宋繼英 李爽 劉丹秋 王福義 王岑 鄧金貴 黎明新

MIT3、抗gp210和抗sp100聯(lián)檢在原發(fā)性膽汁性肝硬化診斷中的價值

宋繼英 李爽 劉丹秋 王福義 王岑 鄧金貴 黎明新

目的 比較新型研發(fā)的PBC篩查試劑盒與單個MIT3，以及2個抗核抗體（ANA）gp210和sp100 ELISA 檢測試劑盒在中國人群中PBC診斷的性能。方法 使用PBC screen ELISA篩查試劑盒和單獨針對MIT3、gp210和sp100抗原的ELISA試劑盒，對95例確診PBC患者、125例非PBC患者（自身免疫性肝炎/原發(fā)性硬化性膽管炎18例，病毒性肝炎32例，其他肝臟疾病 21例），以及健康人54例的血清樣本進行檢測。結(jié)果 PBC Screen ELISA 法檢測敏感性為76.8%，特異性為95.2%。特異性與結(jié)合單獨ELISA 法檢測MIT3、gp210和sp100抗體的特異性96.0%相當(dāng)。在32例用間接免疫熒光（indirectimmunofluorescence，IIF）檢測為陰性的PBC患者中，有15（46.9%）例PBC Screen ELISA 檢測結(jié)果為陽性。結(jié)論 PBCScreen ELISA是理想的一線PBC篩查試劑，尤其對于IIF篩查為陰性的PBC患者展現(xiàn)出優(yōu)良的評估性能。

原發(fā)性膽汁性肝硬化 自身免疫性肝炎 原發(fā)性硬化性膽管炎 抗GP210 抗SP100

原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）是以肝內(nèi)膽小管破壞為特征的慢性膽汁淤積性自身免疫性疾病[1]，其血清學(xué)標(biāo)志抗體是抗線粒體抗體（AMA）[2]。此外，抗核抗體（ANA）gp210和sp100約存在于25% 的PBC患者中[3]。本研究采用一種新型的能聯(lián)合檢測MIT3、gp210和sp100抗體的PBC試劑盒對PBC和非PBC患者血清進行檢測，同時用單獨的MIT3、gp210和sp100抗體檢測試劑盒測試，比較聯(lián)合檢測和單獨檢測的相關(guān)性，及其對PBC診斷的價值。

材料與方法

1 材料 回顧性分析2013年6月～2015年9月在沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院住院及門診擬診或待排除PBC患者資料220份，依據(jù)國際公認(rèn)的美國肝病學(xué)會（American Association for the Study of Liver Diseases，AASLD）2000年制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)作為PBC確診標(biāo)準(zhǔn)[1]：①堿性磷酸酶（ALP）等反映膽汁淤積的生化指標(biāo)升高；②血清AMA或AMA-M2陽性（滴度＞1∶40）；③AMA-M2陰性，肝組織病理學(xué)診斷有非化膿性膽管炎和中小膽管破壞。同時排除病毒性肝炎、酒精性及藥物性肝損傷。220例患者最后確認(rèn)為PBC95例，其余125例為非PBC患者。

2 方法

2.1 PBC 篩查：采用Quanta Lite PBC Screen IgG/IgA ELISA（INOVA Diagnostics）定量檢測血清樣本中針對MIT3、gp210和Sp100的IgG/IgA自身抗體。具體步驟：將100 μl 1∶100稀釋的血清加到包被有親和純化的PDC-E2、BCOADC-E2、OGDC-E2抗原，以及針對sp100和gp210免疫顯性表位的合成多肽混合物的ELISA板孔中，室溫反應(yīng)30 min。清洗3遍，每孔加100 μl過氧化物酶耦聯(lián)的山羊抗人免疫球蛋白IgG/IgA，室溫孵育30 min。清洗3遍后，每孔加100 μl 3，30，5，50-四甲基聯(lián)苯銨，室溫反應(yīng)30 min，加100 μl、0.344 mol/L H2SO4終止液終止反應(yīng)。于 450/620 nm處讀取結(jié)果。試劑盒操作手冊中推薦的cutoff值為25 U。陽性結(jié)果提示在PBC Screen中，血清樣本中至少有1種針對靶抗原的抗體。陰性結(jié)果提示血清樣本中沒有針對MIT3、gp210和sp100的抗體或相應(yīng)抗體的水平低于cut off值。

