張同剛+范玲

摘 要：以小鱷龜肉為原料，通過單因素試驗及響應(yīng)面分析優(yōu)化小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的萃取條件，采用頂空固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)檢測并分析小鱷龜肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，同時結(jié)合化合物的感覺閾值，利用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）法確定關(guān)鍵風(fēng)味化合物。結(jié)果表明：小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的最佳萃取條件為萃取時間25 min、萃取溫度60 ℃、樣品添加量1.0 g。在此萃取條件下，從去皮及帶皮小鱷龜肌肉中分別檢測出33 種和37 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，且關(guān)鍵風(fēng)味化合物種類基本相同，主要是D-檸檬烯、壬醛、3-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛、（Z）-4-庚烯醛、苯乙醛、庚醛、己醛、1-辛烯-3-醇、二甲基硫醚及2-乙基呋喃等化合物，它們共同決定了小鱷龜肌肉的整體風(fēng)味。

關(guān)鍵詞：小鱷龜肉；響應(yīng)面分析；固相微萃?。粴庀嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用；關(guān)鍵風(fēng)味化合物

Optimization of Solid-Phase Microextraction Conditions by Response Surface Methodology for Gas Chromatography-Mass Spectrometry Determination of Key Flavor Compounds in Chelydra serpentina Muscle

ZHANG Tonggang， FAN Ling*

（School of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract： A solid-phase microextraction （SPME） procedure for the determination of volatile compounds in Chelydra serpentina muscle by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） was presented. The extraction conditions were optimized using a combination of one-factor-at-a-time method and response surface methodology. The key flavor compounds were determined by their sensory threshold and relative odor activity value （ROAV）. The results showed that the optimal extraction conditions were determined as follows： extraction time 25 min， extraction temperature 60 ℃ and sampling weight 1.0 g. Under these optimized conditions， a total of 37 and 33 volatile flavor compounds were found in Chelydra serpentina muscle with and without skin， respectively. The key flavor components in both samples were basically the same， mainly including heptyl aldehyde， 3-methyl butanal，3-methylthiopropanal， phenylacetaldehyde，1-octene-3-alcohol， D-limonene， nonanoic acid， hexanal， dimethyl sulfide， （Z）-4-heptenal， and 2-ethyl-furan.

Key words： Chelydra serpentine muscle； response surface methodology； solid phase microextraction； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）； key flavor compounds

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201708007

中圖分類號：TS251.1 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）08-0034-05

小鱷龜（Chelydra serpentina），又名蛇鱷龜，隸屬爬行綱、龜鱉亞綱、龜鱉目、曲頸龜亞目、鱷龜科、鱷龜屬，原產(chǎn)于北美洲地區(qū)，90年代后期作為寵物龜少量引入我國[1]。小鱷龜具有抗病能力好、生長速度較快、體型相對較大、殼薄肉多等特點，其肉質(zhì)肥美、細膩、營養(yǎng)豐富、無異味，具有很高的經(jīng)濟和食用價值[2]。目前，對小鱷龜?shù)臏厥茵B(yǎng)殖、人工繁殖、性別決定、餌料偏好等方面已進行過一些研究[3-9]，劉翠娥等[10]研究了小鱷龜?shù)暮饴屎图∪庵械臓I養(yǎng)成分，證實小鱷龜肉是一種高蛋白、低脂肪的優(yōu)質(zhì)肉類。但小鱷龜肉風(fēng)味方面的相關(guān)報道較少。

本研究以人工養(yǎng)殖小鱷龜為研究對象，采用頂空固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）技術(shù)與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)結(jié)合測定小鱷龜肌肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，首次結(jié)合感覺閾值，利用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）[11-14]確定小鱷龜肉的關(guān)鍵風(fēng)味成分，為小鱷龜肉制品的進一步開發(fā)與研究提供理論參考。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用鱷龜購自廣東省順德區(qū)煒杰龜鱉養(yǎng)殖場，共4 只，雌性，二齡龜，體質(zhì)健壯、無病害，平均體質(zhì)量（3 300±20） g。宰殺取肉，用蒸餾水清洗后分別裝入保鮮袋中，-80 ℃超低溫冰箱速凍保存。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-2（2003-61）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取頭（65 μm） 日本島津公司；HH.SY21-Ni6-C高速組織搗碎機 江蘇金壇市億通電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗設(shè)計

