彭蓉蓉 孔曉明 周翔

肺炎克雷伯菌形成生物膜菌株的基因型檢測(cè)及其耐藥探析*

彭蓉蓉 孔曉明 周翔

目的 探究肺炎克雷伯菌在醫(yī)院中的分布狀況及耐藥性，并且分析生物膜陽(yáng)性肺炎克雷伯菌的基因型，為臨床合理用藥提供依據(jù)。方法 選擇本院2013年8月～2015年8月臨床送檢的感染性標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)分離，檢出160株肺炎克雷伯菌，分析該菌在醫(yī)院的分布情況、耐藥性及其基因型。 結(jié)果 所有肺炎克雷伯菌標(biāo)本中呼吸道標(biāo)本及尿液標(biāo)本所占比重最大，分別占59.38%和22.88%；重癥監(jiān)護(hù)病房檢出數(shù)所占比重最高（40.63%），其次為呼吸內(nèi)科的16.25%及神經(jīng)內(nèi)科的14.38%。肺炎克雷伯菌對(duì)氨芐西林的耐藥率占首位，為80.00%；其次為頭孢唑啉（67.50%）；第三為頭孢曲松（65.00%）。氨芐西林/舒巴坦、復(fù)方新諾明和頭孢噻肟（三代）的耐藥率在50%以上。耐藥率最低者為厄他培南，其次為亞胺培南。所有160株肺炎克雷伯菌中生物膜陽(yáng)性比例為37.50%。檢出ESBLs的16株生物膜肺炎克雷伯菌中，擴(kuò)增出TEM基因和SHV基因所占比例分別為41.75%和31.25%，同時(shí)存在SHV及TEM基因所占比例為12.50%，但均未檢測(cè)出CTX2M。結(jié)論 重癥監(jiān)護(hù)病房發(fā)生肺炎克雷伯菌感染的比重較高，細(xì)菌耐藥性相對(duì)較低，而SHV及TEM為產(chǎn)生生物膜肺炎克雷伯菌的主要基因分型。

肺炎克雷伯菌 生物膜 基因型 耐藥性

肺炎克雷伯菌是腸桿菌克雷伯氏菌屬中的重要菌類，主要寄生在人體的上呼吸道和腸道，且作為條件致病菌能夠?qū)е聶C(jī)體免疫力低下者發(fā)生肺炎、菌血癥等感染性疾病[1]。有研究表明[2]，腸桿菌科細(xì)菌在所有分離菌株中占有較高比率，而克雷伯菌屬在其中所占比重為第二。生物膜作為有協(xié)調(diào)性、組織性的高度組織群體，相較于浮游菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力更強(qiáng)，原因主要與生物膜中胞外多糖具有屏障作用，且內(nèi)部細(xì)菌生長(zhǎng)速度較慢等因素相關(guān)。生物膜對(duì)抗生素的抵抗力較強(qiáng)，常規(guī)藥物難以有效滲透，因此臨床對(duì)生物膜相關(guān)感染的有效治療是一大難題[3]。不僅如此，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）也是導(dǎo)致生物膜產(chǎn)生較強(qiáng)耐藥性的關(guān)鍵因素，其基因型主要為SHV、CTX-M以及TEM型[4，5]。目前對(duì)產(chǎn)生物膜的肺炎克雷伯菌的主要基因型研究尚不多見(jiàn)，為此本研究主要分析生物膜陽(yáng)性肺炎克雷伯菌的基因型，及其在醫(yī)院中的分布狀況及耐藥性，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

資料與方法

1 一般資料 選擇本院2013年8月～2015年8月臨床送檢的肺炎克雷伯菌標(biāo)本160株。

2 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定與藥敏實(shí)驗(yàn) 采用上海復(fù)星佰珞BIOFOSUN細(xì)菌鑒定儀，使用GN陰性菌鑒定板條鑒定菌株；藥敏實(shí)驗(yàn)采用腸桿菌藥敏板ME2 AST。以大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603作為質(zhì)控菌株，由南京便診生物科技有限公司提供。

