廖 青，梁潘霞，邢 穎，黃太慶，劉永賢，江澤普

(廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣西 南寧 530007)

廣西富硒區(qū)土壤耐硒菌株的分離及鑒定

廖 青，梁潘霞，邢 穎，黃太慶，劉永賢，江澤普*

(廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣西 南寧 530007)

【目的】從廣西富硒區(qū)土壤中分離出多株耐硒菌株，為土壤硒資源開發(fā)利用提供參考?！痉椒ā吭趶V西主要富硒區(qū)永福、巴馬、玉林寒山、桂平、藤縣等地采集田間土樣，利用稀釋平板法并通過加硒培養(yǎng)對耐硒微生物進行分離、篩選?！窘Y(jié)果】篩選得到8株耐硒能力較強的菌株，其在固體培養(yǎng)基中對硒的耐受濃度均在10 000 μg/mL以上。8株耐硒菌株中，YLB1-33耐硒能力最強，其在含硒量為29000 μg/mL的固體培養(yǎng)基中仍能微弱生長。經(jīng)16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定結(jié)果表明，YLB1-6為蠟質(zhì)芽孢桿菌、BMB2-1和TXB1-8為短小芽孢桿菌、GPB2-5為蘇云金芽孢桿菌、YLB1-26和YLB1-33為地衣芽孢桿菌、YLB1-2和YFB1-8為粘質(zhì)沙雷氏菌?！窘Y(jié)論】耐硒菌株的發(fā)現(xiàn)對廣西土壤硒資源利用、富硒農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)具有潛在的應用價值。

富硒土壤；耐硒；菌株；鑒定；廣西

【研究意義】硒(Se)是人體必需的15種微量元素之一，適度開發(fā)利用土壤硒資源，生產(chǎn)天然富硒農(nóng)產(chǎn)品，對于滿足人們?nèi)粘Ｑa硒的需求尤為重要。廣西是富硒大省區(qū)，富硒土壤面積達212萬hm2，為目前全國圈定出的特大面積連片富硒土壤區(qū)域[1]，土壤硒含量最高可達2.29 mg/kg[2]。然而，由于廣西富硒土壤在中酸性土壤區(qū)分布較多，硒易與鐵形成溶解性極低的氧化物和水合氧化物，硒有效硒大大降低[3]，土壤硒資源優(yōu)勢得不到充分地發(fā)揮。研究如何提高土壤有效硒含量，對土壤硒資源優(yōu)化利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】微生物在硒的地球化學循環(huán)和形態(tài)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的作用[4-6]，它可以通過氧化、還原、同化、甲基化等多種方式代謝硒[7]。研究發(fā)現(xiàn)，許多微生物可以耐受高濃度的亞硒酸鹽，如假單胞菌 (Pseudomonassp.)、戴爾福特菌(Delftiatsuruhatensis)、球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)，其耐亞硒酸鹽的濃度高達600 mM[8]。高硒環(huán)境是超耐硒微生物種群的潛在來源，一些學者從湖北恩施漁塘壩篩選出多株超耐硒細菌，彭祚全等[9]所篩選的鮑氏不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，其耐硒能力高達25 000 μg/mL；袁永強等[10]篩選到的3株具有還原亞硒酸鹽能力的細菌，其耐硒濃度高達800 mM，這是目前細菌耐受四價硒的最高濃度之一。研究表明，高硒脅迫下細菌會產(chǎn)生應激反應，將毒性高的四價硒或六價硒轉(zhuǎn)化成低毒的元素硒。因此，利用微生物對硒的轉(zhuǎn)化作用有可能實現(xiàn)土壤硒的生物活化?！颈狙芯壳腥朦c】目前，我國高硒地區(qū)如湖北恩施州開展耐硒微生物研究起步較早，而廣西關于土壤硒轉(zhuǎn)化相關微生物的研究未見相關報道。【擬解決的關鍵問題】從廣西富硒地區(qū)采集多個土壤樣品并進行耐硒微生物篩選，以期為后繼獲取天然富硒微生物進行土壤硒活化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 從廣西永福、巴馬、玉林寒山、桂平、藤縣等多個富硒區(qū)采集土壤樣品中分離、純化。

1.1.2 試劑 亞硒酸鈉(Na2SeO3，AR 98 %)購自山東西亞化學工業(yè)有限公司為，磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)購自上海生工生物工程技術服務有限公司；其他化學藥品均為國內(nèi)生產(chǎn)的分析純產(chǎn)品。

