方敦煌，肖炳光，童治軍，曾建敏

(云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650031)

一種預(yù)測土壤中煙草黑脛病發(fā)病潛力的方法

方敦煌，肖炳光，童治軍，曾建敏

(云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650031)

【目的】了解土壤帶菌量、預(yù)測土壤黑脛病發(fā)病潛力，可為病害的精準(zhǔn)防控、田間病圃的高效選擇、不同抗性品種的科學(xué)布局提供依據(jù)?！痉椒ā坎捎猛寥老♂屍桨逵?jì)數(shù)法、土壤假植病害調(diào)查2種方法預(yù)測土壤中煙草黑脛病的發(fā)病潛力，田間病害系統(tǒng)調(diào)查驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】土壤帶菌量與病害的發(fā)生率密切相關(guān)，病原菌含量越高，發(fā)病越重、蔓延越快；隨著時間的推移，初始發(fā)病率高，最終病害發(fā)生越嚴(yán)重，最終發(fā)病率是初始發(fā)病率的10～20倍；土壤帶菌普遍存在，在所采集的土壤中均可分離獲得，病原菌含量積累到一定程度就引發(fā)病害，1000個/g土壤帶菌量為病害經(jīng)濟(jì)閾值，3～5次的假植病害調(diào)查可以準(zhǔn)確地預(yù)測土壤煙草黑脛病的發(fā)病潛力?！窘Y(jié)論】1000個/g土壤帶菌量為煙草黑脛病的經(jīng)濟(jì)閾值，據(jù)此可以對土壤的病菌進(jìn)行預(yù)警；假植病害調(diào)查可以準(zhǔn)確地預(yù)測土壤煙草黑脛病的發(fā)病潛力，表明建立在環(huán)境—寄主—病原三角關(guān)系的假植預(yù)測病害方法是一種相對準(zhǔn)確、低成本、簡便易推廣的病害預(yù)測方法。

煙草疫霉；土壤稀釋平板計(jì)數(shù)法；土壤假植；病害調(diào)查；病害預(yù)測

【研究意義】煙草黑脛病是煙草疫霉(Phytophthoranicotianae) 引起的土傳病害，自然條件下，以菌絲體、卵孢子及厚垣孢子在土壤中的植株殘?bào)w上越冬[1]。集約化育苗基本可以控制苗期病害，大田是病害防治的主要場所[2-3]。土壤中煙草疫霉是否存在及其存在的數(shù)量是種植煙草后黑脛病發(fā)生、流行的關(guān)鍵因素[4]。因此，了解土壤帶菌量、預(yù)測土壤黑脛病發(fā)病潛力，對病害的精準(zhǔn)防控、田間病圃的高效選擇、不同抗性品種的科學(xué)布局具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，從土壤中分離鑒定以及計(jì)數(shù)煙草疫霉菌的方法已有較多報(bào)道。如葉片誘餌法可以檢測以游動孢子形式存在的疫霉菌，進(jìn)行相對定量[5]；土壤稀釋平板法可以獲得活菌株，定量土壤中的疫霉菌，加上PCR驗(yàn)證可更有效[6]，但不能區(qū)別疫霉菌存在的形式；熒光定量PCR方法可以快捷地對疫霉菌進(jìn)行鑒定及計(jì)數(shù)[7-8]，但無法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞，而且技術(shù)難度大、成本高，不能在生產(chǎn)上推廣。生產(chǎn)上使用的是以中國煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 341[9]為主的方法，但該方法時間跨度大，涉及整個生產(chǎn)季節(jié)，而且主要通過歷年的發(fā)病情況結(jié)合氣象條件進(jìn)行預(yù)測，不涉及煙草疫霉菌的數(shù)量?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】土壤帶菌量與黑脛病的發(fā)生關(guān)系密切，土壤帶菌檢測的研究較多[5-8]，黑脛病的系統(tǒng)監(jiān)測與預(yù)測也有些研究結(jié)果[9,19]，但土壤帶菌預(yù)警、預(yù)測土壤發(fā)病潛力未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采用選擇性培養(yǎng)基土壤稀釋平板分離、結(jié)合PCR驗(yàn)證量化植煙土壤中的煙草疫霉，假植指示植物室內(nèi)模擬測定黑脛病發(fā)生情況，再經(jīng)過典型土壤黑脛病的系統(tǒng)調(diào)查，嘗試建立一種預(yù)測土壤中煙草黑脛病發(fā)病潛力的方法，為病害的精準(zhǔn)防控、田間病圃的高效選擇、不同抗性品種的科學(xué)布局奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植煙土壤的采集