3 檢測(cè)ESBLs方法 初步篩選實(shí)驗(yàn)使用K-B藥敏紙片法，紙片選擇頭孢他啶、氨曲南及頭孢噻肟，均為30μg/片。若頭孢他啶的抑菌圈直徑在22 mm及以下，頭孢噻肟、氨曲南的抑菌圈直徑在27 mm及以下，則為可疑產(chǎn)ESBLs株。再次測(cè)定菌株對(duì)頭孢他啶（30μg/片）和頭孢他啶（30μg/片）/克拉維酸（10μg/片），頭孢噻肟（30μg/片）與頭孢噻肟（30μg/片）/克拉維酸（10μg/片）的抑菌環(huán)直徑，若兩種藥物中任一種加克拉維酸與不加克拉維酸的抑菌圈直徑之差≥5 mm，即為ESBLs株。大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603做質(zhì)控的陰性、陽(yáng)性對(duì)照，由上海復(fù)祥生物科技有限公司提供。

4 基因分型 將已產(chǎn)生生物膜的肺炎克雷伯菌懸浮于TE緩沖液中，再使用煮沸法提取DNA行PCR擴(kuò)增。SHV、TEM及CTX2M的基因分型情況見(jiàn)表1[6]。PCR反應(yīng)方法如下：94℃預(yù)變性2 min；再94℃變性1 min，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；再72℃延伸 5 min，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳分析。SHV、TEM基因擴(kuò)增能夠產(chǎn)生471 bp、861 bp的PCR產(chǎn)物。

5 生物膜染色方法 采用半定量結(jié)晶紫染色法對(duì)所有分離肺炎克雷伯菌與生物膜陰性菌株染色，在595 nm單波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度?？瞻卓椎蛄悖珹c表示生物膜陰性株吸光度，當(dāng)試驗(yàn)株吸光度＞As時(shí)，則確定為生物膜陽(yáng)性。最后選出生物膜為陽(yáng)性的菌株。

表1 基因分型情況

結(jié) 果

1 肺炎克雷伯菌標(biāo)本類型的分布 所有肺炎克雷伯菌標(biāo)本中呼吸道標(biāo)本及尿液標(biāo)本所占比重最大，分別占59.38%和22.88%。見(jiàn)表2。

2 肺炎克雷伯菌標(biāo)本醫(yī)院分布情況 肺炎克雷伯菌標(biāo)本在重癥監(jiān)護(hù)病房檢出比重最高，為40.63%（65/160）；其次為呼吸內(nèi)科及神經(jīng)內(nèi)科。見(jiàn)表3。

3 肺炎克雷伯菌的耐藥性情況 肺炎克雷伯菌對(duì)氨芐西林的耐藥率占首位，為80.00%（128/160），其次為頭孢唑啉、頭孢曲松，氨芐西林/舒巴坦、復(fù)方新諾明和頭孢噻肟（三代）的耐藥率也在的比重最高，可能有如下幾點(diǎn)：①重癥監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)均為危重癥患者，所需治療時(shí)間較長(zhǎng)，且使用藥物劑量大，種類多；②重癥監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)的患者通常需要接受呼吸機(jī)、靜脈導(dǎo)管及導(dǎo)尿管等多種50%以上。耐藥率最低者為厄他培南。見(jiàn)表4。

表2 肺炎克雷伯菌標(biāo)本類型分布情況

表3 肺炎克雷伯菌標(biāo)本醫(yī)院分布情況

4 生物膜肺炎克雷伯菌所占比例及ESBLs基因分型 160株肺炎克雷伯菌中，有60株為生物膜陽(yáng)性（37.50%）。檢出ESBLs的16株生物膜肺炎克雷伯菌經(jīng)PCR基因擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增出TEM基因7株（41.75%），擴(kuò)增出SHV基因5株（31.25%），同時(shí)存在SHV及TEM基因2株（12.50%），未檢出CTX2M。

討 論

本研究中肺炎克雷伯菌主要以呼吸道標(biāo)本為主，占59.38%。原因與肺炎克雷伯菌主要寄生于人體呼吸道相關(guān)[7]。分析我院肺炎克雷伯菌醫(yī)院分布情況，以重癥監(jiān)護(hù)病房發(fā)生肺炎克雷伯菌感染侵入性操作，因此導(dǎo)致肺炎克雷伯菌感染率顯著上升，且從另一方面表明侵入操作會(huì)顯著增加醫(yī)院感染的發(fā)生率；③重癥監(jiān)護(hù)病房患者通常需要長(zhǎng)時(shí)間臥床休養(yǎng)，缺少鍛煉，且自身機(jī)體免疫力低下，所以發(fā)生肺炎克雷伯菌感染的概率較高[8，9]。而呼吸內(nèi)科發(fā)生肺炎克雷伯菌感染的比例占第2位，原因與患者機(jī)體抵抗力顯著降低相關(guān)[10，11]。

