朱淑斌，趙旭庭，倪黎綱，徐 盼，陶 勇，莊 勛，周春寶*

(1.江蘇農牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300；2.姜曲海豬保種場，江蘇 泰州 225300)

姜曲海豬肌肉FoxO1基因表達水平與組織學特性的相關研究

朱淑斌1，趙旭庭1，倪黎綱1，徐 盼1，陶 勇1，莊 勛2，周春寶1*

(1.江蘇農牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300；2.姜曲海豬保種場，江蘇 泰州 225300)

【目的】探究姜曲海豬不同部位肌肉FoxO1基因mRNA的發(fā)育變化規(guī)律，結合屠宰試驗分析FoxO1基因mRNA表達水平對肌肉組織學特性的影響?！痉椒ā窟x取初生、1、2、4、6、8月齡姜曲海豬各5只，屠宰后取背最長肌、比目魚肌、腓腸肌和半腱肌檢測肌原纖維直徑，用熒光實時定量PCR法檢測姜曲海豬不同部位肌肉FoxO1基因mRNA表達水平，分析其在不同時期的變化及其與肌肉肌原纖維直徑的關系。【結果】①隨月齡增加，背最長肌、比目魚肌、半腱肌和腓腸肌的肌原纖維直徑變化規(guī)律基本一致，從出生到1月齡，生長速度最快，2月齡后逐漸趨于穩(wěn)定。②姜曲海豬不同肌肉部位FoxO1基因mRNA表達的發(fā)育性變化模式不同，具有組織特異性，背最長肌和半腱肌FoxO1基因的表達量總體呈現下降—上升—下降趨勢，比目魚肌和腓腸肌FoxO1基因的表達量總體呈現上升—下降—上升。③姜曲海豬不同肌肉部位基因的表達量與肌原纖維直徑相關分析表明，FoxO1基因的表達量與不同年齡時背最長肌、比目魚肌、半腱肌和腓腸肌無顯著相關性(P>0.05)。【結論】姜曲海豬不同部位肌肉肌原纖維生長發(fā)育變化基本相同；不同部位肌肉FoxO1基因表達模式不同；同月齡FoxO1基因的表達量在不同部位肌肉中表達量顯著不同。FoxO1基因的表達量與不同部位肌肉肌原纖維生長發(fā)育無顯著性相關。

姜曲海豬；骨骼??；FoxO1基因；組織學特性

【研究意義】隨著人民生活水平的不斷提高，對豬肉品質提出了更高的要求。姜曲海豬是中國特有的寶貴地方品種，因其肉質細膩、香味濃郁而備受消費者的青睞，是養(yǎng)豬業(yè)中生產優(yōu)質豬肉較好的素材。在肉品質研究中表明，肌纖維性狀對豬肌肉的生長發(fā)育和肉品質特性有著十分重要的影響[1]。由于組織學性狀只有動物屠宰才能檢測，耗費大量人力物力和財力，因此，用DNA標記輔助選擇(MAS)對提高豬肉品質是十分有意義的[2]?！厩叭搜芯窟M展】豬的肉質性狀是由微效多基因調控，受多個主效基因和候選基因調控[3]。肌肉組織主要是由肌纖維、結締組織和肌內脂肪組成[4]，骨骼肌最基本的結構是肌纖維，因此肌纖維特性對肉的品質有十分重要影響[5]。近年來多項研究均發(fā)現叉頭轉錄因子FoxO1基因在肌細胞分化和肌肉的形成中具有重要作用[6-7]，并且FoxO1基因在調控時與MSTN和MyoD基因之間存在著相互關系，FoxO1基因在這個信號傳導通路中起著重要的介導作用[8-10]。FoxO家族是INS/IGF-1(Insulin/Insulin-like Growth Factor 1)信號通路中的關鍵轉錄調控因子，FoxO1是FoxO家族中發(fā)現最早的成員，FoxO1基因在進化上高度保守，目前，該基因定位于豬的11號染色體，其氨基酸序列中含有3個高度保守的蛋白激酶B(PKB)磷酸化基因序列，受PI3K/PKB磷酸化級聯通路的調節(jié)，FoxO1的活性與磷酸化狀態(tài)直接相關[11-12]，其與成肌細胞分化及脂肪細胞代謝有很大關聯，FoxO1作為潛在因子與骨骼肌的分化以及成肌細胞分化中的肌管形成有重要關系[13-15]，且與Ⅰ型(TypeⅠ)和Ⅱb型(TypeⅡb)肌纖維基因的表達關系密切[16]。楊燕軍研究了不同經濟類型豬品種骨骼肌中，同一品種不同肌纖維類型FoxO1基因mRNA的表達豐度都存在顯著差異[17]。王玲報道了牛FoxO1基因單倍型組合對肌肉的剪切力、肌纖維直徑和肌纖維密度的遺傳效應達到顯著水平[18]。因此，FoxO1基因可能是影響肌纖維特性的遺傳標記?！颈狙芯壳腥朦c】目前FoxO1基因研究主要集中在人和嚙齒類動物上，在家畜上的研究較少，僅在豬和牛上有少量報道。在豬上尚未見到有關FoxO1基因表達與肌肉組織性特性相關性研究報道。【擬解決的關鍵問題】本試驗利用熒光實時定量PCR技術，檢測姜曲海豬不同部位肌肉FoxO1基因表達的發(fā)育性變化，結合屠宰試驗分析FoxO1基因表達水平對肌肉組織特性的影響，探討FoxO1的功能及作用機理提供理論依據，進而篩選出FoxO1作為豬肉肉質性狀的侯選基因提供理論基礎，為姜曲海豬資源利用和開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇姜曲海豬30只(姜曲海種豬場)，其中0、1、2、4、6、8月齡各5只，屠宰后取背最長肌、比目魚肌、腓腸肌、半腱肌不同部位肌肉組織，樣品保存于-70 ℃，用于提取組織RNA；不同肌肉部位取5 mm3肉樣，置于2.5 %戊二醛液固定，4 ℃下保存，以備制片。