2.2 單獨的 MIT3、gp210和sp100特異性ELISA檢測：為評估單獨的MIT3、gp2 1 0和sp1 0 0 ELISA檢測結(jié)果和PBC Screen檢測結(jié)果的一致性，PBC患者和對照組的血樣同時分別用M2 EP（MIT3）、gp210和sp100 IgG Quanta Lite?ELISA（INOVA Diagnostics）試劑盒進行測試。按照操作指南嚴(yán)格執(zhí)行。單獨ELISA 檢測的實驗操作步驟和PBC Screen一致，但二抗使用的是過氧化物酶耦聯(lián)的山羊抗人免疫球蛋白IgG。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 分別計算PBC Screen ELISA 篩查以及抗MIT3、抗SP100和抗gp210診斷PBC的敏感度、特異度。應(yīng)用SPSS 13.0軟件分析PBC Screen ELISA篩查和單項ELISA檢測及間接免疫熒光（IIF）之間的Kappa值。計數(shù)資料用百分比表示；計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般資料 共檢測220例血清標(biāo)本，其中95例來自確診PBC患者，125例來自非PBC患者，包括自身免疫性肝炎/原發(fā)性硬化性膽管炎18例、病毒性肝炎32例，其他肝臟疾病21例以及健康人54例。PBC患者男女比例為1∶6.1（31/189），平均年齡（50.2±13.1）歲。自身免疫性肝炎16例，其中6例原發(fā)性膽汁性肝硬化合并自身免疫性肝炎；原發(fā)性硬化性膽管炎2例；病毒性肝炎中包括25例乙型病毒性肝炎和7例丙型病毒性肝炎；其他肝臟疾病包括5例酒精性肝病、9例病源不明的肝臟疾病、7例藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的肝病。

2 PBC Screen ELISA診斷PBC的敏感性和特異性分析 根據(jù)試劑盒操作手冊中推薦的cut off值，PBC Screen ELISA檢測PBC患者的敏感性為76.8%，特異性為95.2%。95例PBS患者中，采用IIF法檢測出AMA抗體陽性63例，檢測敏感性為66.3%。用PBC Screen ELISA分別篩查IIF為陽性和陰性的PBC患者樣本，陽性率分別為93.6% 和46.9%。在診斷為PBC合并AIH的6例患者樣本中，5例用PBC Screen ELISA檢測后結(jié)果為陽性。在分別診斷為AIH/PSC（18）、病毒性肝炎（32）、其他肝?。?1），以及健康對照（54），用PBC Screen ELISA篩查結(jié)果為陽性的比例分別為：1/18（5.5%），2/32（6.25%），1/21（4.7%），1/30（3.3%），1/54（1.8%）。健康對照組的PBC Screen ELISA 檢測平均值為4.4 U；在非PBC對照疾病組和健康對照組中，PBC Screen ELISA 檢測結(jié)果為陽性的6例中，只有2例（1例乙肝患者，1例AIH患者）檢測結(jié)果的值超過100 U。

3 PBC患者中針對單個MIT3、gp210 和sp100檢測的ELISA結(jié)果 95例PBC患者血清中，有69 例血清（72.6%）MIT3檢測陽性，16例（16.8%）gp210和14例（14.7%）sp100檢測陽性。另外，有6例血清（6.3%）MIT3和gp210檢測雙陽性，5例血清（5.3%）MIT3和sp100檢測雙陽性，3例血清（3.2%）sp100和gp210檢測雙陽性，4例血清（4.2%）MIT3、sp100和 gp210檢測均為陽性。單獨ELISA檢測敏感性為81.1% （表1）。

