祖力皮喀爾·阿卜杜熱合曼　王延蛟+++娜孜拉木·玉蘇甫江　古麗尼格爾·雪合拉提　斯坎德爾·白克力

[摘要] 目的 探討維藥異常黑膽質(zhì)成熟劑在異常黑膽質(zhì)型肝癌病證大鼠模型中的抗肝癌作用。 方法 90只清潔級雄性Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成正常組、對照肝癌組、異黑肝癌組和成熟劑高、中、低劑量組6組，每組各15只。正常組正常飼養(yǎng)，對照肝癌組正常飼養(yǎng)21 d后給予二乙基亞硝胺（DEN）20周誘導(dǎo)肝癌。異黑肝癌組和成熟劑高、中、低劑量組大鼠通過干寒屬性飼料、干寒氣候環(huán)境、足底電刺激，夾尾以及強(qiáng)迫游泳等多因素復(fù)合作用21 d建立異常黑膽質(zhì)證載體動物模型，再加用DEN20周誘導(dǎo)建立異常黑膽質(zhì)型肝癌病證模型；DEN誘導(dǎo)的同時，成熟劑高、中、低劑量組用異常黑膽質(zhì)成熟劑按高、中、低（6.0、3.0、1.5 g/kg）劑量進(jìn)行干預(yù)。提取肝組織中mRNA，利用基因芯片技術(shù)篩選出的大鼠肝臟差異表達(dá)的Id4和p21候選基因并用RT-qPCR法驗證。 結(jié)果 與正常組比較，對照肝癌組肝組織Id4基因表達(dá)下調(diào)（P < 0.01）；與對照肝癌組比較，異黑肝癌組肝組織Id4基因表達(dá)下調(diào)（P < 0.01）；與異黑肝癌組相比，成熟劑高、中、低劑量肝組織Id4基因表達(dá)均上調(diào)，其中成熟劑高、中劑量組升高顯著（P < 0.01）。與正常組相比，對照肝癌組肝組織p21基因表達(dá)上調(diào)（P < 0.01）；與對照肝癌組比較，異黑肝癌組肝組織p21基因表達(dá)上調(diào)（P < 0.05）；與異黑肝癌組相比，成熟劑高、中、低劑量肝組織p21基因表達(dá)均下調(diào)，其中成熟劑中、低劑量組下降明顯（P < 0.01）。 結(jié)論 異常黑膽質(zhì)成熟劑可影響異常黑膽質(zhì)型肝癌病證模型大鼠肝臟Id4和p21基因的mRNA表達(dá)水平。

[關(guān)鍵詞] 異常黑膽質(zhì)型肝癌；異常黑膽質(zhì)成熟劑；Id4；p21

[中圖分類號] R73 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（c）-0009-05

The influence of Abnormal Savda Munziq on mRNA expressions of Id4 and p21 genes in abnormal savda hepatocellular carcinoma rat models

Zulipikaer·Abudureheman WANG Yanjiao Nazilamu·Yusufujiang Gulinigeer·Xuehelati Sikandeer·Baikeli

Department of Molecular Biology， Basic Medical College， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China