選擇萃取時間分別為15、20、25、30、35 min（萃取溫度60 ℃，樣品添加量1.0 g），萃取溫度分別為50、55、60、65、70 ℃（萃取時間25 min，樣品添加量1.0 g），樣品添加量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g（萃取時間25 min，萃取溫度60 ℃），研究不同因素對去皮小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果的影響。

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，進行三水平三因素響應(yīng)面優(yōu)化試驗，對去皮小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的萃取條件進行優(yōu)化。

1.3.3 樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)提取

樣品預(yù)處理：將去皮及帶皮小鱷龜肌肉樣品放入高速組織搗碎機中制成糜狀，備用。

樣品的SPME：參考文獻[15]中的方法，并稍作修改。將4 g肌肉樣品置于20 mL透明玻璃頂空瓶中，加入0.6 g氯化鈉，混合均勻，80 ℃恒溫水浴15 min；把SPME針頭插入頂空瓶中對樣品進行萃取，15 min之后將萃取纖維頭取出，插入GC-MS儀進樣口，脫附3 min后，開始檢測。

1.3.4 樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測

GC條件：參考文獻[15]中的方法，并略作修改。Agilent DB-5MS檢測柱（30 m×0.25 mm，0.5μm），He為載氣，設(shè)定流速為3.7 mL/min，不分流；進樣器溫度250 ℃，氫火焰離子化檢測器（hydrogen flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度250 ℃，檢測柱初溫50 ℃，保持2 min，以15 ℃/min的速率升溫至100 ℃，再以6 ℃/min的速率升溫至210 ℃，保持10 min，之后以10 ℃/min的速率升溫至260 ℃，再以5 ℃/min的速率升溫至280 ℃。

MS條件：GC-MS接口溫度250 ℃，質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍20～450 u[15]。

1.3.5 關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的ROAV測定

采用ROAV法，把樣品中對風(fēng)味貢獻最大組分的ROAV賦值為100（ROAVstan=100），其余風(fēng)味物質(zhì)的ROAV按照下式計算。

式中：Cri為各組分的相對含量/%；Ti為各組分的感覺閾值/（μg/kg）；Crstan為對樣品整體風(fēng)味貢獻最大物質(zhì)的相對含量/%；Tstan為對樣品整體風(fēng)味貢獻最大物質(zhì)的感覺閾值/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用峰面積歸一化法計算各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對百分含量，采用SPSS 17.0軟件和Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪圖，通過美國國家科學(xué)技術(shù)研究所出版的NIST05a.L質(zhì)譜譜庫對化合物定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken試驗

結(jié)合以總峰面積為評價指標(biāo)的單因素試驗結(jié)果，選擇萃取時間為20、25、30 min，萃取溫度為55、60、65 ℃，樣品添加量為0.5、1.0、1.5 g，以總峰面積作為響應(yīng)值，進行三水平三因素響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗因素水平與結(jié)果如表1所示。

利用Design Expert 8.0軟件對表1中的數(shù)據(jù)進行分析，得到二次多項式回歸模型：Y=-13.67+21.35A+

10.96B-6.52C+3.04AB-0.52AC-6.01×10-3BC+0.58A2-1.03B2-0.27C2。由表2可知，二次多項式回歸模型顯示出極顯著水平（P<0.01），說明所得回歸方程與實際情況的吻合度較好；C、B2和C2對實驗結(jié)果影響極顯著（P<0.01），各因素對總峰面積影響的大小順序為萃取時間>樣品添加量>萃取溫度。

由圖1可知，當(dāng)萃取時間為24.86 min、萃取溫度為60.14 ℃時，去皮小鱷龜肉樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總峰面積達到最大值；由圖2可知，當(dāng)萃取時間為24.86 min、樣品添加量為1.02 g時，總峰面積達到最大值；由圖3可知，當(dāng)樣品添加量為1.02 g、萃取溫度為60.14 ℃時，總峰面積達到最大值。綜上所述，去皮小鱷龜肉樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總峰面積達到最大值時的萃取條件為萃取時間24.86 min、萃取溫度60.14 ℃、樣品添加量1.02 g。

2.2.2 模型驗證

當(dāng)選取萃取條件為萃取時間24.86 min、萃取溫度60.14 ℃、樣品添加量1.02 g時，去皮小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總峰面積預(yù)測值為1.562×106?？紤]到實驗操作的方便性，對萃取條件進行適當(dāng)調(diào)整，選擇萃取時間為25 min、萃取溫度為60 ℃、樣品添加量為1.0 g進行5 次平行實驗，總峰面積平均值為1.489×106。預(yù)測值與實驗值的誤差為1.46%，說明本研究得到的小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的最佳萃取條件可行性較好。

