熊 書，李彥杰，周大祥,3 *

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，重慶 萬州 404120；2.重慶三峽學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 萬州 404100；3.重慶大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，重慶市基因功能與調(diào)控重點實驗室，重慶 400300)

油菜MADS-box家族基因AGL11的克隆、表達(dá)及轉(zhuǎn)化油菜的研究

熊 書1，李彥杰2，周大祥2,3 *

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，重慶 萬州 404120；2.重慶三峽學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 萬州 404100；3.重慶大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，重慶市基因功能與調(diào)控重點實驗室，重慶 400300)

【目的】本研究為油菜種子中油脂合成分子調(diào)控機(jī)理提供新的線索?！痉椒ā客ㄟ^定量PCR分析油菜AGL11基因的組織表達(dá)模式，同時構(gòu)建AGL11的干擾載體。【結(jié)果】生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)油菜AGL11具有完整且典型的MADS-box保守結(jié)構(gòu)域，蛋白整體形態(tài)呈現(xiàn)典型的DNA核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)，屬于MADS-box家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，親源關(guān)系與擬南芥AGL11蛋白最近。定量PCR研究發(fā)現(xiàn)，AGL11在油菜盛花期和果夾5DAP(盛花后5 d 的種子)表達(dá)量最高，實驗成功構(gòu)建了RNA干擾載體?！窘Y(jié)論】AGL11基因在油菜種子發(fā)育和油脂積累過程中強烈表達(dá)，該基因可能在種子發(fā)育及油脂的合成中發(fā)揮著重要作用。RNA干擾載體的構(gòu)建成功將為后續(xù)獲得轉(zhuǎn)基因油菜，觀察轉(zhuǎn)基因油菜胚的發(fā)育和種子油脂的積累，從而確定AGL11在油菜胚的發(fā)育及油脂的合成中發(fā)揮著重要作用。

油菜；MADS-box；AGL11；RNAi；油脂合成

【研究意義】MADS-box基因是植物中一類極為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在調(diào)控生長發(fā)育和信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用[1-3]。大量研究發(fā)現(xiàn)MADS-box家族基因AGLs參與植物花器官的發(fā)育[4-5]，在果實的發(fā)育過程中也起著重要的作用[6-7]。影響種子發(fā)育的一些轉(zhuǎn)錄因子同時影響著種子中油脂的積累。LeafyCotyledon1，2(LEC1，LEC2)，F(xiàn)usca3(FUS3)和WRINKLEDl(WRI1)等基因都是種子發(fā)育過程中油脂等物質(zhì)積累的關(guān)鍵調(diào)控因子。這些基因的突變、過量表達(dá)或異位表達(dá)都會對植物種子發(fā)育和油脂等物質(zhì)的積累產(chǎn)生重要的影響。作為CCAAT-Box結(jié)合因子HAP3的亞基之一，LEC1控制植物胚胎發(fā)育過程中的各個方面，是胚胎發(fā)育進(jìn)程中關(guān)鍵的調(diào)控因子。擬南芥LEC1基因的過量表達(dá)可影響其它種子發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如FUS3和WRIl等基因的表達(dá)，致使脂肪酸合成關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)水平顯著提高，最終導(dǎo)致種子中脂肪酸和油脂的含量增加[8]。WRI1編碼一個AP2/EREB結(jié)構(gòu)域蛋白，在亞麻薺中超表達(dá)WRI1基因，可以提高種子質(zhì)量和油脂存儲[9]。【前人研究進(jìn)展】目前，AGLs調(diào)控植物油脂合成的研究較少，在擬南芥中，隸屬于 MADS-box 家族的 AGL15 對胚的發(fā)育也具有重要調(diào)控作用，它可以直接調(diào)控 LEC2、ABI3 及 FUS3基因的表達(dá)，進(jìn)而影響胚的發(fā)育[10]。GmSEP1屬于 AGL2 /SEP 亞家族，GmSEP1 在大豆生殖器官花、莢和種子表達(dá)，在四輪花器官中有不同程度的表達(dá)，推測可能與大豆花器官特化和種子發(fā)育相關(guān)[11]。擬南芥基因 AGL66 和 AGL104 特異性調(diào)控花粉的成熟[12]。前期研究在油菜胚發(fā)育和油脂合成表達(dá)數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)油菜AGL11基因在胚中表達(dá)較高，初步認(rèn)為該基因可能與油脂合成有關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c】本實驗通過克隆甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)的AGL11基因，同時構(gòu)建AGL11的干擾載體，為后續(xù)實驗進(jìn)一步確定AGL11通過控制油脂合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)油脂的合成。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究結(jié)果為探索油菜種子中油脂合成的分子調(diào)控機(jī)理提供新的線索，通過基因工程手段提高油菜油脂含量，為改良油菜品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