[Abstract] Objective To investigate the anticancer role of Uyghur medicine Abnormal Savda Munziq （ASM） in abnormal savda hepatocellular carcinoma rat models. Methods 90 male Wistar rats were divided into 6 groups， including normal group， control hepatic carcinoma group， abnormal savda hepatocellular carcinoma group and ASM high， middle and low dosage group by random number table， with 15 cases in each group. The normal group rats were placed in normative feeding environment. After 21 days of feeding in laboratory environment， the control hepatic carcinoma group rats were induced by diethylnitrosamine （DEN） 20 weeks to establish the liver cancer rat model. The rats in the abnormal savda hepatocellular carcinoma group， ASM high， middle and low dosage group were established abnormal black bile models， through dry cold property feed， dry cold climate environment， plantar electrical stimulation， tail and forced swimming， etc； after 21 days they were induced by DEN for 20 weeks to establish the abnormal savda hepatocellular carcinoma models. At the same time， the rats in the ASM high， middle and low dosage group were intervened by 6.0， 3.0， 1.5 g/kg of ASM. The mRNA was extracted from liver tissue and Id4， p21 gene were verified by RT-qPCR after screened by gene chip technology. Results The Id4 gene expression in liver tissue was down-regulated in control hepatic carcinoma group ，compared with the normal control group （P < 0.01）. The Id4 gene expression in liver tissue was down-regulated in abnormal savda syndromeliver cancer group， compared with the control hepatic carcinoma group （P < 0.01）. Compared with the abnormal savda hepatocellular carcinoma group， the expression of Id4 gene in liver tissue was up-regulated all in ASM high， middle and low dosage group， the high and middle dosage groups were obviously up-regulated （P < 0.01）. Compared with the normal group， the liver tissue p21 gene expression was up-regulated in control hepatic carcinoma group （P < 0.01）. The p21 gene expression in liver tissue wasup-regulated in abnormal savda syndromeliver cancer group， compared with the control hepatic carcinoma group （P < 0.05）. Compared with the abnormal savda hepatocellular carcinoma group， the expressions of p21 gene were down-regulated all in ASM high， middle and low dosage group， the middle and low dosages group were dramatic decline （P < 0.01）. Conclusion The ASM could have an impact on mRNA expressions of Id4 and p21 gene in abnormal savda hepatocellular carcinoma rat models.endprint

[Key words] Abnormal savda hepatocellular carcinoma； Abnormal Savda Munziq； Id4； p21

肝癌是危害人類健康的惡性腫瘤，在各類惡性腫瘤的發(fā)病率與死亡率中分別排在第四與第二位，我國肝癌的發(fā)病率和死亡率在全球處于高水平[1]。維吾爾醫(yī)學(xué)是中華傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，具有豐富的臨床實踐和傳統(tǒng)的理論體系，是傳統(tǒng)維醫(yī)藥學(xué)理論的核心。在維吾爾醫(yī)學(xué)臨床治療方劑中，異常黑膽質(zhì)成熟劑經(jīng)常用于治療和預(yù)防異常黑膽質(zhì)型腫瘤、哮喘等疑難性復(fù)雜疾病，但其分子機(jī)制尚未清楚[2]。本研究在前期建立的異常黑膽質(zhì)型肝癌病證動物模型[3-4]的基礎(chǔ)上，通過基因芯片技術(shù)篩選出差異表達(dá)的DNA結(jié)合抑制因子4（inhibitor of DNA binding 4，Id4）和細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitor，p21）等候選基因，通過RT-qPCR法進(jìn)行驗證，對維藥異常黑膽質(zhì)成熟劑的抗肝癌作用進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 動物

選取清潔級雄性90只Wistar大鼠（提供單位：新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心），體質(zhì)量為130～160 g，動物合格證號：65000700000538。

1.2 主要試劑與儀器

小鼠跳臺儀（型號：JXDT-1，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、人工氣候箱（RQH-350型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、電子天平（BS-110型，北京賽多科斯天平有限公司）、光學(xué)顯微鏡（Leica Microsystems，DMI 6000B）、RT-PCR儀（BIO-RAD，MyCyclerTM Thermal Cycler，580BR）、RT-qPCR儀（BIO-RAD，iCyclerTM Thermal Cycler，582BR）、異常黑膽質(zhì)成熟劑（批號：121011，提供單位：疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院）、cDNA合成試劑盒（產(chǎn)品號：#K1622，Thermo Scientific，）、RT-qPCR熒光定量試劑盒（產(chǎn)品號：#RR820A，TAKARA Bio）、二乙基亞硝胺（DEN）（Sigma公司產(chǎn)品）。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物 異常黑膽質(zhì)成熟劑由甘草、黑種草子、蜀葵子、芹菜根、菊苣根、駱駝蓬子、茴芹果、羅勒子、茴香根皮、菊苣子、香青蘭子、香茅和洋甘菊等十幾種天然草藥組成，根據(jù)國家發(fā)明專利《能夠使異常黑膽質(zhì)型體液成熟和清除的藥物及其制備方法》[5]（專利號：ZL02130082.8），用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成膏稠狀之后，60℃真空干燥備用，每克藥粉含3.4 g生藥，使用時用雙蒸水充分溶解使用。