預(yù)備種植煙草的土壤樣品取自云南省抗煙草黑脛病改良株系待選試驗(yàn)點(diǎn)，分別是紅塔區(qū)(簡稱H)研和基地、峨山縣(簡稱E)小街由義、石林縣(簡稱S)鹿阜路美邑和上趙、彌渡(簡稱M)新街西莊等5個點(diǎn)10塊試驗(yàn)田塊，共10個樣品，按采樣地點(diǎn)編號。五點(diǎn)取樣，取樣深度15～20 cm，每點(diǎn)取樣1.0～1.5 kg，將大土塊捏碎，合并、混勻，倒在干凈的牛皮紙上攤成薄層，剔除石塊、植物根莖、昆蟲等雜物，陰干。

1.2 土壤稀釋平板法分離與量化煙草疫霉

1.2.1 土壤前處理 將采集晾干的土壤研碎，過2 mm的土壤篩，收集備用。

1.2.2 選擇性培養(yǎng)基 選擇性培養(yǎng)基由20 %的V8瓊脂培養(yǎng)基[10]添加多菌靈(10 μg/mL)、惡霉靈(50 μg/mL)、五氯硝基苯(25 μg/mL)、利福平(10 μg/mL)、氨芐青霉素(500 μg/mL)以及制霉菌素(25 μg/mL)等抗生素制成[11]。

1.2.3 土壤稀釋平板法分離與量化 稱取過篩后的土壤樣品10 g，放入已滅菌的40 mL水瓊脂(0.25 %)的三角瓶(250 mL)中，上下倒置幾次后，置于漩渦振蕩器上充分混勻，即成5-1土壤稀釋液；吸取5-1土壤稀釋液l mL，移入裝有4 mL無菌水瓊脂的試管中，充分混勻后，即成5-2土壤稀釋液；同樣再稀釋1次，即成5-3土壤稀釋液。所取樣品，均按照上述方法5倍稀釋，每個土樣3 次重復(fù)。吸取5-2、5-3土壤稀釋液各200 μl，涂布于選擇性培養(yǎng)基平板上；每個樣品每個稀釋度涂5個平板，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h后，挑選菌落較易區(qū)分、菌落數(shù)在5～20個的平板，標(biāo)記疑似菌落，記數(shù)[12]，統(tǒng)計(jì)每克土樣形成的疑似菌落數(shù)[6]。

1.2.4 疑似菌落的PCR驗(yàn)證及校正量化 挑取少量疑似煙草疫霉菌菌苔(10 mm×10 mm)，按文獻(xiàn)[11]的方法提取微量菌體DNA，采用特異性引物ITS8-1/ ITS8-2擴(kuò)增[14]驗(yàn)證，每土樣選取疑似菌落5～50個進(jìn)行PCR驗(yàn)證，統(tǒng)計(jì)陽性結(jié)果的比例，校正定量各土樣中的煙草疫霉。

1.3 土壤假植指示煙草后黑脛病發(fā)病測定

1.3.1 土壤前處理 每個土樣取3.0～5.0 kg，輾碎成粒徑為0.5～1.0 cm的土壤顆粒，剔除雜物，裝入32 cm×45 cm×15 cm的篩筐內(nèi)，將篩筐置于托盤中，在托盤中注入土壤厚度1/3～1/2的潔凈水，濕潤土壤2～3 d，以土壤潮濕、不粘連為宜。

1.3.2 指示煙草的假植培養(yǎng) 指示煙草采用易感病的煙草品種紅花大金元，按常規(guī)漂浮育苗方式培育至5～6片真葉苗，挑選長勢整齊的煙苗，拔出、剪除1/4～1/3的末端根際土，形成根創(chuàng)傷后，移栽至裝有土壤樣品的篩筐中，每筐煙苗數(shù)至少12株，重復(fù)3次。假植煙苗的篩筐置于盛水托盤中，托盤中水的深度為土壤厚度的1/3～1/2，干濕交替，維持土壤濕潤，在25～28 ℃、相對濕度75 %以上、12 h光照12 h黑暗交替的人工氣候室中培養(yǎng)。

1.3.3 病害調(diào)查 假植后第2～3 d觀察發(fā)病情況，每7 d調(diào)查1次病情，共調(diào)查5次，煙草黑脛病以株為單位調(diào)查，以產(chǎn)生明顯病斑至煙苗凋萎記作發(fā)病，以無病斑、煙苗直立、生長正常記作不發(fā)病，調(diào)查所有煙株，以發(fā)病率記錄病情[15]。

1.4 代表土壤黑脛病的系統(tǒng)調(diào)查驗(yàn)證

從假植病害調(diào)查中的土樣選取4個不同發(fā)病程度的作為代表土樣，溯源田塊，按煙草黑脛病預(yù)測預(yù)報(bào)調(diào)查規(guī)程要求種植感病煙草品種紅花大金元進(jìn)行系統(tǒng)觀察[9]，每7 d調(diào)查1次，以發(fā)病率統(tǒng)計(jì)病情[15]。至采收完畢，共調(diào)查17次，作調(diào)查時間-發(fā)病率曲線圖，并采用EXCEL進(jìn)行回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤稀釋平板法分離與量化煙草疫霉

