胡還甫，宋旭日，劉 剛

(岳陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院/洞庭湖特色中藥材綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南岳陽(yáng) 414000)

迷迭香乙酸乙酯萃取物對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用研究

胡還甫，宋旭日*，劉 剛

(岳陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院/洞庭湖特色中藥材綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南岳陽(yáng) 414000)

為研究迷迭香乙酸乙酯萃取物對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用機(jī)制，采用DSS建立大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，各組分別給予低、中、高劑量的迷迭香乙酸乙酯萃取物，連續(xù)給藥2周，檢測(cè)TLR4、TNF-α、MD2、IL-13、IL-8、IL-10水平及結(jié)腸組織病理學(xué)變化。結(jié)果顯示，迷迭香乙酸乙酯萃取物中、高劑量能明顯降低TLR4、TNF-α、MD2、IL-8水平，提升IL-13、IL-10水平(P<0.05)，改善大鼠潰瘍性結(jié)腸模型結(jié)腸病理改變。說(shuō)明迷迭香乙酸乙酯萃取物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎具有明顯的保護(hù)作用。

迷迭香；乙酸乙酯萃取物；潰瘍性結(jié)腸炎

迷迭香(Rosmarinusofficinalis)具有抑菌、抗病毒、抗氧化等作用[1]，現(xiàn)多用于藥品、食用香料、食品加工和化妝品等領(lǐng)域。為驗(yàn)證迷迭香的抗炎抑菌作用，本研究采用硫酸葡聚糖造模致大鼠潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)，檢測(cè)用藥前后相關(guān)抗體和炎性因子的變化，以研究迷迭香乙酸乙酯萃取物對(duì)UC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 迷迭香干品，來(lái)自平江藍(lán)海迷迭香專(zhuān)業(yè)種植合作社;陽(yáng)性對(duì)照藥,柳氮磺吡啶腸溶片,批號(hào)：150102，上海中西三維藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑 硫酸葡聚糖(分子質(zhì)量36 ku～50 ku),美國(guó)MP Biomedicals公司產(chǎn)品；TLR4抗體，上海滬尚生物科技有限公司產(chǎn)品； MD2抗體，上海星科生物科技有限公司產(chǎn)品；TNF-α、IL-13、IL-8、IL-10 ELSIA試劑盒，北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司產(chǎn)品；批號(hào)：20150813。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性大鼠130只，體重245 g～260 g，飼養(yǎng)在湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心屏障環(huán)境，動(dòng)物合格證號(hào)：№4304701649。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2016—0004；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(湘)2016—0006。

1.1.4 儀器 FA2005A型分析天平，上海精天公司產(chǎn)品；Bio-Rad imark型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；UV-Power PC型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京萊伯泰科儀器有限公司產(chǎn)品；BX51型生物顯微鏡，Olympus有限公司產(chǎn)品；RM2245型半自動(dòng)切片機(jī),TP1020型全自動(dòng)脫水機(jī),KD-BM型組織包埋機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 迷迭香乙酸乙酯萃取物 取迷迭香干品，粉碎、過(guò)篩后以950 mL/L乙醇回流提取3次(5、4、3 h)，活性炭脫色后過(guò)濾，得乙醇粗提物。將乙醇提取物用石油醚脫脂后，再用乙酸乙酯進(jìn)行萃取、濃縮，即得到乙酸乙酯萃取物[1]。然后將乙酸乙酯萃取物用950 mL/L乙醇分別配制成0.2、0.4、0.8 g/mL的溶液。陽(yáng)性對(duì)照藥：柳氮磺吡啶腸溶片，研細(xì)，加蒸餾水制成0.054 g/mL的混懸液。

1.2.2 造模與分組 取SPF級(jí)SD雄性大鼠130只，體重245 g～260 g，取20只大鼠作為空白對(duì)照組。其他大鼠采用20 g/L硫酸葡聚糖(DSS)溶液灌胃7 d，再飲用純凈水恢復(fù)7 d，誘導(dǎo)成UC大鼠模型。按體重隨機(jī)分成5組，分別為模型對(duì)照組、柳氮磺吡啶組、迷迭香乙酸乙酯萃取物低、中、高劑量組，每組20只，模型對(duì)照組和空白對(duì)照組給予10 mL/kg純凈水，其余組分別灌胃柳氮磺吡啶腸溶片混懸液10 mL/kg(陽(yáng)性對(duì)照組)、迷迭香乙酸乙酯萃取物2 g/kg(低劑量組)、4 g/kg(中劑量組)、8 g/kg(高劑量組)劑量藥液，連續(xù)灌胃2周，末次給藥后，各組大鼠麻醉采血，備用。

