王丹虹，齊華雪，羅開菊，陳平洋

(1?？谑腥嗣襻t(yī)院， ?？?70208；2中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院)

葛根素皮下注射對妊娠期低蛋白飲食孕鼠所產(chǎn)仔鼠體質(zhì)量及骨質(zhì)代謝的影響

王丹虹1，齊華雪2，羅開菊2，陳平洋2

(1?？谑腥嗣襻t(yī)院， 海口570208；2中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院)

目的探討葛根素皮下注射對妊娠期低蛋白飲食孕鼠所產(chǎn)仔鼠生長發(fā)育及骨質(zhì)代謝的影響及其機(jī)制。方法將18只懷孕SD大鼠隨機(jī)分為正常蛋白飼料喂養(yǎng)6只、低蛋白飼料喂養(yǎng)12只。正常蛋白飼料喂養(yǎng)大鼠在孕期、哺乳期均給予21%正常蛋白飼料喂養(yǎng)，將其分娩的仔鼠作為正常組。低蛋白飼料喂養(yǎng)大鼠在孕期給予10%低蛋白飼料喂養(yǎng)至分娩，哺乳期改為21%正常蛋白飼料喂養(yǎng)，將其分娩的仔鼠隨機(jī)分為模型組、葛根素組。葛根素組自出生1周開始，腹部皮下注射葛根素注射液50 mg/(kg·d)；正常組、模型組腹部皮下注射等體積滅菌用水；三組均連續(xù)干預(yù)2周。比較各組出生時(shí)宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)發(fā)生率，出生時(shí)及出生1、3、8周時(shí)體質(zhì)量及血清胰島素樣生長因子1(IGF- 1)、骨保護(hù)素(OPG)、骨鈣素(BGP)、骨堿性磷酸酶(BALP)水平。結(jié)果模型組出生時(shí)及出生1、3、8周時(shí)體質(zhì)量均低于正常組(P均<0.05)；葛根素組出生時(shí)及出生1周時(shí)體質(zhì)量均低于正常組(P均<0.05)，出生3、8周時(shí)體質(zhì)量與正常組比較P均<0.05，出生3、8周時(shí)體質(zhì)量均高于模型組(P均<0.05)。模型組、葛根素組出生時(shí)IUGR發(fā)生率均高于對照組(P均<0.05)。出生1周時(shí)，正常組血清IGF- 1、OPG、BGP、BALP水平均高于模型組及葛根素組(P均<0.05)。出生3周時(shí)，正常組血清IGF- 1、BGP、BALP水平均低于模型組及葛根素組；葛根素組血清IGF- 1、BALP水平均高于模型組；組間比較P均<0.05。出生8周時(shí)，葛根素組血清BGP高于模型組(P<0.01)，BALP低于模型組(P<0.05)。結(jié)論葛根素皮下注射可促進(jìn)妊娠期低蛋白飲食孕鼠所產(chǎn)仔鼠生長發(fā)育；其機(jī)制可能與促進(jìn)骨質(zhì)代謝有關(guān)。

宮內(nèi)發(fā)育遲緩；低蛋白飲食；葛根素；胰島素樣生長因子1；骨保護(hù)素；骨鈣素；骨堿性磷酸酶；大鼠

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，孕期營養(yǎng)不良不僅會導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)[1]，還可能導(dǎo)致成年期代謝紊亂，甚至影響骨質(zhì)代謝，但其確切機(jī)制尚不明確[2]。研究發(fā)現(xiàn)，葛根的提取物葛根素能夠改善去卵巢大鼠及絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松狀況，促進(jìn)骨折愈合[3,4]。2015年1月～2016年7月，我們觀察了葛根素皮下注射對妊娠期低蛋白飲食孕鼠所產(chǎn)仔鼠生長發(fā)育及骨質(zhì)代謝的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康3月齡SD大鼠，雌性18只、雄性9只，體質(zhì)量220～260 g，由湖南省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。葛根素注射液，購自天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司，批號：1103251，規(guī)格：50 mg：2 mL/支。胰島素樣生長因子1(IGF- 1)、骨保護(hù)素(OPG)、骨鈣素(BGP)、骨堿性磷酸酶(BALP)試劑盒均購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。

