陳婉璐 張嬋 李琦 程瑜靜 唐慧

云南傣族人群紅細(xì)胞Rh、Duffy血型抗原多態(tài)性調(diào)查*

陳婉璐 張嬋 李琦 程瑜靜 唐慧

目的 調(diào)查云南傣族人群的Rh、Duffy血型系統(tǒng)抗原表現(xiàn)型的分布及抗原頻率，為云南傣族血型分布的多態(tài)性及防治Rh、Duffy血型系統(tǒng)引起的溶血癥提供科學(xué)依據(jù)。 方法 采集云南省境內(nèi)3代內(nèi)無(wú)血緣的傣族人群200例（男女各100例）、漢族對(duì)照組100例（男女各50例）為無(wú)關(guān)人群，采集血樣3 ml（EDTA抗凝），采用微柱凝膠法檢測(cè)Rh、 Duffy及抗體篩選，Duffy血型系統(tǒng)基因分型檢測(cè)采用PCR-SSP法，對(duì)比分析兩人群間的差異。 結(jié)果 200例傣族人群中RhD陽(yáng)性率為98.5%，RhD陰性率為1.5%，100例漢族人群100例（男女各50例）中RhD陽(yáng)性率99.0%，RhD陰性率1.0% 。Duffy基因分型檢測(cè)結(jié)果：傣族200份樣本中，Duffy血型各種表型分布為：Fy（a+b-）表型187例（93.5%），F(xiàn)y（a+b+）表型12例（6.0%），F(xiàn)y（a-b+）表型 1例 （0.5%），未發(fā)現(xiàn) Fy（a-b-）表型?；蝾l率為：Fya（0.965），F(xiàn)yb（0.035）；漢族100份樣本中，Duffy血型各種表型分布為：Fy（a+b-）表型92例（92.0%），F(xiàn)y（a+b+）表型 5例（5.0%），F(xiàn)y（a-b+）表型 3例 （3.0%），未發(fā)現(xiàn) Fy（a-b-）表型。基因頻率為：Fya（0.945），F(xiàn)yb（0.055）。傣族人群抗體篩選陽(yáng)性率為1.5%，均為同種抗體，其中2例E抗體。 結(jié)論 云南傣族人群的Duffy血型系統(tǒng)抗原分布狀況及抗原分布特征與當(dāng)?shù)貪h族人群基本相符，但也有本民族的自身特點(diǎn)，傣族族人群的RhD陰性率和不規(guī)則抗體檢出率比當(dāng)?shù)貪h族人群的不規(guī)則抗體檢出率高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

Rh血型 Duffy血型 抗原分布 基因頻率 云南傣族

云南是我國(guó)少數(shù)民族最多的省份，人口在5 000人以上的民族有26個(gè)，除漢族外的少數(shù)民族有25個(gè)，各民族分布呈大雜居、小聚居的特點(diǎn)。其中，傣族是云南的世居民族，也是世界上人口較多的民族之一；分布在泰國(guó)、老撾、緬甸、越南、柬埔寨、印度、中國(guó)等多個(gè)國(guó)家，總?cè)丝诩s6 600萬(wàn)，中國(guó)境內(nèi)約126萬(wàn)。血型是人類的一種遺傳性狀，具有多態(tài)性和復(fù)雜性的特征。紅細(xì)胞血型系統(tǒng)在臨床輸血醫(yī)學(xué)中具有重要的意義，當(dāng)前，國(guó)際輸血協(xié)會(huì)已確認(rèn)了33 個(gè)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)[1]，而Rh和Duffy血型系統(tǒng)具有重要的臨床意義[2，3]。本研究通過(guò)研究云南省傣族人群的Rh、Duffy血型系統(tǒng)抗原的分布特征，同時(shí)研究其不規(guī)則抗體產(chǎn)生的幾率，將為云南傣族群體稀有血型庫(kù)的建立、溶血病的防治、輸血治療和疾病診斷提供科學(xué)數(shù)據(jù)。同時(shí)，為遺傳學(xué)研究，司法判定和組織移植等工作提供便利，具有一定的科研和臨床指導(dǎo)意義。