硒液制備：稱取22.35 g Na2SeO3，溶于去離子水中并定容至100 mL，此溶液硒濃度為100 mg/mL，使用無菌濾頭(0.22 μm)過濾后備用，存于避光處。

1.1.3 培養(yǎng)基 包括細菌、放線菌、真菌的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。

細菌液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.3±0.2；

放線菌液體培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，氯化鈉0.5 g，硫酸亞鐵 0.01 g，硝酸鉀1 g，磷酸氫二鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.3±0.2；

真菌液體培養(yǎng)基：20 %馬鈴薯浸出液1000 mL，蔗糖20 g。馬鈴薯浸出液的制備：稱取去皮馬鈴薯切塊200 g，加蒸餾水1000 mL煮沸0.5 h，用紗布過濾取汁，補足原來的水量。

細菌、放線菌、真菌固體培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂、高氏合成I號培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

所有培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min后使用。

1.2 試驗方法

1.2.1 微生物的分離 在廣西永福、巴馬、玉林寒山、桂平、藤縣等多個富硒區(qū)采集土壤樣品進行微生物的分離。取10 g土樣加入到預先裝有10顆玻璃珠的90 mL的無菌PBS中，30 ℃、200 r/min振蕩30 min，靜置5 min，收集土壤懸液，于5000 r/min離心15 min，沉淀用10 mL PBS懸浮，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ? mL制備好的樣品加入到100 mL含硒濃度為100 μg/mL的液體培養(yǎng)基中進行篩選培養(yǎng)，然后用梯度稀釋法制備10-2～10-6系列稀釋液，取100 μl分別涂布到固體培養(yǎng)基中，30 ℃下培養(yǎng)至菌落長好，挑取單個菌落，采用平板劃線法獲得菌株純培養(yǎng)物。

1.2.2 耐硒能力篩選 將分離純化得到的菌株接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取5 μl 24～48 h培養(yǎng)液接種不同硒濃度的固體培養(yǎng)基中。含硒固體培養(yǎng)基中硒的濃度遞增梯度為100、200、300、400、500、600、700、800、900和1000 μg/mL，經(jīng)過前10輪加硒培養(yǎng)基淘汰后，能存活下來的菌株再進行更高硒濃度篩選。

1.2.3 耐硒菌株的分子生物學鑒定 菌株16S rDNA序列由南寧國拓生物科技有限公司進行測定。所得序列提交至GenBank，用BLAST軟件與GenBank庫中已知序列進行相似性比對，并利用MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，確定菌株的種屬類別。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離

本試驗采用加硒液體培養(yǎng)基進行耐硒菌株初篩，利用梯度稀釋涂板，從多個廣西富硒土壤樣品中共分離到具有不同菌落特征的微生物菌株62株，其中細菌32株，放線菌9株，霉菌10株，酵母菌11株。采用平板劃線法將這些菌株進行純化，菌株純化后于試管斜面上4 ℃保藏。

2.2 耐硒能力篩選

經(jīng)過前10輪加硒濃度遞增篩選，能夠在硒濃度1000 μg/mL的固體培養(yǎng)基上存活的菌株有38株，其中細菌26株，霉菌5株，酵母菌7株，這些菌株均能將亞硒酸鈉還原成紅色單質(zhì)硒，在含硒平板上呈現(xiàn)紅色菌落。所篩菌株中，放線菌對硒的耐受性最差，其中2株對硒的耐受最高耐硒濃度也僅為900 μg/mL，當硒濃度達到1000 μg/mL所有放線菌均不能生長；7株酵母菌雖然能耐受1000 μg/mL硒，但生長很弱，在平板上菌落呈點狀；霉菌在1000 μg/mL硒的平板上，生長也有不同程度的減弱，表現(xiàn)為菌絲生長受抑制；細菌對硒的耐受性相對較強，所篩細菌中，80 %能在硒濃度為1000 μg/mL的平板上生長，且大多數(shù)細菌生長良好。

圖1 耐硒菌株菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strains with high Se tolerance

能耐受1000 μg/mL硒的菌株再進行更高耐硒能力測定，平板硒濃度從1000～30 000 μg/mL，硒梯度按500 μg/mL遞增。隨著培養(yǎng)基中硒濃度逐漸提高，菌株生長受到抑制，高于其耐受能力即不能生長。結(jié)果表明，酵母菌最高耐受硒濃度為1500 μg/mL，霉菌為3000 μg/mL，細菌為29 000 μg/mL。其中，耐10 000 μg/mL硒以上的細菌一共有8株(圖1)，其中3株耐硒濃度為11 000 μg/mL(分別命名為YLB1-6、BMB2-1、TXB1-8)，1株耐硒11 500 μg/mL(GPB2-5)，1株耐硒15 000 μg/mL(YLB1-26)，2株耐硒20 000 μg/mL(分別命名為YLB1-2、 YFB1-8)，1株耐硒29 000 μg/mL(YLB1-33)。