1.3.2 動物分組 選取清潔級雄性Wistar大鼠90只室溫（25±3）℃環(huán)境下穩(wěn)定飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)分成實驗組（60只）和對照組（30只）。實驗組大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為異常黑膽質(zhì)型肝癌病證模型組（異黑肝癌組）和異常黑膽質(zhì)型肝癌病證3個不同劑量異常黑膽質(zhì)成熟劑給藥組（成熟劑高、中和低劑量組），每組各15只。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[3-4]，實驗組通過基礎(chǔ)飼料、芫荽子和大麥以7∶1.5∶1.5的比例混合，制成干寒屬性飼料，把動物置于干寒氣候環(huán)境[溫度（6±1）℃，相對濕度30%，6 h/d]，間斷電刺激大鼠足底（第1周刺激電壓是25 V，每次20 min，1次/d；第2周的刺激電壓是30 V，每次25 min，1次/d；第3周刺激電壓是35 V，每次30 min，1次/d），短暫夾住大鼠尾部尖端1cm處（3～5次/個，1次/d），強(qiáng)迫游泳[每次5 min，1次/d，水溫（25±3）℃]等多種復(fù)合因素作用下21 d建立異常黑膽質(zhì)證載體大鼠模型。隨后每天用滅菌水配制濃度為0.1 mg/mL的DEN溶液，自由飲用直到20周。給予DEN誘導(dǎo)的同時，成熟劑高、中、低劑量組每天對大鼠灌胃成熟劑高、中和低劑量的異常黑膽質(zhì)成熟劑，相當(dāng)于臨床應(yīng)用的等效劑量（6.0、3.0和1.5 g/kg）。并且給實驗組大鼠持續(xù)進(jìn)行異常黑膽質(zhì)證造模多種復(fù)合因素，直到實驗結(jié)束。對照組按隨機(jī)數(shù)字表法分成對照肝癌組和正常對照組（正常組）。正常組大鼠在正常飼養(yǎng)環(huán)境下[室溫（25±3）℃]，用普通飼料飼養(yǎng)，飲食和飲水不受限制，也不受任何刺激。21 d時，對照肝癌組僅把飲用水改為用滅菌水配制的0.1 mg/mL的DEN溶液，自由飲用。20周時處死動物，肝組織-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣品處理 第20周時處死大鼠切出肝臟組織，切成若小塊，用10%的甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.4 基因芯片分析 基因芯片委托北京博奧生物技術(shù)有限公司完成。

1.3.5 RT-PCR 大鼠肝臟利用Trizol法進(jìn)行總RNA抽提，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司北京分公司合成Id4和p21基因引物。GAPDH，F(xiàn)：5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGAGT-3′，R：5′-TGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3′；Id4，F(xiàn)：5′-AA？鄄AGCCACCAGAGGAAAGGAA-3′，R：5′-CATGTAACA？鄄CAACGTCGCCAA-3′；p21，F(xiàn)：5′-CGAGAACGGTGGAACTTTGA-3′，R：5′-GAAATCTGTTAGGCTGGTCTGC-3′。

采用SYBR Green I*嵌合熒光試劑盒進(jìn)行 RT- PCR實驗。反應(yīng)條件：預(yù)變性：95℃ 30 s，1個循環(huán)；擴(kuò)增：95℃ 5 s，TM（Id4：57℃；p21：59.2℃）30 s，72℃ 1 min，40個循環(huán)；溶解曲線：55～95℃ 1個循環(huán)/0.5℃。RT-qPCR結(jié)果以2-ΔΔct法進(jìn)行計算。endprint

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察結(jié)果

除了正常組，實驗后期其余各組動物均因為肝癌出現(xiàn)不同數(shù)量的死亡情況，對照肝癌組死亡率為40%（6/15），異黑肝癌組為40.0%（6/15），成熟劑高劑量組為13.3%（2/15），中劑量組為0%（15/15），低劑量組為26.7%（4/15）。