1.2 試驗方法

1.2.1 組織學特性 將固定在2.5 %的戊二醛溶液中的組織塊進行修成1 mm3大小,置于2.5 %戊二醛溶液中繼續(xù)固定，經PBS沖洗后，用鋨酸固定，梯度乙醇脫水，經包埋聚合進行超薄切片，經醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，進行透射電鏡觀察，測定肌原纖維直徑。

1.2.2 引物合成 根據NCBI公布的豬FoxO1基因的cDNA序列(NM_214014.2)，采用Primer premier 5.0和Oligo6.0軟件設計目的基因引物，F：5′-TACCCACCCTCGGCGGCA-3′，R：ATGGTGCCTGGTGAAGACTG，產物預期長度152 bp，退化溫度60℃；β-actin，F：5′-ACACGGTGCCCATCTACGAG-3′，R：5′-GCTTCTCCTTGATGTCCCGC-3′，產物預期長度165 bp，退化溫度60 ℃。引物由上海生工合成。

1.2.3 組織總RNA提取、反轉錄 用RNA提取試劑盒提取總RNA，使用RNA純化試劑盒進行RNA純化。具體操作按試劑盒要求完成，反轉錄產物儲存在-20 ℃。

1.2.4 實時熒光定量PCR和標準曲線的制作 利用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit進行二步法實時熒光定量PCR檢測，每個樣品3個重復。在LC-480Ⅱ型熒光定量PCR儀上進行擴增。

取表達目的基因的總RNA為模板合成cDNA作為標準品，進行梯度稀釋，稀釋后樣品作模板，分別用目的基因引物和內參基因引物進行擴增。同時在60～95 ℃進行融解曲線分析，并繪制目的基因和內參基因的標準曲線。

1.3 統(tǒng)計分析

結果均用平均值±標準差表示。不同生長時期肌肉組織特性、基因表達量的差異和同一生長期不同肌肉部位基因表達量的差異用SPSS13.0軟件包中的ANOVA進行分析，基因的表達量與肌肉組織學指標進行相關分析。

2 結果與分析

2.1 姜曲海豬不同肌肉部位組織學特性

圖1表明，姜曲海豬背最長肌、比目魚肌、半腱肌和腓腸肌的肌原纖維直徑變化規(guī)律基本一致，從出生到1月齡，生長速度最快，2月齡后逐漸趨于穩(wěn)定，4月齡后各部位肌原纖維直徑變化不大。由此可見，姜曲海豬在胚胎期粗細肌絲未分化發(fā)育完善，從初生至1月齡期間是迅速分化、發(fā)育的重要時期。