4 PBC Screen ELISA試劑盒在IIF檢測結(jié)果為陰性的PBC患者中的優(yōu)勢 95例PBC患者中，有32例IIF檢測結(jié)果為陰性。若用IIF法作為PBC診斷標(biāo)準(zhǔn)，這32例PBC患者會被漏檢。用PBC Screen ELISA 試劑盒檢測這32例IIF結(jié)果陰性的PBC患者血清，結(jié)果顯示15例（46.9%）陽性。若單獨用MIT3、gp210 和sp100ELISA試劑盒檢測這32例樣本，有16例（50%）血樣至少有1個檢測指標(biāo)為陽性。其中13例血樣（81.25%）MIT3陽性，5例（31.25%） gp210和5 例（31.25%） sp100陽性。另外，有2例血清（12.5%）MIT3和gp210為雙陽性，2例血清（12.5%）MIT3和 sp100雙陽性，1 例血清（6.25%）sp100和 gp210雙陽性，1例血清（6.25%）MIT3、sp100和 gp210檢測結(jié)果均為陽性。

表1 PBC Screen在cut off值為25.0時的診斷特點

在6 3例I I F檢測結(jié)果為陽性的P B C患者中，PBC Screen的陽性率為93.7%，用3種抗原單獨ELISA檢測，陽性率為96.8%。有56例（88.9%）MIT3陽性，11例（17.5%）gp210和9例（14.3%） sp100陽性。另外，有4例（6.3%）MIT3和 gp210雙陽性，3例（4.8%）MIT3和sp100雙陽性，2例（3.2%）sp100和gp210雙陽性，3例（4.8%）MIT3、sp100和gp210檢測結(jié)果均為陽性（圖1）。

圖1 PBC樣本中特異性抗體的檢測

5 PBC Screen ELISA檢測和單個ELISA及IIF檢中，PBC Screen 檢測敏感性比單獨用MIT3 IgG ELISA檢測敏感性要高，分別是46.9% 比40.6%（P＜0.05）。對IIF檢測為陽性的PBC患者，PBC Screen 的敏感性和單獨用MIT3 IgG ELISA檢測相比分別是93.7%和88.9%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。測結(jié)果一致性的比較 所有PBC患者和對照組血樣均進行單個ELISA檢測。所有PBC血樣均做IIF檢測。IIF檢測PBC的敏感性和特異性分別為66.3%和93.9%，PBC Screen檢測敏感性為76.8%，明顯高于IIF（P＜0.01），特異性的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在32例IIF檢測AMA結(jié)果陰性的PBC患者中，有15例PBC Screen ELISA篩查AMA結(jié)果為陽性。3 例PBC患者經(jīng)IIF檢測為陽性，但PBC Screen檢測為陰性。比較PBC Screen 和IIF檢測的一致性，Kappa值為0.562。見表2。

比較PBC Screen和單獨ELISA檢測的一致性為96.8%，Kappa值為0.903。95例PBC患者中，3例PBC Screen和單獨ELISA檢測結(jié)果不一致。3例單獨ELISA檢測為陽性，但PBC Screen檢測為陰性。

對于IIF檢測AMA 結(jié)果為陰性的PBC患者，PBC Screen和單獨ELISA相結(jié)合的檢測結(jié)果比較，敏感性分別為46.9%和50.0%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。IIF檢測AMA為陰性的PBC患者