1.2 大鼠分組處理 所有大鼠分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按照雌雄2∶1的比例置于同一籠中交配，按照文獻(xiàn)[5]方法判定是否受孕。根據(jù)受孕時(shí)間將孕鼠編號，采用隨機(jī)數(shù)字表法將18只孕鼠分為正常蛋白飼料喂養(yǎng)6只、低蛋白飼料喂養(yǎng)12只。正常蛋白飼料喂養(yǎng)雌鼠在孕期、哺乳期均給予21%正常蛋白飼料喂養(yǎng)。低蛋白飼料喂養(yǎng)雌鼠孕期給予10%低蛋白飼料喂養(yǎng)至分娩，哺乳期改為21%正常蛋白飼料喂養(yǎng)[5,6]。孕鼠陰道涂片確定受孕后20～22天分娩，兩組均產(chǎn)仔，未發(fā)生流產(chǎn)現(xiàn)象。18只雌性大鼠中有16只成功受孕，其中正常蛋白飼料喂養(yǎng)6只、低蛋白飼料喂養(yǎng)10只。低蛋白飼料喂養(yǎng)大鼠中1只出現(xiàn)“食幼”現(xiàn)象，剔除實(shí)驗(yàn)。將正常蛋白飼料喂養(yǎng)大鼠分娩的仔鼠作為正常組(69只)，將低蛋白飼料喂養(yǎng)大鼠分娩的仔鼠隨機(jī)分為模型組(41只)、葛根素組(58只)。三組出生24 h內(nèi)分別死亡3、2、3只，組間比較P>0.05。葛根素組自出生1周開始，每日腹部皮下注射葛根素注射液50 mg/(kg·d)；正常組、模型組腹部皮下注射等體積滅菌用水。三組均連續(xù)干預(yù)2周。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察 ①體質(zhì)量：使用Kemdy KD. F電子天平，按照文獻(xiàn)[5]方法每日測量仔鼠體質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)仔鼠出生時(shí)及出生1、3、8周時(shí)體質(zhì)量及出生時(shí)IUGR發(fā)生率。②血清IGF- 1、OPG、BGP、BALP水平：各組分別于出生1、3、8周時(shí)經(jīng)心臟采血，離心后留取上清液，置于-70 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測血清IGF- 1、OPG、BGP、BALP。

2 結(jié)果

2.1 三組體質(zhì)量及IUGR發(fā)生率比較 模型組出生時(shí)及出生1、3、8周時(shí)體質(zhì)量均低于正常組(P均<0.05)；葛根素組出生時(shí)及出生1周時(shí)體質(zhì)量均低于正常組(P均<0.05)，出生3、8周時(shí)體質(zhì)量與正常組比較P均>0.05，出生3、8周時(shí)體質(zhì)量均高于模型組(P均<0.05)，見表1。正常組、模型組、葛根素組出生時(shí)發(fā)生IUGR分別有1、32、49只，IUGR發(fā)生率分別為1.45%、78.05%、84.48%。模型組、葛根素組IUGR發(fā)生率均高于對照組(P均<0.05)。

表1 三組體質(zhì)量比較

注：與正常組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與模型組同時(shí)間比較，△P<0.05。

2.2 三組血清IGF- 1、OPG、BGP、BALP水平比較 出生1周時(shí)，正常組血清IGF- 1、OPG、BGP、BALP水平均高于模型組及葛根素組(P均<0.05)。出生3周時(shí)，正常組血清IGF- 1、BGP、BALP水平均低于模型組及葛根素組；葛根素組血清IGF- 1、BALP水平均高于模型組；組間比較P均<0.05。出生8周時(shí)，葛根素組血清BGP高于模型組(P<0.01)，BALP低于模型組(P<0.05)。其余各組間各時(shí)間點(diǎn)比較P均>0.05。見表2。

表2 三組血清IGF- 1、OPG、BGP、BALP水平比較

注：與同組出生1周比較，*P<0.05；與同組出生3周比較，#P<0.05；與正常組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05；與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，▽P<0.05。

3 討論

胎兒各組織、器官的正常生長發(fā)育依賴于母體蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)的適量攝入，母體孕期各類營養(yǎng)物質(zhì)的攝入及其營養(yǎng)狀況直接影響胎兒的生長發(fā)育。若在孕期母體因蛋白質(zhì)攝入不足，會導(dǎo)致胎兒IUGR，甚至生長發(fā)育受阻，直接影響胎兒的分娩和智力發(fā)育。另有研究證實(shí)，IUGR與成年期心臟病、腦卒中、糖尿病等疾病的發(fā)生關(guān)系密切[2]。IUGR的致病因素較多，目前比較明確的有妊娠期營養(yǎng)不良、胎兒宮內(nèi)感染、多胎妊娠、妊娠期不良生活習(xí)慣、接觸有毒物質(zhì)或射線、環(huán)境污染等[2,6]，其中以妊娠期營養(yǎng)不良最為常見，尤其是蛋白質(zhì)和熱量攝入不足所致IUGR約占IUGR發(fā)病率的50%。本研究結(jié)果顯示，模型組、葛根素組出生時(shí)體質(zhì)量均低于正常組，兩組IUGR發(fā)生率均高于對照組，提示低蛋白飲食是導(dǎo)致IUGR發(fā)生的重要原因。