培養(yǎng)48～72 h后，不同來源的土樣形成的菌落數(shù)明顯不同。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色以及菌絲形態(tài)，參照Stamps[16]、Hawksworth[17]等的疫霉分類資料，選取乳白色且呈絨狀的菌落作為疑似菌落，PCR驗(yàn)證，統(tǒng)計(jì)陽性結(jié)果的比例，校正定量各土樣中的煙草疫霉(表1)。不同來源土樣PCR驗(yàn)證陽性結(jié)果的比例存在明顯的差異，與文獻(xiàn)[6,11]的結(jié)果一致，與土壤微生物類群，特別是與煙草疫霉同屬不同種、腐霉等菌落形態(tài)相似的微生物種類干擾有關(guān)，但陽性比例仍然在80 %以上，這說明所用的培養(yǎng)基具有良好的選擇性，考慮到土壤記數(shù)本身的差異，可以采用陽性比例平均值進(jìn)行校正，也就是隨機(jī)選取50～100個的疑似菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，以此陽性比例校正記數(shù)。從校正后土樣煙草疫霉數(shù)量統(tǒng)計(jì)看，所有測定的土樣均潛伏著煙草疫霉，但不同土樣煙草疫霉的數(shù)量存在差異，cfu/g即每克土壤菌落形成單位數(shù)反映了土壤中煙草疫霉菌的種群密度，cfu/g 值越大，表明土壤中煙草疫霉菌的密度越大，一旦條件合適，密度越大，煙草黑脛病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)就越高。

表1 疑似菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果

2.2 土壤假植指示煙草黑脛病發(fā)生情況

土壤假植指示煙草黑脛病發(fā)生測定結(jié)果表明，10個土壤樣品發(fā)病潛力差異明顯，隨時間推延，發(fā)病率有所上升，一直不發(fā)病的樣品有2個，最后1次調(diào)查的發(fā)病率<10 %的樣品有1個，發(fā)病率介于10 %～20 %(含10 %)的樣品有4個，發(fā)病率≥20 %的樣品有3個(表2)。對照土樣煙草疫霉量化結(jié)果(表1)可以看出，土壤煙草疫霉含量與發(fā)病率顯著相關(guān)，疫霉含量越高，發(fā)病越嚴(yán)重，發(fā)病潛力越大；不發(fā)病的2個土樣，土壤煙草疫霉含量相對較低；最后1次調(diào)查的發(fā)病率>10 %的，土壤煙草疫霉含量均在1000 cfu/g以上。說明土壤煙草疫霉含量在1000 cfu/g以上存在較大的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)病潛力大。

對不同土樣初始煙草疫霉數(shù)量(即表1中所示土樣疫霉含量)與煙草發(fā)病初期(7 d時的調(diào)查結(jié)果)和后期(7 d后的調(diào)查結(jié)果)的發(fā)病程度之間進(jìn)行相關(guān)性分析，7、14、21、28、35 d的相關(guān)系數(shù)r值分別為0.69、0.81、0.93、0.95、0.96，隨著調(diào)查時間的推延，從中度相關(guān)漸漸上升為高度相關(guān)，表明黑脛病發(fā)生的時間早晚和發(fā)生程度由土壤中初侵染菌源數(shù)量決定，當(dāng)菌量≥1000 cfu/g時發(fā)病較快較早，第5次調(diào)查的發(fā)病率在10 %以上。綜合考慮文獻(xiàn)[6,23]的研究結(jié)果和煙草黑脛病預(yù)測預(yù)報(bào)模型[18]，可推出土壤煙草疫霉含量1000 cfu/g是病害經(jīng)濟(jì)閾值。

表2 土壤樣品煙草黑脛病發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)

圖1 代表土壤煙草黑脛病系統(tǒng)監(jiān)測結(jié)果Fig.1 System monitoring incidence of the disease tobacco black shank in representative soil

2.3 代表土壤黑脛病的系統(tǒng)調(diào)查驗(yàn)證

代表土壤煙草黑脛病系統(tǒng)監(jiān)測結(jié)果顯示(圖1)，在不進(jìn)行防治、溫濕度適宜、不清除病株時，病害呈緩慢發(fā)展趨勢，最終發(fā)病率可達(dá)初始發(fā)病率的10～20倍，初始發(fā)病率超過5 %，最終發(fā)病率可達(dá)90 %以上，與土壤假植病害調(diào)查結(jié)果趨勢基本吻合。從土壤菌量來看，土壤菌量有一個累積過程，隨著菌量的提升，發(fā)病率也逐步上升，即使初始菌量不足以發(fā)病，但當(dāng)菌量累積到一定數(shù)量時仍會發(fā)病，如土樣E1，這也再次證明土壤帶菌是發(fā)病的重要前提條件，也證實(shí)假植指示煙草是一種較好預(yù)測土壤發(fā)病潛力的方法。