2.3 菌株鑒定結(jié)果

2.3.1 菌落形態(tài)特征 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h后，各菌株菌落形態(tài)如圖1所示。菌株YLB1-6生長良好，菌落呈灰白色，圓形或近圓形，邊緣呈放射融蠟狀，菌落中央稍隆起，不透明，質(zhì)地軟，稍有光澤；菌株BMB2-1近似圓形，淡黃色，扁平，邊緣不整齊，半透明，表面光滑、濕潤；菌株TXB1-8近圓形，淡黃色，扁平，邊緣不整齊，不透明，表面濕潤、光滑、有黏性；菌株GPB2-5菌落呈圓形，白色，不透明，邊緣整齊、光滑；菌株YLB1-26和YLB1-33呈白色，圓形，白色，扁平，不透明，邊緣呈鋸齒狀，表面粗糙皺褶；菌株YLB1-2和YFB1-8菌落圓形，中間凸起，不透明，表面光滑，邊緣整齊，較粘稠，易挑起。

2.3.2 16S DNA擴增結(jié)果 挑選耐10 000 μg/mL硒以上的8株細菌通過PCR擴增出其16S rDNA(圖2)，這些菌株的16S rDNA序列長度均在1450 bp左右。

2.3.3 16S DNA序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果 BLAST分析結(jié)果(表1)表明，這8株耐硒細菌與其同源菌株相似性均在99 %以上，YLB1-6可初步鑒定為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)，BMB2-1和TXB1-8為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，GPB2-5為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)，YLB1-26和YLB1-33為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，YLB1-2和YFB1-8為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。

M: Marker; 1: YLB1-26; 2: TXB1-8; 3: YLB1-6; 4: BMB2-1; 5: YLB1-33; 6: GPB2-5; 7: YLB1-2; 8:YFB1-8圖2 16S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplified products of 16S rDNA

菌株Strains同源菌株Thenearesttypestrain相似性(%)IdentityYLB1-6蠟質(zhì)芽孢桿菌BacilluscereusDS1699BMB2-1短小芽孢桿菌BacilluspumilusMTCC7514100TXB1-8短小芽孢桿菌BacilluspumilusRHS/T-38499GPB2-5蘇云金芽孢桿菌BacillusthuringiensisBAPE199YLB1-26地衣芽孢桿菌BacilluslicheniformisCCMMB92799YLB1-2粘質(zhì)沙雷氏菌SerratiamarcescensSYJ1-999YFB1-8粘質(zhì)沙雷氏菌SerratiamarcescensSM3999YLB1-33地衣芽孢桿菌BacilluslicheniformisXJ-P9599

圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

以N-J法(MEGA 5.0軟件)構建了廣西富硒地區(qū)耐硒細菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，本研究所得耐硒細菌聚集為2個大分支，一個分支為Bacillus，另一分支為Serratia。其中，Bacillus為優(yōu)勢菌群。結(jié)合菌株16S DNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，可將YLB1-6鑒定為蠟狀芽孢桿菌，BMB2-1和TXB1-8鑒定為短小芽孢桿菌，GPB2-5鑒定為蘇云金芽孢桿菌，YLB1-26和YLB1-33鑒定為地衣芽孢桿菌，YLB1-2和YFB1-8為粘質(zhì)沙雷氏菌。

3 討 論

本研究通過對廣西富硒區(qū)耐硒菌株進行篩選，發(fā)現(xiàn)土壤細菌耐硒能力最強，放線菌耐硒能力最差；所篩8株耐硒菌株均為細菌，經(jīng)16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育綜合分析，6株屬于常見耐受硒的芽孢桿菌綱(Bacill)，另外2株屬于真細菌綱(Eubacteriae)，粘質(zhì)沙雷氏菌具有高耐硒能力為首次報道；這些菌株在加硒固體培養(yǎng)基上均能耐受硒濃度10 000 μg/mL以上，其中YLB1-33耐硒能力最強，達29 000 μg/mL，這在廣西富硒地區(qū)(非高硒區(qū))極為罕見。