2.2 姜曲海豬肌肉FoxO1基因mRNA表達水平的發(fā)育性變化

從圖2可見，每條標準曲線的R2都達到0.99，因此可采用本方法和上述引物進行后續(xù)試驗分析。

用RT-PCR法對姜曲海豬0、1、2、4、6和8月齡時4個不同部位肌肉的FoxO1基因mRNA表達量(圖3)進行分析，結果(圖4)顯示，姜曲海豬不同肌肉部位FoxO1基因mRNA表達的發(fā)育性變化模式不同，姜曲海豬背最長肌該基因的表達量6月齡時達到最高，與其它各月齡相比均差異顯著(P<0.05)，總體呈現先下降—上升—下降趨勢，2月齡最低，8月齡時有所回升；比目魚肌該基因表達量1月齡時有明顯的上升，達到最高值，除8月齡以外，與其余各月齡相比差異顯著(P<0.05)，然后開始下降，4月齡表達量達到最低，總體趨勢與背最長肌相反，即先上升—下降—上升；半腱肌該基因表達量，總體趨勢與背最長肌相同，出生后到2月齡，呈下降趨勢，但幅度不大，差異不顯著，2月齡到6月齡，呈上升趨勢，6月齡表達量與初生時相近，與1月齡和2月齡差異顯著(P<0.05)，6月齡后表達量下降；腓腸肌該基因表達量，1月齡最高，與其它各月齡均差異顯著(P<0.05)，基因表達量總體呈現上升—下降—上升—下降。同一月齡不同部位肌肉FoxO1基因mRNA表達量分析發(fā)現：出生時該基因背最長肌表達量顯著高于比目魚肌、半腱肌和腓腸肌(P<0.05)；1月齡時半腱肌顯著低于背最長肌、比目魚肌和腓腸肌(P<0.05)；2月齡時腓腸肌表達量最高，與背最長肌和半腱肌差異顯著(P<0.05)，與比目魚肌差異不顯著；4月齡時半腱肌顯著高于背最長肌和比目魚肌(P<0.05)，與腓腸肌差異不顯著；6月齡時背最長肌顯著高于比目魚肌、半腱肌和腓腸肌(P<0.05)；8月齡時比目魚肌顯著高于背最長肌、半腱肌和腓腸肌(P<0.05)。

圖1 姜曲海豬不同肌肉部位肌原纖維直徑的發(fā)育性變化Fig.1 Developmental changes of myofibril diameter in different anatomical muscles of Jiangquhai swine

A：FoxO1基因標準曲線；B：FoxO1基因溶解曲線；C：內參基因標準曲線； D：內參基因溶解曲線A：Standard curve of FoxO1 gene；B：Melting curve of FoxO1 gene;C：Standard curve of β-actin gene； D：Melting curve of β-actin gene圖2 FoxO1、β-actin的標準曲線和熔解曲線Fig.2 The standard and melting curve of FoxO1 and β-actin genes

A：FoxO1基因實時擴增曲線；B：內參基因實時擴增曲線；C：FoxO1基因擴增產物溶解曲線； D：內參基因擴增產物溶解曲線A：The amplification curve of FoxO1 gene；B：The amplification curve of β-actin gene；C：The melting curve of FoxO1 gene； D：The melting curve of β-actin gene圖3 FoxO1、β-actin實時擴增曲線圖和擴增產物溶解曲線Fig.3 The amplification and melting curve of FoxO1 and β-actin genes

圖4 姜曲海豬肌肉FoxO1基因表達的發(fā)育性變化Fig.4 Developmental changes of muscle FoxO1 mRNA expression in Jiangquhai swine

2.3 姜曲海豬不同肌肉組織FoxO1基因表達水平與肌纖維發(fā)育的相關性

對姜曲海豬肌肉不同部位FoxO1基因的表達量與肌原纖維直徑的相關分析(表1)表明，FoxO1基因的表達量與不同年齡時背最長肌、比目魚肌、半腱肌和腓腸肌有相關性，從初生到8月齡，相關系數均未達到顯著水平。但從豬初生到1月齡期間是肌纖維迅速分化、發(fā)育的重要時期。在這個時期內，比目魚肌和腓腸肌中FoxO1基因的表達量與肌原纖維直徑呈顯著正相關，而在背最長肌和半腱肌中FoxO1基因的表達量與FoxO1基因的表達量呈負相關，由此可見，FoxO1基因在不同部位肌肉調控發(fā)育分化方式是不同的。