對(duì)象與方法

1 研究對(duì)象 選取云南省境內(nèi)3代內(nèi)無(wú)血緣關(guān)系的傣族健康人群200例，其中男性100例，女性100例，18～55歲，平均34歲。采集云南漢族無(wú)關(guān)健康對(duì)照人群100例人，其中男性50例，女性50例，18～55歲，平均28歲。標(biāo)本為靜脈血3 ml，EDTA抗凝。

2 試劑與儀器 全血基因組 DNA 提取試劑盒（大連寶生物公司），Rh-C、c、D、E、e 基因分型卡和全自動(dòng)血型分析儀（江陰力博醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司），抗-Fya、抗-Fyb（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司），Duffy 血型基因 PCR-SSP 分型試劑盒試劑盒（美國(guó) G&T 公司），3種抗-D 試劑（北京金豪、上海血液生物和 BIOSCOT），血清學(xué)離心機(jī)（久保田）、–20℃海爾冰箱：BCD-251WBSV型、4℃海爾冰箱：BCD-251WBSV型、臺(tái)式低速離心機(jī)：TDZ5-WS型、日立高速冷凍離心機(jī)、Sigma960酶標(biāo)儀、 Eppendorf PCR儀、電泳儀、Bio-Rod凝膠成像儀等，所有試劑均在有效期內(nèi)使用 。

3 方法

3.1 鑒定Rh血型分型和抗體篩選：Rh血型鑒定按文獻(xiàn)[4]進(jìn)行，不規(guī)則抗體采用抗人球蛋白檢測(cè)卡法[5]，所有試驗(yàn)均嚴(yán)格按照儀器和試劑使用說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。

3.2 微柱凝膠法檢測(cè) Duffy表型：使用 IgG 型抗-Fya和抗- Fyb，采用間接抗球蛋白法進(jìn)行 Duffy血型表型鑒定，參照試劑說(shuō)明書(shū)操作； 血清學(xué)反應(yīng)強(qiáng)度的評(píng)價(jià)參照文獻(xiàn)[6]。

3.3 Duffy血型系統(tǒng)的基因分型：采用美國(guó) G&T公司Duffy血型基因 PCR-SSP 分型試劑盒。Fya、Fyb和Fy基因擴(kuò)增產(chǎn)物片段均為232 bp 。內(nèi)對(duì)照為人類生長(zhǎng)激素（Human growth hormone，HGH）基因，擴(kuò)增產(chǎn)物429 bp。PCR 擴(kuò)增條件為95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 90 s，共 30 個(gè)循環(huán)； 最后72℃延伸 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 2.0% 瓊脂糖凝膠電泳（10V，30 min）后，在凝膠成像系統(tǒng)下通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)比，觀察是否產(chǎn)生特異性 PCR 產(chǎn)物，從而判斷相應(yīng)基因型，并拍照保存。

4 基因頻率的計(jì)算 按照文獻(xiàn)[7]計(jì)算基因頻率。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 比較漢族與傣族人群的Rh和Duffy血型系統(tǒng)抗原分布差異，用卡方檢驗(yàn)比較表型分布的期望值與觀察值是否符合Hardy-Weinberg平衡法則，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 D抗原的分布200例傣族標(biāo)本檢測(cè)出 Rh（D）陰性 3 例，100例漢族標(biāo)本檢測(cè)出Rh（D） 陰性 1例。傣族人群中Rh陰性率為：1.5%，高于漢族的1%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

