFA 5ml，封管，置于110 ℃烘箱內(nèi)進(jìn)行水解，水解時(shí)間分別為8h。冷卻至室溫，將水解液低于50℃減壓蒸干，然后加入甲醇蒸干，備用。

（2）色譜條件。色譜柱為Agilent PL aquagel-OH mixed柱（300mm×7.5mm，i .d . 8?m）， 柱溫30℃；流動(dòng)相為水，流速1mL/min；進(jìn)樣量50?L；示差折光檢測(cè)器，檢測(cè)溫度35℃。

GC-MS法分析多糖的單糖組成。

（1）樣品衍生化。取多糖水解樣品，溶于2 mL蒸餾水中，加入硼氫化鈉，還原反應(yīng)2 h，蒸干；將還原后的糖醇置于110 ℃烘箱中加熱，加入乙酸酐和吡啶，100 ℃反應(yīng)1 h，蒸干。將乙?；漠a(chǎn)物用4 mL氯仿溶解后過濾，上機(jī)。

（2）色譜條件。程序升溫條件： 初始溫度200℃ ； 以25℃/min，升溫至250℃，保持11min。色譜柱： DB-5 （60m×0.25mm×0.20μm）Agillent 6890-5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；進(jìn)樣口：250℃；離子源： EI；四級(jí)桿溫度：150℃；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：280℃；載氣：He；進(jìn)樣模式：splitless ；流速：1ml/min；電離方式：EI，70eV；質(zhì)量掃描范圍：50～550 amu

結(jié)果與討論

單糖含量的測(cè)定。endprint

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

（2）樣品結(jié)果測(cè)定及分析

測(cè)得樣品OD值為0.998

該干酪乳桿菌胞外多糖總糖百分含量

=（184.296÷2÷1000）/0.1×100%

= 92.148%

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知 該干酪乳桿菌中含有糖類總量為92.148%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。對(duì)其雜項(xiàng)本文并未作出細(xì)致分析，將留待下次試驗(yàn)解決。但通過該實(shí)驗(yàn)可以說明，該干酪乳桿菌胞外多糖中不僅僅含有糖類物質(zhì)，同時(shí)也含有其他待確認(rèn)物質(zhì)。

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

（1）酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

得其線性回歸方程式A= 0.0081C-0.0739 R2=0.9962 相關(guān)系數(shù)r=0.9980 表明蛋白質(zhì)在10?g/ml～100 ?g/ml 范圍內(nèi)很好地符合朗伯-比爾（Lamber-Beer）定律。

（2）樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

按上述蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法，同時(shí)做三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，經(jīng)測(cè)定吸光度值分別為0.459 ，0.458 ，0.441，計(jì)算得干酪乳桿菌胞外多糖中蛋白質(zhì)含量分別為6.58% ，6.57%，6.37%，平均含量為6.51%。

凝膠色譜分析多糖中單糖構(gòu)成。

凝膠色譜圖譜如圖3所示。

通過分析發(fā)現(xiàn)，該多糖樣品中主要有5種單糖組分。但在5.0-8.0ml范圍內(nèi)時(shí)，峰型較寬且出峰較緩，分析結(jié)果不十分明顯，預(yù)計(jì)分析為在此情況下仍有組分未被分解出來。但由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間條件有限，故僅作此粗略分析。

GC-MS法分析多糖的單糖組成。

干酪乳桿菌胞外多糖的單糖構(gòu)成氣質(zhì)圖譜如下圖。圖4為單糖混標(biāo)圖譜，圖5為樣品圖譜。

通過GC-MS分析結(jié)果可知：干酪乳桿菌胞外多糖主要由阿拉伯糖，木糖，甘露糖，鼠李糖，葡萄糖，半乳糖等6種單糖組成。當(dāng)然不排除該糖樣品中還包括有其他糖類物質(zhì)，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條件及時(shí)間有限，對(duì)于氣相色譜的實(shí)驗(yàn)要求也非常高，故而該實(shí)驗(yàn)不能一次完成更多糖樣品的測(cè)定。根據(jù)文獻(xiàn)，在乳酸菌胞外多糖結(jié)構(gòu)中最常見的有甘露糖，鼠李糖，半乳糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖7種單糖。分析如下：

由上表可知，在本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得，干酪乳桿菌胞外多糖中主要含有六種單糖，分別是阿拉伯糖，木糖，甘露糖，葡萄糖，鼠李糖和半乳糖。其中以甘露糖，半乳糖和葡萄糖的含量較多。六種單糖的含量比為葡萄糖：甘露糖：鼠李糖：半乳糖：阿拉伯糖：木糖=1.0000：3.4249：0.0670：1.6030：0.6326：0.2150。

經(jīng)分析，干酪乳桿菌胞外多糖凍干樣品中總糖含量為92.148%（以葡萄糖計(jì)），蛋白質(zhì)含量為6.51%，該多糖由阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6種單糖組成，六種單糖的含量比依次為葡萄糖：甘露糖：鼠李糖：半乳糖：阿拉伯糖：木糖=1.0000：3.4249：0.0670：1.6030：0.6326：0.2150.

本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)干酪乳桿菌胞外多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，且分析并不完善，有待進(jìn)一步研究，接下來可以探索通過陰離子液相色譜，氣相色譜，薄層分析等方法對(duì)干酪乳桿菌胞外多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，以增強(qiáng)對(duì)干酪乳桿菌胞外多糖的了解，并通過此對(duì)乳酸菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)開始進(jìn)行進(jìn)一步的探索。endprint