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        氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量

        2017-11-16 16:19:02呂昱王立雄嚴(yán)敏田仁奎
        科技創(chuàng)新與應(yīng)用 2017年33期
        關(guān)鍵詞:外標(biāo)法質(zhì)譜聯(lián)用氣相色譜

        呂昱+王立雄+嚴(yán)敏+田仁奎

        摘 要:采用固相萃取(SPE)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法建立測(cè)定醬油中氨基甲酸乙酯含量的方法,醬油試樣經(jīng)過(guò)C18萃取柱凈化提純后,用丙酮-二氯甲烷溶液進(jìn)行洗脫后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)檢測(cè),利用選擇離子掃描模式以及外標(biāo)法進(jìn)行定性定量分析。氨基甲酸乙酯在1-10μg/mL濃度范圍之間線(xiàn)性關(guān)系良好,r2=0.9938,檢測(cè)限為0.014μg/mL,定量限為0.048μg/mL,加標(biāo)回收率為97.78%(n=6),用這種方法對(duì)貴州地區(qū)市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量檢測(cè),結(jié)果在340-440μg/mL之間。

        關(guān)鍵詞:氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;氨基甲酸乙酯;市售醬油;外標(biāo)法

        中圖分類(lèi)號(hào):O658.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):2095-2945(2017)33-0067-03

        1 概述

        氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一種具有基因致癌的多位點(diǎn)致癌物質(zhì),在2007年2月被國(guó)際癌研究機(jī)構(gòu)將其從2B類(lèi)(“可能令人類(lèi)患癌的物質(zhì)”)升級(jí)為2A類(lèi)(“能令人類(lèi)患癌的物質(zhì)”)致癌物質(zhì)[1],[2],但是在它被定義為可能致癌物質(zhì)以前,它曾經(jīng)在醫(yī)學(xué)上作為抗腫瘤藥物和麻醉劑使用過(guò)[3]。它是發(fā)酵食品(如醬油、腐乳、奶酪)和酒精飲品在發(fā)酵過(guò)程中的中間產(chǎn)物[4]。

        醬油是我國(guó)各大菜系中一種傳統(tǒng)的調(diào)味品,它是用豆、麥或者麩皮釀造的液體調(diào)味品,因?yàn)檫@種釀造技術(shù)屬于發(fā)酵工程,在發(fā)酵過(guò)程中容易發(fā)生各種復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng),生成如氨基甲酸乙酯、氯丙醇、酚醛類(lèi)等物質(zhì)。其中氨基甲酸乙酯這一物質(zhì)作為一種2A類(lèi)致癌物質(zhì),它具有生物遺傳毒性,在進(jìn)入人體后會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)造成不可逆的損傷,它在人體內(nèi)被細(xì)胞色素P450氧化后,氧化產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)Cμ2+調(diào)控的DNA發(fā)生損傷,從而導(dǎo)致癌變[5]。所以越來(lái)越多的國(guó)家認(rèn)識(shí)到這種物質(zhì)的危害性,國(guó)際上現(xiàn)行的氨基甲酸乙酯的檢測(cè)方法是氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)法[6],我國(guó)目前對(duì)醬油中氨基甲酸乙酯的含量限定及檢測(cè)方法尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn),本研究以固相萃取結(jié)合GC/MS建立一種使用外標(biāo)法來(lái)測(cè)定市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量的方法,為貴州地區(qū)市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量限定作一定參考。

        2 試驗(yàn)材料、試劑及儀器

        正己烷使用液:(色譜純)天津市化學(xué)試劑廠(chǎng)

        二氯甲烷使用液:(分析純)成都金山化學(xué)試劑有限公司

        甲醇使用液;(分析純)純度≥99.5%,天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

        丙酮使用液;(分析純)天津市康科德科技有限公司

        氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品;

        1號(hào)醬油;味莼園牌黃豆醬油,貴陽(yáng)味莼園食品有限公司

        2號(hào)醬油;味莼園牌特鮮醬油,貴陽(yáng)味莼園食品有限公司

        3號(hào)醬油;味莼園牌衛(wèi)生醬油,貴陽(yáng)味莼園食品有限公司

        4號(hào)醬油;味莼園牌鮮醬油,貴陽(yáng)味莼園食品有限公司

        5號(hào)醬油;黃豆醬油,貴陽(yáng)市白云區(qū)醬菜廠(chǎng)

        氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;安捷倫公司7890A/5975C型GC/MS

        實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)用超純水機(jī);四川沃特爾科技發(fā)展有限公司

        固相萃取儀;12位方缸固相萃取裝置,月旭材料科技(上海)有限公司

        3 實(shí)驗(yàn)條件

        3.1 儀器條件

        進(jìn)樣口溫度230℃,初始柱溫100℃保持3min,階升20℃至180℃,后運(yùn)行230℃保持2min,分流模式,分流比1:10,溶劑延遲2min,全掃描模式。

        3.2 固相萃取條件

        醬油中成分復(fù)雜,基質(zhì)種類(lèi)繁多,極容易對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成干擾,所以在進(jìn)行儀器分析方法檢測(cè)含量之前對(duì)醬油進(jìn)行預(yù)處理,盡可能的進(jìn)行分離純化,將其中所含的EC提取出來(lái)[7]。由于氨基甲酸乙酯屬于極性易溶于水的物質(zhì)[7],為保證醬油中樣品檢測(cè)的回收率,經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明EC需停留在萃取柱中的萃取時(shí)間在30min,選擇添加丙酮-二氯甲烷(V/V)洗滌液來(lái)進(jìn)行洗脫,而且體積比為1:9的丙酮-二氯甲烷洗脫液過(guò)C18萃取小柱時(shí),回收效果最好。

        3.3 氨基甲酸乙酯氣質(zhì)聯(lián)用的定性離子的確定

        建立一個(gè)氨基甲酸乙酯檢測(cè)方法,進(jìn)樣口溫度230℃,選擇分流模式,分流比1:10;柱溫:初始100℃,保持3min,后20℃/min上升至180℃,后運(yùn)行230℃,保持2min,輔助加熱器230℃;MS條件:溶劑延遲2min,全掃描模式,全掃描參數(shù)開(kāi)始 30結(jié)束450。

        以濃度為10μg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)溶夜進(jìn)樣一次,檢測(cè)得到一個(gè)峰型較好的峰圖,對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行Nist譜庫(kù)檢索,譜庫(kù)檢索為氨基甲酸乙酯這一物質(zhì),并確定保留時(shí)間為5.75min,確定氨基甲酸乙酯的定性離子為44、62、89,總離子流圖如圖1。

        4 試驗(yàn)過(guò)程

        4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

        4.1.1 EC標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

        用分析天平精密稱(chēng)定100mg在120℃干燥至恒重的EC標(biāo)準(zhǔn)樣品,用甲醇定容至100ml得到濃度為1mg/mL的母液(冰箱里3℃存放);準(zhǔn)確吸取1000μL母液于100mL的容量瓶中用甲醇定容至刻度,所得溶液即濃度為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

        4.1.2 梯度濃度的EC標(biāo)液的配置

        準(zhǔn)確量取100μL、1000μL、2000μL、5000μL、10000μL濃度為10μg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10mL的容量瓶中用甲醇定容至刻度,即為0.1μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)溶液。

        4.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作:按照3.3的方法分別進(jìn)樣5個(gè)不同濃度的EC標(biāo)液,然后以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

        4.2 樣品處理

        稱(chēng)取1號(hào)市售醬油5mL于干燥潔凈的燒杯中,對(duì)固相萃取柱作如下處理,將固相萃取柱裝上樣,依次用2mL甲醇和正己烷活化萃取小柱,接著再用4mL純化水平衡萃取小柱。將燒杯中的醬油倒入萃取小柱中抽真空,讓醬油停留在萃取小柱中保持30min,然后將萃取小柱上的醬油緩慢抽到廢液管中,再用正己烷淋洗以洗去雜質(zhì),最后用1:9丙酮-二氯甲烷洗脫液以自然流速洗脫,洗脫液置于45℃恒溫水浴鍋中濃縮至0.3mL左右,轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中并用甲醇加至1mL,對(duì)2到5號(hào)醬油同操作。endprint

        4.3 醬油中氨基甲酸乙酯含量的測(cè)定

        將4.4中的1至6號(hào)醬油處理液用標(biāo)簽紙做好相應(yīng)標(biāo)記,按順序放入GC/MS自動(dòng)進(jìn)樣器的旋轉(zhuǎn)盤(pán)上。調(diào)用方法,并且改變MS掃描模式為離子掃描模式,離子掃描參數(shù)44、62、89。分別進(jìn)樣1至5號(hào)進(jìn)樣瓶,檢測(cè)五個(gè)樣品中的氨基甲酸乙酯含量,每個(gè)樣品瓶分別進(jìn)樣6次。