2 Rh血型表型分布情況 200例傣族和100例漢族受檢者的Rh表型以CCDee最多，CcDEe其次，見(jiàn)表2；其中200例傣族的抗原分布見(jiàn)表3，傣族和漢族Rh血型表型分布比較見(jiàn)表4。

3 Duffy血型分布情況 傣族2 0 0份樣本中，Duffy血型各種表型分布為：Fy（a+b-）表型187例（93.5%），F(xiàn)y（a+b+）表型12例（6%），F(xiàn)y（a-b+）表型1例（0.5%），未發(fā)現(xiàn)Fy（a-b-）表型?；蝾l率為：Fya（0.965），F(xiàn)yb（0.035），與PCR-SSP方法檢測(cè)結(jié)果一致，見(jiàn)圖1。漢族100份樣本中，Duffy血型各種表型分布為：Fy（a+b-）表型 92例（92%），F(xiàn)y（a+b+）表型5例（5%），F(xiàn)y（a-b+）表型3例（3%），未發(fā)現(xiàn) Fy（a-b-）表型。基因頻率為：Fya（0.945），F(xiàn)yb（0.055），見(jiàn)表3。

表1 D抗原在云南傣族及漢族中的分布

表2 Rh血型表型在云南傣族及漢族中的分布

表3 傣族和漢族Duffy血型結(jié)果

表4 不規(guī)則抗體篩選結(jié)果

4 抗體篩選結(jié)果 傣族200份標(biāo)本中，抗體篩選陽(yáng)性率為1.5%，均為同種抗體，其中2例E抗體，1例為M抗體。漢族100份標(biāo)本中抗體篩選陽(yáng)性率為0%。見(jiàn)表4。

討 論

圖1 Duffy血型基因檢測(cè)分型凝膠成像圖

Rh血型系統(tǒng)與Duffy血型系統(tǒng)類似，都可通過(guò)輸血和妊娠產(chǎn)生免疫性抗體，繼而產(chǎn)生嚴(yán)重的臨床后果[8]；且在種族地域分布上具有很大差異[9]，這兩個(gè)血型系統(tǒng)首先具有抗原多態(tài)性；其次，在不同人群，甚至同一國(guó)家不同地區(qū)，等位基因頻率也存在差異。因此，對(duì)某地區(qū)聚居的少數(shù)民族相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行研究，對(duì)該地區(qū)臨床輸血、疾病診斷治療具有重要意義[10]。根據(jù)目前的臨床輸血技術(shù)規(guī)范所進(jìn)行的同型輸血僅是 ABO 和 Rh（D）同型，因此，受血者輸入自身紅細(xì)胞沒(méi)有的抗原可能會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，從而導(dǎo)致再次輸血時(shí)配血不合。目前的應(yīng)對(duì)方法多為在輸血前進(jìn)行抗體篩查試驗(yàn)，可以有效減少抗體篩查陽(yáng)性患者因輸入含相應(yīng)抗原紅細(xì)胞而引起的溶血性輸血反應(yīng)，以保證輸血安全[11]。孕婦妊娠由于胎兒的抗原與母親不合，也可以通過(guò)輸血或胎兒出血的方式免疫母體，產(chǎn)生相應(yīng)的同種抗體，引起新生兒溶血病[12，13]。

本次研究結(jié)果表明，當(dāng)?shù)卮鲎迦巳篟hD陰性血型分布與漢族存在差異，與其他文獻(xiàn)中相關(guān)數(shù)據(jù)差異的原因符合受種族地域分布影響所致[14，15]。傣族和漢族受檢者的Rh表型為CCDee＞CcDEe＞CcDee＞ccDEE＞ccDEe＞CCDEe＞CcDEE。當(dāng)?shù)卮鲎搴蜐h族Duffy血型系統(tǒng)基因頻率：傣族Fya：0.965，F(xiàn)yb：0.035，漢族Fya：0.945，F(xiàn)yb：0.055，與國(guó)內(nèi)其他人群[1]：西藏藏族Fya：0.9218，F(xiàn)yb：0.0782；江蘇漢族Fya：0.9400，F(xiàn)yb：0.0600；洛陽(yáng)漢族Fya：0.9527，F(xiàn)yb：0.0473；浙江漢族Fya：0.9412，F(xiàn)yb：0.0588；上海漢族Fya：0.9649，F(xiàn)yb：0.0351的分布基本相似。而傣族人群在抗篩陽(yáng)性率上比漢族人群要高，輸血前有必要進(jìn)行抗體篩選以確保輸血安全。研究血型系統(tǒng)抗原表型分布，掌握血型抗原的基因分型，為無(wú)償獻(xiàn)血工作、為該民族群體稀有血型庫(kù)的建立、組織配型和免疫性輸血反應(yīng)的預(yù)防提供科學(xué)數(shù)據(jù)[16]，確保輸血安全，也為遺傳學(xué)研究、血緣判定提供便利。