葛根素為葛根的主要活性成分之一，屬于異黃酮類化合物，化學(xué)名為8- β- D- 葡萄吡喃糖- 4,7- 二羥基異黃酮，分子式為C21H20O9?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，葛根素的主要藥理作用有擴(kuò)張冠狀動脈、抗心肌缺血、降低心肌耗氧量、降血糖、調(diào)節(jié)血脂、改善微循環(huán)、防止骨吸收及促進(jìn)骨骼生長，對腦缺血及缺血再灌注引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷亦具有保護(hù)作用等[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能改善成年人及老年人骨代謝及絕經(jīng)婦女、老年人骨質(zhì)疏松，可促進(jìn)骨折恢復(fù)；促進(jìn)成骨細(xì)胞作用、抑制破骨細(xì)胞作用是其主要作用機(jī)制[8,9]?；A(chǔ)研究顯示，葛根素可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，抑制破骨細(xì)胞作用，通過增加骨形成、減少骨吸收而避免骨量丟失，改善骨密度，可用于防治成年期骨質(zhì)疏松癥[10]。

IGF- 1是一類廣譜促生長因子，與胰島素結(jié)構(gòu)類似，具有促進(jìn)有絲分裂，刺激細(xì)胞生長、增殖及分化等功能，主要影響合成代謝，可提高葡萄糖和氨基酸的攝取率；亦是骨骼中含量最豐富的生長因子[11]，能介導(dǎo)內(nèi)分泌因子調(diào)節(jié)骨骼生長，刺激骨膠原合成與基質(zhì)礦化，促進(jìn)軟骨成熟、骨形成及分化。OPG是由成骨細(xì)胞合成并分泌的，具有抑制破骨細(xì)胞分化成熟的作用，其水平變化先于骨密度，可較早反映骨代謝狀況。有研究認(rèn)為，老年骨質(zhì)疏松癥患者血清OPG水平升高可在一定程度上抑制骨量丟失，維持骨量[12]。BGP是骨骼中含量最豐富的膠原蛋白，在骨形成時(shí)由成骨細(xì)胞合成與分泌的，大部分BGP參與骨基質(zhì)構(gòu)建，僅有一小部分被釋放入血液循環(huán)。在骨吸收過程中骨基質(zhì)被破壞，參與構(gòu)建的BGP釋放入血，故外周血BGP水平能夠反映骨轉(zhuǎn)化情況，是評估骨形成異常的敏感指標(biāo)[13]。BALP亦是由成骨細(xì)胞合成與分泌的，是骨形成的特異性標(biāo)志物，可間接反映成骨細(xì)胞活性。血清BALP水平變化可準(zhǔn)確反映骨改變的早期情況，是評價(jià)骨形成與骨轉(zhuǎn)換的標(biāo)志物之一[14]。

有研究提示，嬰幼兒期低骨密度可能與妊娠期營養(yǎng)不良相關(guān)，可增加其成年期罹患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)，但其發(fā)生機(jī)制尚不清楚[8]。本研究結(jié)果顯示，出生1周時(shí)，正常組血清IGF- 1、OPG、BGP、BALP水平均高于模型組及葛根素組，提示孕期低蛋白飲食導(dǎo)致骨代謝水平降低。出生3周時(shí)，模型組及葛根素組血清IGF- 1、BGP、BALP水平均高于正常組，提示孕期低蛋白飲食孕鼠所產(chǎn)仔鼠在上述指標(biāo)方面存在追趕生長現(xiàn)象。出生3周時(shí)，葛根素組血清IGF- 1、BALP水平均高于模型組，提示骨形成增加，說明葛根素在追趕生長現(xiàn)象中可能具有較好的促進(jìn)作用。追趕生長亦叫補(bǔ)償性生長，用于描述因病理因素導(dǎo)致生長遲緩的兒童在去除這些病理因素后出現(xiàn)的生長加速現(xiàn)象。追趕生長不足會導(dǎo)致兒童身材矮小及認(rèn)知功能發(fā)育落后，但過度追趕生長可能會導(dǎo)致成年期肥胖、高血壓、心腦血管疾病、胰島素抵抗及糖尿病、內(nèi)分泌紊亂及脂代謝異常等不良結(jié)局。有研究報(bào)道，早產(chǎn)兒早期過高的骨轉(zhuǎn)化率可能是導(dǎo)致其成年期代謝性骨病的發(fā)病機(jī)制之一[15]，早產(chǎn)兒及小于胎齡兒其追趕生長趨勢與體內(nèi)IGF- 1水平變化一致[16]。本研究結(jié)果顯示，出生8周葛根素組血清BGP水平高于模型組，血清BALP水平低于模型組，其余各組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示模型組出生8周時(shí)仍在以較高的骨轉(zhuǎn)化率追趕生長，而經(jīng)葛根素干預(yù)后的仔鼠骨轉(zhuǎn)化率較前降低，推測葛根素能在維持其適度追趕生長的同時(shí)改善其成年期骨骼的發(fā)育狀態(tài)。

綜上所述，葛根素皮下注射可促進(jìn)妊娠期低蛋白飲食孕鼠所產(chǎn)仔鼠生長發(fā)育，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)血清IGF- 1、OPG、BGP、BALP水平，改善骨代謝狀態(tài)，繼而使其保持適宜的追趕生長。

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陳平洋(E- mail: wycpyfu@163.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.36.014

R714.43

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1002- 266X(2017)36- 0046- 03

2017- 02- 12)