1.2.3 檢測(cè)方法 參考文懷宇等[2]的方法，采用免疫組化染色檢測(cè)血清TLR4，ELSIA分別檢測(cè)血清中TNF-α、MD2、IL-13、IL-8、IL-10的含量。取結(jié)腸組織，對(duì)結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)和病理學(xué)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1[3](HS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn))。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過(guò)SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用單因素方差分析計(jì)量資料，非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析計(jì)數(shù)資料，各組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

表1 結(jié)腸黏膜損傷及組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Colonic mucosa injury and histopathological grading standard

2 結(jié)果

2.1 迷迭香乙酸乙酯萃取物對(duì)大鼠血清TNF-α、IL-13、IL-8、IL-10的影響

如表2，與空白對(duì)照組比較，模型組血清IL-13、IL-10水平明顯降低，IL-8水平升高(P<0.05)。連續(xù)給藥2周后，陽(yáng)性對(duì)照組、迷迭香乙酸乙酯萃取物中、高劑量能明顯升高IL-13、IL-10水平(P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組、迷迭香乙酸乙酯萃取物高劑量組能明顯降低血清TNF-α、IL-8水平(P<0.05)。

2.2 迷迭香乙酸乙酯萃取物對(duì)大鼠血清TLR4、MD2的影響

如表3所示，與空白對(duì)照組比較，模型組血清TLR4、MD2水平顯著升高(P<0.05)。連續(xù)給藥2周后，陽(yáng)性對(duì)照組、迷迭香乙酸乙酯萃取物中、高劑量能明顯降低TLR4水平(P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組、高劑量組能明顯降低MD2水平(P<0.01)。

表2 迷迭香乙酸乙酯萃取物對(duì)大鼠血清TNF-α、IL-13、IL-8、IL-10的影響Table 2 The effects of ethyl acetate extract of the Rosmarinus officinalis on TNF-α，IL-13,IL-8,IL-10 in rat sera

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05;與模型組比較，+P<0.05，++P<0.01。
Note：Compared to the blank control group，*P<0.05;Compared to the model group，+P<0.05，++P<0.01.

表3 迷迭香乙酸乙酯萃取物對(duì)大鼠血清TLR4、MD2的影響Table 3 The effects of ethyl acetate extract of the Rosmarinus officinalis on TLR4，MD2 in rat sera

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05;與模型組比較，+P<0.05，++P<0.01。
Note：Compared to the blnk control group，*P<0.05;Compared to the model group，+P<0.05，++P<0.01.

2.3 迷迭香乙酸乙酯萃取物對(duì)結(jié)腸組織病理評(píng)分的影響

取各組大鼠結(jié)腸切片于顯微鏡下觀察，結(jié)果空白對(duì)照組結(jié)腸表面比較光滑，無(wú)明顯水腫、潰瘍及異型增生(圖1A)；模型組：大鼠結(jié)腸可見(jiàn)明顯充血與水腫，有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)于黏膜層和黏膜下層，腺體結(jié)構(gòu)模糊不清，可見(jiàn)大量潰瘍點(diǎn)及隱窩腫壞死(圖1B)；陽(yáng)性對(duì)照組(圖1C)、迷迭香乙酸乙酯萃取物低劑量組(圖1D)、中劑量組(圖1E)、高劑量組(圖1F)結(jié)腸炎癥逐漸出現(xiàn)不同程度的改善，結(jié)腸黏膜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，高劑量組尤為明顯，潰瘍部分有愈合跡象。各組評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表4，結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照組、迷迭香乙酸乙酯萃取物中、高劑量組能明顯改善大鼠潰瘍性結(jié)腸炎癥。

A.空白對(duì)照組；B.模型組；C.低劑量組；D.中劑量組；E.高劑量組；F.陽(yáng)性對(duì)照組
A.Blank control group；B.Model group；C.Low dose group；D.Middle dose group；E.High dose group；F.Positive control group
圖1大鼠潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸組織病理學(xué)檢查(HE，200×)
Fig.1 The histopathological examination of UC in rats (HE，200×)

表4 迷迭香乙酸乙酯萃取物對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸組織的影響Table 4 The effects of ethyl acetate extract of the Rosemary on UC tissue in rats

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01;與模型組比較，+P<0.05。
Note：Compared to the blank control group，**P<0.01;Compared to the model group，+P<0.05.