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Objective To investigate the distribution and antigen frequencies of Rh and Duffy blood group antigens in Dai nationality in Yunnan，so as to provide an evidence for the prevention and treatment of blood type-associated hemolytic diseases. Methods Two hundred cases （100 male and 100 females） of Dai people without consanguinity were collected and 100 Han people were taken as control. Blood samples （5 ml，EDTA anticoagulants） were detected for Rh，Duffy and antibody screening. Duffy blood group genotyping was performed using PCR-SSP. Results The RhD positive rate was 98.5% and the negative rate was1.5% in 200 Dai persons compared with the positive rate of 99.0% and negative rate of 1.0% in Han population. Duffy genotyping revealed the distribution of phenotypes of Fy（a+b-）（187/200，93.5%），F(xiàn)y（a+b+）（12/200，6.0% ），and Fy（a-b+）（1/200，0.5% ），no Fy（a-b-）phenotype was seen，and the genetic frequencies were found to be Fya（0.965） and Fyb（0.035）. In Han population，Duffy phenotypes include Fy（a+b-）（92/100，92.0% ），F(xiàn)y（a+b+）（5/100，5.0% ），and Fy（a-b+）（3/100，3.0% ），no Fy（a-b-）phenotype was noted，and the genetic frequencies are Fya（0.945） and Fyb（0.055）. The Dai population presented the prevalence of positive antibodies of 1.5%，among them 2 cases showed E antibodies. Duffy genotyping results showed that，in the 200 samples of Dai nationality，the gene frequency was Fya（0.965），and Fyb（0.035）. The frequency of the gene was Fya（0.945）and Fyb（0.055） in 100 samples of Han nationality. Conclusion The antigen distribution of Duffy blood group system in Dai nationality is similar to those in Han population although the negative RhD and irregular antibodies are slightly higher in Dai people（P＜0.05）.

Rh Duffy blood group Antigen distribution Gene frequency Dai nationality in Yunnan

R457.1+1 R392.13

A

1671-2587（2017）05-0487-04

Polymorphism of Rh and Duffy Bl ood Group Antigens in Erythrocytes of Dai Population in Yunnan CHEN Wanlu，ZHANG Chan，Li Qi，et al. Department of Blood Transfusion，the First Hospital of Yunnan Province，Affiliated Hospital of Kunming University of Science and Technology，Kunming Yunnan 650032

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.05.023

*本課題受2016年度云南省教育廳科學(xué)研究基金（No.2016ZDX017），云南省教育廳理工類重點(diǎn)項(xiàng)目基金（No.2014Z038）資助

650032 昆明，云南省第一人民醫(yī)院、昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院輸血科（陳婉璐，張嬋，李琦，程瑜靜）；云南省第一人民醫(yī)院、昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所（唐慧）

陳婉璐（1982–），女，云南昆明人，主管技師，在讀碩士研究生，主要從事臨床輸血檢驗(yàn)，（Tel）13608803742（E-mail） 282210895@qq.com。

唐慧，（E-mail） htang1122@aliyun.com。

2017-02-16）

（本文編輯：潘健）