表2 PBC Screen，結(jié)合的單項ELISA 測試及IIF檢測符合率比較

討 論

原發(fā)性膽汁性肝硬化是以肝內(nèi)膽小管破壞為特征的慢性膽汁淤積性自身免疫性疾病。進展性膽管破壞會導(dǎo)致肝臟功能性缺失逐漸加重，且隨時間的推移可能會導(dǎo)致肝臟功能不全，嚴(yán)重時甚至需要肝臟移植。PBC的血清學(xué)標(biāo)志是抗線粒體抗體，并且在高達(dá)90%～95%的PBC患者中可檢測到[2]。針對抗線粒體抗體的主要自身抗原為丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的E2亞單位（PDC-E2）、支鏈2-氧酸脫氫酶復(fù)合物（BCOADC-E2）和2-氧-戊二酸脫氫酶復(fù)合體（OGDC-E2）。Gershwin和Leung發(fā)現(xiàn)并且申請專利保護了一種重組抗原（MIT-3），后者包含上述3種亞單位的免疫決定性抗原決定簇[3]。除抗線粒體抗體（AMA）外，來源于PBC患者血清中約有50%～72%包含有抗核抗體（ANA）。與PBC特異性相關(guān)的2種抗核抗體模式是以核周膜蛋白gp210為特征的加強核周/核膜染色模式及以核小體相關(guān)sp100為特征的多核（MND）模式[4，5]?？筭p-210抗體和抗sp100抗體約存在于25%的PBC患者中，且具有高度特異性。此外，這些抗體也存在于10%～50%抗線粒體抗體陰性的PBC患者中，是僅能檢測到的特異性抗體[6]。PBC的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，但由于其臨床癥狀和其他慢性肝病相似，易造成誤診和漏診。因此發(fā)現(xiàn)對PBC有特異性診斷價值的血清學(xué)檢測標(biāo)志物和標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法成為國內(nèi)外研究重點。現(xiàn)階段對線粒體抗體（M2）的檢測研究較多，但是對更加靈敏的專利抗原MIT3及另外2個血清標(biāo)記物聯(lián)合檢測的研究還較少[7-14]。

表3 PBC Screen，結(jié)合的單項ELISA 測試及MIT3 ELISA 敏感性和特異性比較

2010年由意大利IRCC的自身免疫肝病中心主導(dǎo)了一個全球性多中心研究，通過對1 175例PBC患者和1 232例對照組樣本用一種新型的能聯(lián)合檢測MIT3、gp210和sp100抗體的PBC試劑盒檢測，且同時用單獨MIT3、gp210和sp100抗體檢測試劑盒測試，比較聯(lián)合檢測和單獨檢測的相關(guān)性，結(jié)果[15]證明聯(lián)合檢測篩查試劑盒的靈敏度更高，可作為PBC實驗室檢測的常規(guī)一線篩查試劑。

國內(nèi)對PBC的相關(guān)研究多集中在臨床病例分析上，對特異性檢測指標(biāo)的研究較少。對中國PBC患者人群的血清學(xué)指標(biāo)診斷價值的研究非常有必要，將為臨床PBC診斷提供更高靈敏度和特異性的指標(biāo)。本研究中的新型PBC檢測試劑盒與以往PBC ELISA檢測試劑盒的不同之處在于，除檢測3個主要的線粒體抗原表位外，還可以同時檢測針對抗核抗體的2個蛋白GP210和SP100；且檢測的血清型除IgG還包含IgA。

雖然PBC篩查試劑盒檢測的是針對抗線粒體多個抗原的抗體混合物，其在檢測結(jié)果的可靠性上與單個檢測ELISA試劑盒相比毫不遜色。尤其是用于IIF法檢測抗AMA 陰性PBC確診患者時表現(xiàn)突出。PBC篩查試劑盒的高敏感性降低了沒有血清學(xué)證據(jù)的PBC患者的數(shù)目。除檢測IgG型MIT3、gp210和sp100，還可檢測IgA型，IgA型AMA在PBC診斷中具有特殊的病理作用。因為血清IgA是粘膜免疫系統(tǒng)中主要的免疫球蛋白，在膽汁中也是主要的蛋白[16，17]。雖然IgA的出現(xiàn)不如IgG頻繁，但有些情況下，IgA型抗體是PBC患者中唯一出現(xiàn)的血清類型且保持著較高的濃度。在PBC的臨床早期階段，往往可以觀測到IgA型AMA[18，19]。PBC篩查試劑盒的特異性并未因檢測多種抗原而降低。在125例對照組樣本中，有3例PBC 篩查陽性結(jié)果來自AIH樣本，其中1例PBC篩查為強陽性。臨床資料顯示，AIH患者中血清學(xué)AMA陽性但無PBC臨床癥狀的情況約占5%～34%。本研究中的比例是18.8% （3/16）。