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種結(jié)腸黏膜的慢性非特異性炎性疾病，臨床癥狀主要為血性腹瀉，目前其作用機(jī)制尚不完全明確。免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)異常可能是UC發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，主要表現(xiàn)為不能下調(diào)免疫激活所致的促炎細(xì)胞因子增高[4-5]。研究顯示，活檢組織和血清炎性因子水平高低與潰瘍性結(jié)腸炎嚴(yán)重程度、累及范圍及是否復(fù)發(fā)相關(guān)。TLR4、TNF-α、MD2、IL-13、IL-8、IL-10在UC的發(fā)生和病情發(fā)展中起著重要作用，TLR4是誘導(dǎo)內(nèi)毒素/脂多糖(LPS)應(yīng)答最主要的受體，在TLR4和相應(yīng)配體結(jié)合后，可以促使各種炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)的激活[6]。TLR4在MD2的配合參與下,可以介導(dǎo)LPS形成炎性反應(yīng)。TNF-α是一種具多種生物活性的免疫調(diào)節(jié)與促炎癥因子，由活化的單核巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。TNF-α 可在炎癥局部聚集白細(xì)胞，并與炎癥細(xì)胞相互作用，最終導(dǎo)致結(jié)腸黏膜損傷[7]。IL-10 的主要生理功能是抑制促炎性細(xì)胞因子釋放，從而抑制和終止炎癥反應(yīng)，能在調(diào)節(jié)腸道細(xì)胞平衡上起到關(guān)鍵作用。IL-13具有抗炎效應(yīng)的-種多效性的Th2細(xì)胞因子，與整個(gè)機(jī)體免疫功能密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-13在血漿中濃度的改變與病變活動(dòng)性以及UC的嚴(yán)重程度有關(guān)，隨著UC炎性浸潤(rùn)的增加，IL-13的水平逐漸下降[8]。因此，IL-13可減輕腸黏膜的炎性反應(yīng)。IL-8是中性粒細(xì)胞強(qiáng)有力的趨化因子，可聚集并激活中性粒細(xì)胞，使其釋放溶菌酶，并促進(jìn)溶菌酶的活性和吞噬效應(yīng)，造成局部組織病理?yè)p害。上述的生物學(xué)活性與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，在炎癥反應(yīng)中起更直接的介導(dǎo)作用，故IL-8的異常往往導(dǎo)致一些免疫炎性疾病發(fā)生。

本研究顯示，模型組TLR4、TNF-α、MD2、IL-8明顯升高，IL-13、IL-10含量明顯降低，提示它們與UC發(fā)病密切相關(guān)。陽(yáng)性對(duì)照組(柳氮磺吡啶)和迷迭香乙酸乙酯萃取物中、高劑量組能明顯降低大鼠潰瘍性結(jié)腸炎TNF-α、TLR4、MD2、IL-8等炎性因子水平，提升IL-10、IL-13水平。并明顯改善結(jié)腸組織病理狀態(tài)。說(shuō)明迷迭香乙酸乙酯萃取物可能是通過(guò)降低大鼠血清TLR4、MD2、IL-8炎性因子水平，降低炎性介質(zhì)的釋放，增加IL-13、IL-10的表達(dá)，減輕其分泌減少或活性降低而導(dǎo)致的炎性介質(zhì)過(guò)量釋放，間接調(diào)控失衡的細(xì)胞因子，從而減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)受損腸黏膜修復(fù)。

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ProtectiveEffectofEthylAcetateExtractofRosmarinusofficinalisonUlcerativeColitisinRats

HU Huan-fu,SONG Xu-ri,LIU Gang

(KeyLaboratoryofComprehensiveUtilizationCharacteristicChineseHerbalMedicinesofDongtingLake,YueyangVocationalTechnicalCollege,Yueyang,Hunan,414000,China)

To study the protective effect of ethyl acetate extract ofRosmarinusofficinalison the model of ulcerative colitis, the model of ulcerative colitis was established by using DSS.The low,medium and high doses of ethyl acetate extracts ofRosmarinusofficinaliswere continuously administered to rats in each group for two weeks.The serum levels of TNF-α，IL-8 and histopathological lesions of colon were examined.The results showed that medium and high doses of ethyl acetate extracts ofRosmarinusofficinalissignificantly reduced TLR4, TNF-α,MD2,IL-8 levels，and increased IL-13,IL-10 (P<0.05),and decreased the pathological lesions of the colon of ulcerative colitis rat model.It demonstrated that ethyl acetate extract ofRosmarinusofficinalishad a significant protective effect on ulcerative the colitis model.

Rosmarinusofficinalis;ethyl acetate extract；Ulcerative colitis

2017-05-12

湖南省教育廳資助項(xiàng)目(14C1156，16C1637)

胡還甫(1978-)，男，湖北咸寧人，碩士研究生，講師，主要從事中藥學(xué)研究。*

S8523.74

A

1007-5038(2017)10-0069-04