表4 肺炎克雷伯菌耐藥性情況

我院分離出的肺炎克雷伯菌耐藥性較嚴(yán)重，但部分藥物的耐藥率相比于程君[9]等研究較低。本研究結(jié)果顯示氨芐西林的耐藥率最高，為80.00%，其次為頭孢唑啉和頭孢曲松，氨芐西林/舒巴坦、復(fù)方新諾明和頭孢噻肟（三代）的耐藥率也在50%以上。此結(jié)果與其他醫(yī)院情況相類似。耐藥率最低者為厄他培南（0），其次為亞胺培南（1.25%）。

相關(guān)研究表明，肺炎克雷伯菌形成生物膜的概率較高，而生物膜也是導(dǎo)致肺炎克雷伯菌產(chǎn)生耐藥性的重要因素[12]。本研究中，160株肺炎克雷伯菌中有60株為生物膜陽(yáng)性，當(dāng)生物膜產(chǎn)生后，在胞外黏多糖及調(diào)控細(xì)菌耐藥基因表達(dá)等作用下，肺炎克雷伯菌對(duì)抗生素形成耐藥[13，14]。對(duì)產(chǎn)生ESBLs肺炎克雷伯菌的基因分型，結(jié)果顯示主要為SHV及TEM基因，未檢測(cè)出CTX2M，原因可能與樣本較少有關(guān)[15]。本研究中尚未分析生物膜肺炎克雷伯基因型及其耐藥性的相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，我院重癥監(jiān)護(hù)病房發(fā)生肺炎克雷伯菌感染的比重較高，而細(xì)菌耐藥性相對(duì)較低，而SHV及TEM為產(chǎn)生生物膜肺炎克雷伯菌的主要基因分型。

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Objective To study the distribution and drug resistance ofKlebsiellapneumoniae in hospital and analyze the genotypes of K.pneumoniaewith biofilm.Methods One hundred and sixty strains of clinical specimens were collectedfrom August 2013 to August 2015.The bacterial distribution，drug resistance and K.pneumoniae genotype were analyzed.Results K.pneumoniaedominated in the specimensfrom respiratory tract and urethra，accounting for 59.38% and 22.88%，respectively.The highest rate of ICSI was 40.63%，followed by 16.25% and 14.38%.K.pneumoniaeresistance to ampicillin accounted for 80.00%，followed by cefazolin（67.50%），and ceftriaxone，（65.00%）.More than 50% of the strains tested showed relatively resistant to ampicillin/sulbactam，sulfamethoxazole and cefotaxime.Antibiotics to which K.pneumoniaeproduced less resistance included erpicane，followed by imipenem and cefotetan.The biofilm positive rate in all 160 strains was 37.50%.The ESBLs detected 16 strains of K.pneumoniae biofilm，41.75% of the bacteria presented positive TEM gene and 31.25%，SHV gene while bacteria carrying both SHV and TEM genes accounted for 12.50%.No CTX2Mwas detected.Conclusion The incidence of K.pneumoniae infection in intensive care unit is relatively high，and the drug resistance of the bacteria seems to be low.The predominant genotypes of K.pneumonia with biofilm include SHVand TEM.

Klebsiellapneumonia Biofilm Genotype Drug resistance

R378 R969.3

A

1671-2587（2017）05-0456-04Genotyping and Drug Resistance of Biofilm Formin g Strains of Kleb siella Pneumoniae PENG Rong-rong，KONG Xiao-ming，ZHOU Xiang.Department of Laboratory Diagnostics，People's Hospital of Liyang，Jiangsu 213300

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.05.014

*本課題受江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)臨床科技發(fā)展基金項(xiàng)目（No.JLY20140095）；溧陽(yáng)市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（社會(huì)發(fā)展）項(xiàng)目（No.LC2015010）資助

213300 江蘇省溧陽(yáng)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

彭蓉蓉（1983–），女，江蘇溧陽(yáng)人，主管技師，學(xué)士，主要從事檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)工作，（E-mail）weqifyf@163.com。

2017-02-26）

（本文編輯：王虹）