甘藍(lán)型油菜Brassicanapuscv. Westar作為研究材料，實驗所用的RNAi干擾質(zhì)粒和農(nóng)桿菌菌株GV3101由重慶大學(xué)基因工程中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取RNA與熒光定量PCR 以BnAGL11基因設(shè)計熒光定量PCR引物BnAGL11-F(5′-AACCGCAGTCCCGTTCTCTC-3′)和BnAGL11-R(5′-AGTCCATTTCTTCTTTTGCA-3′)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。利用Qiagen Plant RNA Kit試劑盒提取油菜各組織的RNA，利用Thermo Scientific First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR利用TaKaRa公司SYBR Green Ⅰ試劑盒，在CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行，分析BnAGL11基因在油菜不同組織的表達(dá)情況。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性20 s，95 ℃變性3 s，60 ℃退火30s，60 ℃延伸15 s，40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用2—△△Ct法計算。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 各種植物相關(guān)基因和氨基酸序列都來自NCBI數(shù)據(jù)庫，蛋白結(jié)構(gòu)域分析在http://pfam.wustl.edu/上進(jìn)行。利用ClustalX2.1比對蛋白質(zhì)序列，用MEGA 5構(gòu)建進(jìn)化樹，利用SWISS MODEL(http://swiss model.expase.org)預(yù)測蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。

1.2.3 干擾載體構(gòu)建 以油菜盛花期的花cDNA為模板，用BnAGL11的正向前后引物(For-BnAGL11-F:5′-CAATTACTTTGCTCATAACA-3′;For-BnA GL11-R:5′-CAATTACTTTGCTCATAACA-3′)擴(kuò)增出正向基因片段For-BnAGL11，將此片段以及RNAi載體用XbaⅠ和SalⅠ酶切，純化回收后連接到RNAi載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，酶切驗證。反向前后引物(Rev-BnAGL11-F:5′-CAATTACTTTGCTCATAGCA-3′; Rev-BnAGL11-R:5′-ACCTTCGTTGTTTTTTGAA T-3′)操作同上。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白結(jié)構(gòu)分析

圖1表示，通過與擬南芥的AGL11蛋白結(jié)構(gòu)比對分析，發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜的AGL11氨基酸序列與擬南芥同源性很高，二者都具有完整且典型的MADS-box保守結(jié)構(gòu)域。大量研究發(fā)現(xiàn)MADS-box家族基因參與植物花器官的發(fā)育，在果實的發(fā)育過程中起著重要的作用，推測AGL11蛋白編碼的基因?qū)儆贛ADS-box家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

At表示擬南芥；Bn表示甘藍(lán)型油菜圖1 AGL11的氨基酸序列比對和同源性分析Fig.1 Amino acid sequence alignment and homology analysis of AGL11

圖2 SWISS MODEL三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 SWISS MODEL three-dimensional protein structure prediction

2.2 蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SWISS MODEL在線蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有1個α螺旋，2個β片層結(jié)構(gòu)，還有一些不規(guī)則卷曲，其整體形態(tài)呈現(xiàn)典型的DNA核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)(圖2)，也進(jìn)一步證明該基因編碼的蛋白為1個轉(zhuǎn)錄因子，具有典型MADS-box保守結(jié)構(gòu)域，屬于MADS-box家族基因。

2.3 進(jìn)化樹分析

為了分析油菜BnAGL11蛋白和擬南芥AGL蛋白的遺傳進(jìn)化關(guān)系，用NCBI下載的蛋白序列，采用MEGA程序建立了系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖3可以看出，BnAGL11蛋白與AtAGL11，AtAGL1,AtAGL5,AtSHP2蛋白組成一個小的亞家族，與AtAGL11蛋白親源關(guān)系最近，也表明BnAGL11可能與AtAGL11在功能上可能有一定的相似性。