迄今為止尚無PBC診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。本評估結(jié)果顯示，PBC篩查結(jié)果與單個ELISA檢測相比，具有相同的敏感性和特異性。PBC 篩查試劑盒的優(yōu)勢在于可以把臨床上IIF法漏檢的AMA陰性PBC患者重新檢出來，并提供明確的血清學(xué)證據(jù)，從而加速PBC的診斷和治療。與傳統(tǒng)IIF相比，PBC篩查法快速、簡單、客觀，對評估人員的檢測經(jīng)驗沒有過高的要求。當(dāng)IIF法檢測PBC患者結(jié)果是陽性時，可以更好地確認(rèn)PBC相關(guān)核型。但若結(jié)果是陰性，不易判斷這是由于IIF的敏感度低還是血清中的確不存在PBC特異性抗體造成的。而PBC ELISA篩查后陽性結(jié)果，則可以用單項ELISA做進一步確認(rèn)。單項特異性ELISA檢測對于臨床意義的判斷也越來越重要，如gp210抗體陽性PBC患者可能患有嚴(yán)重的肝病和較差的預(yù)后。

我們的結(jié)果顯示可以把PBC ELISA篩查試劑盒做為PBC診斷的一線篩查試劑。由于操作半自動化和判讀客觀，也可以用于臨床實驗室的常規(guī)檢測。對于PBC診斷，尤其是用IIF陰性樣本，PBC 篩查試劑盒展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。聯(lián)合檢測PBC的特異性標(biāo)志物抗MIT3、gp210和sp100抗體，將為疑似原發(fā)性膽汁性肝硬化患者提供一種非常有效的檢測工具。

1 Heathcote EJ. Management of primary biliary cirrhosis.The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines[J]. Hepatology，2000，31（4）：1005-1013.

2 Kaplan MM，Gershwin ME. Primary biliary cirrhosis[J]. N Engl J Med，2005，353（12）：1261-1273.

3 Moteki S，Leung PS，Coppel RL，et al. Use ofa designer triple expression hybrid clone for three different lipoyl domain for thedetection of antimitochondrial autoantibodies[J]. Hepatology，1996，24（1）：97-103.

4 Courvalin JC，Lassoued K，Bartnik E，et al. The 210-kD nuclear envelope polypeptide recognized by human autoantibodies inprimary biliary cirrhosis is the major glycoprotein of the nuclear pore[J]. J ClinInvest，1990，86（1）：279-85.

5 Szostecki C，Guldner HH，Netter HJ，et al. Isolation and characterization ofcDNA encoding a human nuclear antigen predominantly recognized byautoantibodies from patients with primary biliary cirrhosis[J]. J Immunol，1990，145（12）：4338-4347.

6 Miyakawa H，Tanaka A，Kikuchi K，et al. Detection of antimiochondrial autoantibodies in immunofluorescent AMA-negative patients with primary biliary cirrhosis using recombinant autoantibodies autoantigens[J]. Hepatology，2001，34（2）：243-248.

7 金燕，郭婧婧.自身抗體在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的應(yīng)用分析[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2005，15（1）：76-80.

8 張?？Z繼東，錢林學(xué)，等. 抗線粒體抗體陰性原發(fā)性膽汁性肝硬化的臨床特征[J]. 肝臟，2002，7（3）：150-152.

9 M arvin J，F(xiàn)ritzler，M ichael P，et al. Anti-mitochond rial autoantibod ies [J]. C lin App lied Imm unol Rev，2002，3（3）：87-113.

10 姚定康，謝渭芬，陳偉忠，等．抗線粒體抗體及其分型對原發(fā)性膽汁性肝硬化的診斷價值［J］．中華肝臟病雜志，2005，13（1）：9-11.

11 Lindor KD，Gershwin ME，Poupon R，et al．American Association for Study of Liver Diseases［J］.Primary biliary cirrhosis[J]. Hepatology，2009，50（1）：291-308.