肝臟大體觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組動物肝組織柔軟，紅潤，表面光滑。對照肝癌組瘤結(jié)節(jié)大小及分散不均，灰白色質(zhì)較軟，突出明顯，與周圍組織界限清楚。異黑肝癌組肝臟高度水腫，瘤結(jié)節(jié)呈球狀嚴(yán)重，大小不均，分散于肝臟各處，瘤結(jié)節(jié)向表面隆起明顯，黃疸較多，肝臟腫大及表面凹凸不平。成熟劑高劑量組和中劑量組動物肝臟表面較為平整，水腫程度有所緩解，少有結(jié)節(jié)；與上述兩個劑量組相比，成熟劑低劑量組動物肝臟瘤結(jié)節(jié)相對較多及大小不均，肝臟水腫程度較明顯，肝組織表面凹凸較明顯。見圖1，封三。

2.2 肝臟病理觀察結(jié)果

正常組大鼠肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完善，清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列規(guī)則，呈索狀，肝細(xì)胞呈多邊形，胞漿均勻，細(xì)胞核形態(tài)正常，無異常變化。對照肝癌組肝細(xì)胞成團(tuán)塊狀或排列成條索狀，細(xì)胞不典型增生明顯，并向周圍正常肝細(xì)胞浸潤生長。異黑肝癌組肝細(xì)胞異型性明顯，胞核增大，胞質(zhì)少，可見較多畸形的單核和多核瘤巨細(xì)胞。成熟劑高、中、低劑量組肝臟部分肝細(xì)胞異常改變，核大，顏色深，癌變程度有所緩解，其中高劑量組與正常組較為接近。見圖2，封三。

2.3 基因芯片結(jié)果

通過MAS系統(tǒng)軟件分析選出差異表達(dá)2倍以上的候選基因，用TreeView軟件制作聚類分析圖。紅色為表達(dá)上調(diào)的基因，綠色為表達(dá)下調(diào)的基因。橫列：不同肝組織標(biāo)本；縱排：差異表達(dá)基因（圖3，封四）。根據(jù)SAM軟件分析所得數(shù)據(jù)，選擇了成熟劑高、中、低劑量組與異黑肝癌組均有差異表達(dá)的候選基因Id4和p21。

2.4 RT-qPCR結(jié)果

與正常組比較，對照肝癌組肝組織Id4基因表達(dá)下調(diào)（P < 0.01）；與對照肝癌組比較，異黑肝癌組肝組織Id4基因表達(dá)下調(diào)（P < 0.01）；與異黑肝癌組比較，成熟劑高、中、低劑量組肝組織Id4基因表達(dá)均上調(diào)，其中成熟劑高、中劑量組差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。與正常組相比，對照肝癌組肝組織p21基因表達(dá)水平上調(diào)（P < 0.01），異黑肝癌組與對照肝癌組相比p21基因表達(dá)水平上調(diào)（P < 0.05），成熟劑高、中、低劑量組與異黑肝癌組相比均下調(diào)表達(dá)，其中成熟劑中、低劑量組差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。

3 討論

本研究通過檢測異常黑膽質(zhì)型肝癌病證大鼠肝組織中差異表達(dá)候選基因Id4、p21的mRNA表達(dá)水平，探討異常黑膽質(zhì)成熟劑對異常黑膽質(zhì)型肝癌大鼠模型中Id4、p21基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，對照肝癌組Id4基因mRNA表達(dá)水平下調(diào)，p21基因mRNA表達(dá)水平上調(diào)（P < 0.01）。Id4是螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix，HLH）轉(zhuǎn)錄因子家族成員[6]，通過與bHLH蛋白形成異二聚體，導(dǎo)致bHLH蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化并抑制其與DNA結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)控，是轉(zhuǎn)錄因子bHLH的負(fù)調(diào)控因子[7]。此外，Id4調(diào)控p53、p21等轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞周期相關(guān)基因[8-9]和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）等細(xì)胞生長因子[10]，參與細(xì)胞周期調(diào)控、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、腫瘤形成以及腫瘤血管形成等過程[11]。因此，Id4基因既可作為抑癌基因，也可作為癌基因，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切而復(fù)雜。有報道稱，由于啟動子甲基化導(dǎo)致表達(dá)沉默、缺失及失活，在淋巴瘤[12]、骨髓增生綜合征[13]、乳腺癌[14]、前列腺癌[15]等若干種人類腫瘤中起抑癌基因的作用。也有報道稱Id4基因在肺癌[16]、肝細(xì)胞癌[17]等腫瘤組織中因促進(jìn)細(xì)胞增殖起促癌基因作用。本實驗結(jié)果顯示，對照肝癌組Id4基因的mRNA表達(dá)水平下調(diào)，因此認(rèn)為Id4基因可能在此動物模型肝組織中起抑癌基因的作用，這與文獻(xiàn)[17]描述的Id4基因功能不一致，但與部分文獻(xiàn)結(jié)果一致[14-15]，可能是因為Id4基因在不同物種或不同腫瘤組織中的表達(dá)有所不同，Id4基因在肝癌中的作用需進(jìn)一步研究。