3 討 論

大量研究表明，FoxO1在成肌細胞分化中起關鍵作用。Hribal等[19]報道了過量表達FoxO1抑制成肌細胞分化為肌管，相反，顯性失活FoxO1能部分恢復C2C12細胞的分化抑制，通過siRNA抑制FoxO1的表達來增加肌漿球蛋白的表達，結果有利于肌細胞分化。Bois等[20]研究表明，在鼠中，FoxO1在成肌細胞分化中調控肌管融合的速率，原因是增強FoxO1顯性失活突變體的基因表達阻止肌管形成，而FoxO1野生型的無此作用。Allen等[21-22]研究報道了對大鼠、小鼠和細胞系的研究結果，FoxO1可能作為潛在因子通過抑制MyoD表達來阻止骨骼肌分化。本試驗發(fā)現，FoxO1基因mRNA表達的發(fā)育性變化在姜曲海豬肌肉中有明顯的組織差異性，且在姜曲海豬肌肉發(fā)育過程中FoxO1基因mRNA表達模式不同，在背最長肌和半腱肌中呈先下降后上升再下降趨勢，而在腓腸肌和比目魚肌中呈先上升后下降趨勢；同月齡FoxO1基因的表達量在背最長肌、比目魚肌、半腱肌和腓腸肌中表達量顯著不同，原因可能因為不同位置骨骼肌機能不同，活動強度也有很大差異，與楊燕軍[17]研究結果一致，其機理可能是FoxO1基因通過影響MyoD基因mRNA表達途徑，進而調控骨骼肌的發(fā)育。表明FoxO1基因可能是影響豬肌肉生長發(fā)育的候選基因，且該基因可能對特定類型肌纖維發(fā)育有一定的積極調控作用，與FoxO1基因的生理作用一致。

表1 姜曲海豬不同肌肉部位FoxO1基因的表達水平與肌原纖維直徑的相關性分析

大多數陸棲脊椎動物的肌纖維數目在出生前就已確定，如豬在胚胎期90 d肌纖維的數目就已不再發(fā)生變化，基本趨于穩(wěn)定[23]，因此動物出生后肌肉的生長發(fā)育實際是肌原纖維的分化及發(fā)育。骨骼肌是由混雜的肌纖維組成[24]。肌纖維類型的種類和超微結構的不同決定了肌肉不同的代謝和生理學功能[25]。根據形態(tài)學和功能方面的差異，骨骼肌纖維可分紅肌(I型)、白肌(II型)和中間肌[26]。本研究中取肌肉樣時考慮到不同肌肉組織中各肌纖維組成比例有很大差異，選擇有代表性的：比目魚肌屬于慢紅肌纖維類型；而腓腸肌和背最長肌則紅肌纖維和白肌纖維基本相當[27]；半腱肌屬于快白肌類型。研究結果表明，FoxO1基因在不同肌肉中表達量存在較大差異，提示FoxO1基因調控其中某一類型肌纖維的分化，在姜曲海豬初生的第一個月是肌肉分化、發(fā)育最重要時期，在比目魚肌和腓腸肌中1月齡時FoxO1基因表達量與初生相比顯著升高，而背最長肌變化不大，因比目魚肌以紅肌為主，說明FoxO1基因調控紅肌生長發(fā)育，與楊燕軍[17]研究結果一致。肌肉組織中肌纖維類型的組成并非一成不變，肌纖維類型轉化是所有豬種的種質特性,由于遺傳因素的影響,豬種間只有量的差異,而無質的區(qū)別[28]，轉化的次序為慢肌→快紅肌→中間型快肌→快白肌[29-30]，形態(tài)上呈現出肌纖維肥大(纖維直徑增大)的變化。豬肉肌纖維類型與生理動態(tài)轉化平衡有關。這種轉化的動態(tài)平衡受機體生長階段和肌肉運動方式的多種因素影響。本研究中發(fā)現FoxO1基因表達在肌肉生長發(fā)育后期無明顯規(guī)律，可能與不同肌肉肌纖維轉化有關。