12 Weijia D，Xiao Juan O，Qian Yi W. Diagnostic relevance andclinical significance of MIT3，antigp210 and anti-sp100 in Chinesepatients with PBC[J].APASL 2013.

13 李卓敏，趙丹彤.原發(fā)性膽汁性肝硬化所致肝癌患者自身抗體特征分析[J].中國實驗診斷學(xué)，2014，18（1）：59-61.

14 肖瓊怡，郭致平.原發(fā)性膽汁性肝硬化臨床特點分析[J].中國實用醫(yī)藥，2014，2（2）：83-84.

15 Haiying L，Gary LM. PBC Screen：an IgG/IgA dual isotypeELISA detecting multiple mitochondrial and nuclear autoantibodiesspecific for primary biliary cirrhosis[J]. Journal of Autoimmunity，2010，35（4）：436-442.

1 6 Nis h io A，Va n d e Wa te r J，Le u n g PS，e t al.Comparative studies of antimitochondrial autoantibodies in sera and bile inprimary biliary cirrhosis[J]. Hepatology，1997，25（5）：1085-1089

17 Malmborg AC，Shultz DB，Luton F，et al.Penetration and co-localization in MDCK cell mitochondria of IgA derivedfrom patients with primary biliary cirrhosis[J].J Autoimmun 1998，11（5）：573-580.

18 Gabeta S，Norman GL，Liaskos C，et al.Diagnostic relevance and clinical significance of the new enhanced performanceM2（MIT3） ELISA for the detection of IgA and IgG antimitochondrial antibodies inprimary biliary cirrhosis[J]. J Clin Immunol，2007，27（4）：378-387.

19 Nakajima M，Shimizu H，Miyazaki A，et al.Detectionof IgA，IgM，and IgG subclasses of anti-M2 antibody by immunoblotting inautoimmune cholangitis：is autoimmune cholangitis an early stage of primarybiliary cirrhosis?[J]. J Gastroenterol，1999，34（5）：607-612.

Ob jective To Detect antibodies against mitochondrial and nuclear antigens for diagnosis of primary biliary cirrhosis （PBC） and to compare the performance of the PBC Screen to the combined performance obtained with individual IgG ELISAs to MIT3，gp210，and sp100 in the patients with PBC. Methods The PBC Screen and individual antibodies to MIT3，anti-gp210，and anti-sp100 were measured in sera of 220 individuals. Final diagnosis of PBC had been made in 95 of the participants and the rest included individuals with autoimmune hepatitis （AIH）/ primary sclerosing cholangitis （18 cases），viral hepatitis（32 cases），or other liver diseases （21 cases），and healthy controls（54 persons）. Results The PBC Screen at the cutoff of 25 units had an overall sensitivity of 76.8%，specificity of 95.2%，similar to the specificity of 96.0% obtained by the combined results of individual MIT3，sp100，and gp210 IgG ELISAs.Of the 32 PBC patients without AMA detected by indirect immunofluorescence（IIF），15（46.9%） were positive for PBC-specific autoantibodies. Conclusions The PBC Screen is an ideal first-line test for the diagnosis of PBC，especially for those who showed negative IIF.

Primary biliary cirrhosis Autoimmune hepatitis Primary sclerosing cholangitis Anti-GP210 Anti-SP100

R657.3+1 R446.11

A

1671-2587（2017）05-0470-05

The Value of a Combination Detection of Anti-MIT3，Anti-gp210 and Anti-sp100 in the Diagnosis of Primary

Biliary Cirrhosis SONG Ji-Ying，LI Shuang，LIU Dan-qiu，et al.Affiliated centeral Hospital of Sheng yang medical university 110024

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.05.019

110024 遼寧省沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院

宋繼英（1980–），女，遼寧沈陽人，主管檢驗師，碩士，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗工作，（Tel）13840329908（E-mail）songjiying226@sohu.com。

黎明新，男，主任檢驗師，碩士，（Tel）18002477229（E-mail）lmx1124@sina.com。

2017-02-02）

（本文編輯：潘?。?/p>