在細(xì)胞周期G1期過渡到S期過程中，p21能與細(xì)胞周期依賴性激酶結(jié)合并抑制其活性，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與細(xì)胞周期關(guān)系密切[18]。研究者發(fā)現(xiàn)DNA損傷信號是p53、p21基因轉(zhuǎn)錄激活的重要原因之一[19]。通過DNA損傷應(yīng)激活化的細(xì)胞周期檢查點機(jī)制，延遲或阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，損傷無法修復(fù)時則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。臨床研究顯示，p21基因mRNA表達(dá)水平腫瘤患者高于非腫瘤患者，提出p21基因的高表達(dá)可能與肝細(xì)胞肝癌有一定關(guān)系，可為篩檢肝細(xì)胞肝癌高危人群提供參考依據(jù)[21]。因此認(rèn)為本研究中p21基因在肝組織中的表達(dá)上調(diào)與肝癌的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系。本研究組前期的免疫組織化學(xué)結(jié)果也顯示，對照肝癌組及異黑肝癌組p21基因表達(dá)水平顯著高于正常組，與異黑肝癌組相比成熟劑不同劑量給藥組p21基因的表達(dá)均下調(diào)，且提出異常黑膽質(zhì)成熟劑可能通過影響p21基因的表達(dá)起抗肝癌作用的結(jié)論[22]，與本次試驗結(jié)果一致。

維吾爾醫(yī)學(xué)體液論是維吾爾醫(yī)學(xué)認(rèn)識人體結(jié)構(gòu)、生理功能、病理現(xiàn)象以及進(jìn)行診斷和治療的理論基礎(chǔ)。維吾爾醫(yī)學(xué)體液論認(rèn)為異常黑膽質(zhì)證是慢性病理生理狀態(tài)，是腫瘤等疑難復(fù)雜性疾病的共同特點[23]。根據(jù)維醫(yī)臨床治療經(jīng)驗，異常黑膽質(zhì)型腫瘤、哮喘等復(fù)雜性疾病常用異常黑膽質(zhì)成熟劑進(jìn)行治療。在前期異常黑膽質(zhì)型肝癌病證動物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，異常黑膽質(zhì)證能促進(jìn)肝硬化的發(fā)生和發(fā)展，并且在造模20周時，異常黑膽質(zhì)型肝癌病證動物模型組和對照肝癌組大鼠肝臟均發(fā)生癌變，且成癌率前者明顯高于后者[4]；研究還發(fā)現(xiàn)在該動物模型中異常黑膽質(zhì)成熟劑防止肝硬化和肝癌的發(fā)生發(fā)展[24]，但其作用的分子機(jī)制尚不清楚。因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上[3-4，24]建立了異常黑膽質(zhì)型肝癌模型并用基因芯片技術(shù)篩選出肝組織差異表達(dá)的候選基因，用RT-qPCR法進(jìn)行驗證結(jié)果顯示，異常黑膽質(zhì)型肝癌病證大鼠模型肝組織Id4和p21基因表達(dá)水平與對照肝癌組相比存在差異，說明異常黑膽質(zhì)證能促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展，而異常黑膽質(zhì)成熟劑可能通過調(diào)控Id4和p21基因的mRNA表達(dá)水平起抗肝癌作用。endprint

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（收稿日期：2017-07-17 本文編輯：李岳澤）endprint