本文僅在轉錄水平上研究了姜曲海豬FoxO1基因的發(fā)育性變化對肌肉組織學特性的影響，而未在蛋白質水平上研究其發(fā)育性變化對肌肉組織學特性的影響。FoxO1基因mRNA表達的發(fā)育性變化在姜曲海豬不同肌肉中有明顯的組織差異性，但無較明顯的規(guī)律。FoxO1基因mRNA水平和肌原纖維直徑存在相關，可能是因為姜曲海豬肌肉FoxO1的調控作用不是發(fā)生在mRNA水平上，而有可能在翻譯后的蛋白質水平上。FoxO1基因在蛋白質水平上對肌肉組織學特性的影響情況還需進一步研究。

4 結 論

姜曲海豬不同部位肌肉肌原纖維生長發(fā)育變化基本相同。不同部位肌肉FoxO1基因表達模式不同，背最長肌和半腱肌FoxO1基因的表達量總體呈現下降—上升—下降趨勢，比目魚肌和腓腸肌FoxO1基因的表達量總體呈現上升—下降—上升。同月齡FoxO1基因的表達量在背最長肌、比目魚肌、半腱肌和腓腸肌中表達量顯著不同。FoxO1基因的表達量與不同年齡時背最長肌、比目魚肌、半腱肌和腓腸肌肌原纖維有相關性，相關系數均未達到顯著水平。FoxO1基因調控肌肉生長發(fā)育，調控的分子機制有待于進一步研究。

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AssociationofFoxO1GeneExpressionwithHistologicalCharacteristicsinJiangquhaiSwineMuscles

ZHU Shu-bin1,ZHAO Xu-ting1, NI Li-gang1,XU Qan1, TAO Yong1,ZHUANG Xun2, ZHOU Chun-bao1*

(1. Jiangsu Animal Husbandry and Veterinary College, Jiangsu Taizhou 225300,China; 2.Mational Jiangquhai Pig Breed Conservation Farm, Jiangsu Taizhou 225300,China )

【Objective】The objectives of this study were to investigate the developmental changes of the Forkhead box O1(FoxO1) mRNA level in different parts of muscles in Jiangquhai Swine and its effect on muscle histological characteristics. 【Method】Jiangquhai Swine at 0,1,2,4,6,8 months age were selected to investigate the developmental changes ofFoxO1 mRNA expression and its effect on myofibril diameter in four different parts of muscles. Five animals were slaughtered to collect samples from longissimus dorsi muscle, soleus muscle, gastrocnemius muscle and semitendinosus muscle. for the purpose of determining the muscle myofibril diameter and extracting total RNA in order to investigate the developmental changes of theFoxO1 mRNA expression by real-time PCR. 【Result】With growing, myofibril diameter developed with the same law among longissimus dorsi muscle, soleus muscle, gastrocnemius muscle and semitendinosus muscle.They growed fastest in the first month, it gradually stabilized after 2 month.FoxO1 mRNA expression level was different in different parts of muscles in Jiangquhai swine and has tissues-dependent. In longissimus dorsi muscle and gastrocnemius muscleFoxO1 mRNA expression level was declined in the two month ,then increased slowly and declined with growing; Soleus muscle and semitendinosus muscleFoxO1 mRNA expression level presented increasing-decreasing-increasing with growing;FoxO1 mRNA expression level in longissimus dorsi muscle, soleus muscle, gastrocnemius muscle and semitendinosus muscle were related to myofibril diameters(P>0.05). 【Conclusion】Myofibril diameter developed with the same law in different parts of muscles in Jiangquhai swine;FoxO1 mRNA expression level was different in different parts of muscles;In the same monthFoxO1 mRNA expression level has tissues-dependent in muscles of four different parts in Jiangquhai swine.FoxO1 mRNA expression was effect on myofibril diameters.

Jiangquhai swine; Skeletal muscle;FoxO1 gene; histological characteristics

1001-4829(2017)10-2376-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.036

2016-12-29

江蘇省農業(yè)三新工程項目“蘇姜豬持續(xù)選育及良種繁育體系建設”(SXGC[2016]297)；產學研聯合創(chuàng)新資金-前瞻性聯合研究項目“蘇姜豬新品種持續(xù)選育技術創(chuàng)新研究及產業(yè)化開發(fā)”(BY2014124)；鳳凰人才工程

朱淑斌(1977-)，女，黑龍江哈爾濱人，博士研究生，研究方向動物遺傳育種，Tel：13952601225，E-mail：zhushubin2003@163.com，*為通訊作者。

S813.24

A

(責任編輯 李 潔)