3 討 論

在煙草黑脛病流行規(guī)律研究中發(fā)現(xiàn)，煙草黑脛病的發(fā)生與溫度、濕度(或降雨)密切相關(guān)[19-20]。因此，在煙草黑脛病的預(yù)測預(yù)報(bào)中要將歷年病害系統(tǒng)調(diào)查的數(shù)據(jù)與溫度、濕度(或降雨)數(shù)據(jù)之間建立模型，通過溫度、濕度(或降雨量)來預(yù)測預(yù)報(bào)病害的發(fā)生、發(fā)展[21]。這種預(yù)測預(yù)報(bào)注重病害三角關(guān)系[22]中環(huán)境與寄主的關(guān)系，而忽視了病菌與寄主的關(guān)系。隨著土壤中煙草疫霉分離、定量技術(shù)[3]及熒光定量PCR技術(shù)[7-8,23]的發(fā)展，使得監(jiān)測土壤中的煙草疫霉成為可能，相關(guān)疫霉的研究表明，土壤中的疫霉菌數(shù)量消長規(guī)律與田間疫病的流行規(guī)律一致[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)土壤中病菌的數(shù)量決定病害發(fā)生的嚴(yán)重度，病菌含量越大，病害越重[5-6]，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。雖然本研究通過假植預(yù)測了病害的發(fā)生潛力，但土壤帶菌量僅可作為病害的一種預(yù)警方法，而不能直接作為病害預(yù)測方法，實(shí)際應(yīng)用要考慮溫度、濕度(或降雨)等環(huán)境條件，才能對病害發(fā)生做出更準(zhǔn)確地預(yù)測預(yù)報(bào)。

4 結(jié) 論

1000個/g土壤帶菌量為煙草黑脛病的經(jīng)濟(jì)閾值，據(jù)此可以對土壤的病菌進(jìn)行預(yù)警；假植病害調(diào)查可以準(zhǔn)確地預(yù)測土壤煙草黑脛病的發(fā)病潛力，表明建立在環(huán)境—寄主—病原三角關(guān)系的假植預(yù)測病害方法是一種相對準(zhǔn)確、低成本、簡便易推廣的病害預(yù)測方法。

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MethodofForecastingTobaccoBlackShankDiseaseinSoil

FANG Dun-huang, XIAO Bing-guang, TONG Zhi-jun, ZENG Jian-min

(Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650031, China)

【Objective】 Forecast of tobacco black shank was studied in order to prevent and control of diseases accurately, select field disease nursery efficiently, and lay out different resistant varieties scientifically. 【Method】Disease potentiality ofPhytophthoranicotianain the soil was calculated by soil dilution plate counting method and soil planting disease investigation method, and field disease system was used to inverstigate and validate the disease of tobacco black shank used temporary planting indicator tobacco in the representative soil of the field. 【Result】 Quantification ofPhytophthoranicotianain the soil and the incidence of the disease were closely related, and the higher the density of the pathogen was, the more seriously the disease occurred and expanded. As the time went on, the higher initial incidence disease was, the more seriously the successor disease occurred. And the final disease incidence was 10-20 times as many as the initial incidence.Phytophthoranicotianawidely existed in the soil, and it was isolated from all collected soil. When the accumulative density of the fungus was 1000 cfu/g soils, the disease occurred. Disease potentiality ofPhytophthoranicotianacould be accurately forecast incidence of the disease of tobacco black shank in soil by 3-5 times.【Conclusion】According to the disease threshold 1000 cfu/g soil, we could early warn the pathogenic bacterium in the soil. So in view of relationship between environment, host and pathogen, the method of disease prediction was a relatively accurate, low cost, simple and easy to promote by tobacco seedling transplanting soil.

Phytophthoranicotiana；Soil dilution planting；Soil temporary planting；Disease investigation；Disease forecasting

1001-4829(2017)10-2246-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.015

2016-03-17

中國煙草總公司科技計(jì)劃項(xiàng)目(110201301006、2014TBB01、110201601027)；中國煙草總公司云南省公司科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012YN05、2013YN01、2016YN23)

方敦煌(1967-)，男，副研究員，博士，主要從事煙草病害及其防治研究，E-mail：fdhkm@sina.com。

S435.72

A

(責(zé)任編輯 王家銀)