2.2 小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

在最佳萃取條件下，采用SPME與GC-MS聯(lián)用，得到去皮及帶皮小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總離子流圖，如圖4～5所示。其中去皮小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總峰面積為1.489×106。endprint

由表3可知，去皮及帶皮小鱷龜肉中分別檢測出33 種和37 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，相同成分共有8 類、23 種，分別是烴類、醛類、醇類、酮類、醚類、酯類、酸類和雜環(huán)類化合物。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量與風(fēng)味特征沒有直接關(guān)系，小鱷龜肉的整體風(fēng)味由揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的感覺閾值和相對含量共同決定。壬醛在去皮及帶皮小鱷龜肉中的相對含量均較高，且感覺閾值相對較?。?.0 μg/kg），對小鱷龜肉的整體風(fēng)味貢獻最大，因此定義壬醛的ROAVstan=100.00，其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的ROAV由1.3.5節(jié)中的公式計算得到。所有可測得ROAV的物質(zhì)均滿足0≤ROAV≤100.00，ROAV越大的組分對樣品整體風(fēng)味的貢獻率也越大，其中ROAV≥1.00的組分為樣品的重要風(fēng)味成分，0.10≤ROAV≤1.00的組分為樣品中比較重要的風(fēng)味成分。小鱷龜肉的主體風(fēng)味物質(zhì)由D-檸檬烯、壬醛、3-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛、（Z）-4-庚烯醛、苯乙醛、庚醛、己醛、1-辛烯-3-醇、二甲基硫醚及2-乙基呋喃等構(gòu)成，因此小鱷龜肉的主體風(fēng)味物質(zhì)主要是醛類物質(zhì)；2-甲基萘、苯乙酮、乙酸丁酯及2-乙酰基噻唑等化合物對小鱷龜肉的整體風(fēng)味有比較重要的影響。

肉中的烴類物質(zhì)主要來自脂肪酸烷氧自由基的均裂，烴類物質(zhì)同時也是某些雜環(huán)化合物的重要前體物質(zhì)，對整體風(fēng)味有重要作用[16]；大部分醛類物質(zhì)來自肉中脂肪酸的氧化分解，是對肉制品風(fēng)味貢獻最大的一類揮發(fā)性風(fēng)味成分[17-20]，飽和直鏈醛（如壬醛、庚醛和己醛等）在小鱷龜肉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中占較大比例，對小鱷龜肉腥味的產(chǎn)生起著重要作用，己醛是由肉中的亞油酸氧化形成的，目前己醛已經(jīng)是評價肉制品氧化程度與風(fēng)味的可靠指標(biāo)；醇類物質(zhì)對風(fēng)味的影響不如醛類物質(zhì)顯著，但也對整體風(fēng)味有關(guān)鍵貢獻[21]；酯類物質(zhì)通常是由肌肉中的脂肪氧化所產(chǎn)生的游離脂肪酸與醇類物質(zhì)相互作用產(chǎn)生的；而酮類物質(zhì)則由不飽和脂肪酸的熱降解或氧化降解產(chǎn)生，感覺閾值較高，對肉品風(fēng)味的貢獻較小[22]。

具有魚腥味的庚醛和己醛在帶皮小鱷龜肉中的含量高于去皮小鱷龜肉，帶皮小鱷龜肉的異味大于去皮小鱷龜肉，因此小鱷龜皮可能是小鱷龜肉腥味的主要來源之一。這一結(jié)論能夠為減少小鱷龜肉產(chǎn)品中的異味（腥味）提供依據(jù)和參考，使此類產(chǎn)品能被更多的消費者所接受。

3 結(jié) 論

本研究采用SPME-GC-MS法，通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗，得出提取小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的最佳條件為萃取時間25 min、萃取溫度60 ℃、樣品添加量1.0 g。在此萃取條件下，利用各揮發(fā)性化合物的ROAV推斷小鱷龜肉的關(guān)鍵風(fēng)味成分，結(jié)果表明，小鱷龜肉的主體風(fēng)味物質(zhì)由D-檸檬烯、壬醛、3-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛、（Z）-4-庚烯醛、苯乙醛、庚醛、己醛、

1-辛烯-3-醇、二甲基硫醚及2-乙基呋喃等化合物構(gòu)成，并推測小鱷龜皮可能是小鱷龜肉腥味的主要來源之一，為小鱷龜肉制品的進一步開發(fā)與研究提供參考。

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