關于微生物耐硒機理存在多種假說。目前較為認可的一種假說是，微生物通過自身還原作用將高濃度硒酸鹽或亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化為低毒的紅色單質(zhì)硒[11-13]從而降低高硒環(huán)境對菌體的毒害作用。這種紅色單質(zhì)硒其實是一種易溶于水的紅色元素硒-蛋白復合物[14]，因其毒性小，對熱穩(wěn)定，被認為是硒生物解毒的方式[15]。耐硒微生物還原產(chǎn)生的紅色單質(zhì)硒在護肝、免疫調(diào)節(jié)、抑瘤等方面具有較好的生物活性[16]，因而可直接用作保健補硒制劑。另一方面，耐硒微生物在硒的代謝中可實現(xiàn)硒的不同價態(tài)的轉(zhuǎn)化，并且能將無機硒轉(zhuǎn)化成有機硒，在土壤硒活化方面具有巨大的應用潛力。廣西富硒土壤以酸性紅壤和赤紅壤居多，土壤硒以亞硒酸鹽為主，易被鐵的氧化物和粘土礦物吸附，但在耐硒微生物的作用下，強吸附態(tài)的亞硒酸鹽有可能轉(zhuǎn)化為可溶性有機硒[17]，被吸附固定的硒獲得釋放，土壤硒的有效性得以提高。

耐硒微生物盡管在土壤硒活化方面有巨大的應用潛力，但還是要對其作進一步篩選以獲得有效硒轉(zhuǎn)化效率高的菌株，并開展天然富硒微生物活化條件研究及在富硒土壤的定殖能力研究，這對廣西土壤硒資源利用、富硒農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)更有重要的現(xiàn)實意義。

4 結(jié) 論

本研究從廣西多個富硒區(qū)分離鑒定出8株耐硒微生物，分別是：1株蠟質(zhì)芽孢桿菌、2株短小芽孢桿菌，2株地衣芽孢桿菌，1株蘇云金芽孢桿菌，2株粘質(zhì)沙雷氏菌，說明耐硒微生物具有種群多樣性。耐硒微生物的發(fā)現(xiàn)對土壤資源利用、富硒農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)具有潛在的應用價值。

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IsolationandIdentificationofSe-toleranceStrainsfromSe-richSoilinGuangxi

LIAO Qing, LIANG Pan-xia, XING Ying, HUANG Tai-qing, LIU Yong-xian, JIANG Ze-pu*

(Agricultural Resource and Environmental Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007, China)

【Objective】To provide reference for Se resource exploitation of soil, many strains of Se-tolerance were isolated from Se-rich soil in Guangxi.【Method】The dilution spread plate method and Se-added culture method were used to screen the Se-tolerance strains from the soils which were sampled from the main Se-rich areas such as Yongfu, Bama, Yulin Hanshan, Guiping and Tengxi.【Result】8 strains with high Se-tolerance capacity were obtained. These strains could tolerate the Se concentration above 10000μg/mL in solid medium. Among the 8 strains, YLB1-33 showed the highest Se-tolerance. It could still grow weakly in the solid medium with Se concentration 29000 μg/mL. Based on the sequencing of 16S rDNA and phylogenetic analysis, results showed that YLB1-6 was identified asBacilluscereus, BMB2-1 and TXB1-8 were identified asBacilluspumilus, GPB2-5 was identified asBacillusthuringiensis, YLB1-26 and YLB1-33 were identified asBacilluslicheniformis, and YLB1-2 and YFB1-8 were identified asSerratiamarcescens.【Conclusion】The finding of Se-tolerance strains had potential application value on promoting the utilization of Se soil resources and the development of Se-rich agricultural products in Guangxi.

Se-rich soil; Se-tolerance; Strains; Identification; Guangxi

1001-4829(2017)10-2303-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.024

2017-06-28

廣西科學研究與技術開發(fā)計劃項目(桂科合4151040 01-22)；廣西科技計劃項目(桂科攻1598006-5-13)；廣西富硒特色作物試驗站項目(桂TS201611)；廣西農(nóng)業(yè)科學院科技發(fā)展基金和科研業(yè)務費項目(桂農(nóng)科2015JM23，2017JM01，2017JM03)

廖 青(1981-)，女，廣西梧州人，碩士，副研究員，主要從事土壤生態(tài)和高值農(nóng)業(yè)研究，E-mail：liaoqing81@163.com,*為通訊作者：江澤普，E-mail：lzjeep@163.com。

S153.6

A

(責任編輯 汪羽寧)