        4.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

        取2號(hào)醬油樣品(含量約0.43μg/mL)1mL,分別添加0.5μg/mL和0.75μg/mL和1.0μg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)溶液各1mL,每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液都添加三份,共九份,按照3.3項(xiàng)下的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)出加標(biāo)后的測(cè)定值。

        加標(biāo)回收率公式:加標(biāo)回收率=(加標(biāo)試樣測(cè)定值-試樣測(cè)定值)/加標(biāo)量×100%。

        4.5 精密度實(shí)驗(yàn)

        取5號(hào)醬油處理液,連續(xù)六次測(cè)定數(shù)據(jù),計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

        4.6 線(xiàn)性范圍

        取濃度為10μg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)溶夜,GC/MS進(jìn)樣1μL,選擇離子掃描模式檢測(cè),以62離子作為定量離子峰,以氨基甲酸乙酯濃度為橫坐標(biāo),62離子強(qiáng)度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[8],在安捷倫工作站里建立曲線(xiàn)校正方法,得出它的線(xiàn)性條件和線(xiàn)性范圍。

        4.7 檢測(cè)限的測(cè)定

        取濃度為2μg/mL的氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)液,GC/MS進(jìn)樣1μL,對(duì)其進(jìn)行性能報(bào)告分析,然后根據(jù)信噪比公式D=3S/N,由此推算出學(xué)院GC/MS儀器用這種方法檢測(cè)氨基甲酸乙酯的檢測(cè)限。

        5 結(jié)果分析

        由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液在1-10μg/mL濃度范圍之間線(xiàn)性關(guān)系良好,實(shí)驗(yàn)所得線(xiàn)性方程為Y=2.906X-7.925(r2=0.9938)。

        由性能報(bào)告峰譜圖89,所以其檢測(cè)限應(yīng)該為0.014μg/mL,按照信噪比S/N為10得出定量限為0.048μg/mL。

        回收率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析

        平均回收率為97.78%,RSD為2.59%,表明該方法準(zhǔn)確度較高,可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出醬油中的氨基甲酸乙酯的含量。

        精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

        5號(hào)醬油的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=6)為6.5%,表明該儀器精密度良好。

        市售醬油中的氨基甲酸乙酯含量確定

        貴州地區(qū)5種市售醬油結(jié)果見(jiàn)表1,表明1至4號(hào)醬油中氨基甲酸乙酯濃度較5號(hào)醬油中的多。

        6 結(jié)束語(yǔ)

        經(jīng)過(guò)固相萃取和液液萃取的結(jié)果分析,該方法用到固相萃取對(duì)醬油進(jìn)行凈化和提純是因?yàn)镋C這一物質(zhì)在C18萃取柱中溶解度比在液體中的溶解度高,固相萃取法能有效分離提取醬油中EC。經(jīng)過(guò)GC/MS儀器檢測(cè)后,利用系統(tǒng)自帶的質(zhì)譜可以輕易的發(fā)現(xiàn)EC這一物質(zhì),雖然學(xué)院的氣質(zhì)聯(lián)用儀在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)的質(zhì)譜和標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)中的EC質(zhì)樸圖并不完全一樣,但是這是由于EC的物質(zhì)結(jié)構(gòu)和我們所用的質(zhì)譜檢測(cè)器的檢測(cè)原理不同而造成的[9],這并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

        GC/MS檢測(cè)法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.5%(n=6),這種方法的檢測(cè)限為0.014μg/mL,線(xiàn)性范圍為1-100μg/mL,加標(biāo)回收率可達(dá)到97.78%,加標(biāo)回收率的RSD可達(dá)2.59%,這種方法具有靈敏度高、緊密度良好、線(xiàn)性范圍較廣等特點(diǎn),貴州地區(qū)市售醬油中氨基甲酸乙酯含量在0.34-0.44μg/mL(既是340-440μg/Ml)之間,超過(guò)20μg/L。結(jié)果表明采用SFE結(jié)合GC/MS法對(duì)貴州地區(qū)市售醬油中氨基甲酸乙酯的檢測(cè)進(jìn)行定性、定量分析能達(dá)到檢測(cè)目的。

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