圖3 BnAGL11的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of BnAGL11

DAP表示盛花后幾天的種子圖4 甘藍(lán)型油菜AGL11基因的組織表達(dá)模式分析Fig.4 Analysis of tissue expression patterns of BnAGL11 gene

2.4 定量PCR表達(dá)分析

由圖4可知，AGL11在各個組織中均有表達(dá)，其中在盛花期表達(dá)量最高，在果夾5DAP時期表達(dá)量接近盛花期，隨后逐漸降低，二者是其他組織表達(dá)量的2倍以上，油菜種子在DAP5和DAP15之間是胚迅速膨大、油脂快速的積累時期，定量PCR的結(jié)果說明AGL11在油菜胚的發(fā)育過程及其油脂的合成中可能具有重要的作用。

2.5 干擾載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化油菜

為了進(jìn)一步驗證AGL11在油菜胚的發(fā)育過程及其油脂的合成中可能具有重要的功能，采用RNAi干擾技術(shù)，降低AGL11基因在油菜中的表達(dá)，然后觀察轉(zhuǎn)基因油菜的表型。為了構(gòu)建RNAi干擾載體，首先以AGL11基因cDNA為模板，擴(kuò)增出了100 bp的干擾載體正向和反向片段(圖5A)，然后分別插入干擾載體中，獲得重組質(zhì)粒，進(jìn)一步酶切驗證插入片段大小，發(fā)現(xiàn)插入片段1000 bp(圖5B)，與預(yù)期一致，證明RNAi載體構(gòu)建成功。隨后將載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV310菌株中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法，用油菜下胚軸和子葉為受體，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，目前正在獲得陽性抗性苗。隨后將進(jìn)一步獲得轉(zhuǎn)基因油菜植株，觀察轉(zhuǎn)基因油菜胚的發(fā)育和種子油脂的積累，確定AGL11在油菜胚的發(fā)育及油脂的合成中發(fā)揮著重要的作用。

3 討 論

油菜是全球重要的經(jīng)濟(jì)作物，同時在我國的油料作物中排名第一，是優(yōu)良植物蛋白和食用植物油的重要來源。統(tǒng)計顯示，我國食用植物油使用量的35 %來自于菜籽油，而植物餅粕使用量的25 %來自于菜籽餅粕，增加油菜產(chǎn)油率和油脂品質(zhì)改善始終是油菜育種的重要內(nèi)容[13]。據(jù)統(tǒng)計，對油菜產(chǎn)油率而言，每提高1 %的油菜油脂含量，相當(dāng)于增加2.5 %的菜籽產(chǎn)量?，F(xiàn)在，我國主要油菜品種含有40 %左右平均油脂含量，而國外一般油菜品種達(dá)到了42 %～45 %，部分甘藍(lán)型油菜品種油脂含量高達(dá)47 %。這必然會導(dǎo)致油菜種植業(yè)經(jīng)濟(jì)效益低下，打擊農(nóng)民種植油菜的積極性，制約了進(jìn)一步擴(kuò)大油菜種植面積和油菜業(yè)的發(fā)展。為此，進(jìn)一步研究油菜油脂合成的分子調(diào)控機(jī)理，了解控制油脂合成的關(guān)鍵基因，為通過基因工程手段提高油菜油脂含量，改良油菜品質(zhì)，提高油菜產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)效益奠定基礎(chǔ)。

圖5 RNA干擾載體的構(gòu)建Fig.5 Construction of RNAi vector

研究表明，過量表達(dá)或異位表達(dá)一些轉(zhuǎn)錄因子，可以對植物種子發(fā)育和油脂等物質(zhì)的積累產(chǎn)生重要的影響。如擬南芥LEC1基因的過量表達(dá)可使脂肪酸合成關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)水平顯著提高，最終導(dǎo)致種子中脂肪酸和油脂的含量增加[8]。在擬南芥中超量表達(dá)WRI1基因，顯著提高了種子中油脂的含量(提高10 %～20 %)，且不影響轉(zhuǎn)基因植株的生長。實驗表明，糖酵解和脂肪酸代謝進(jìn)程的基因直接受到WRI1調(diào)控[14]。此基因的效應(yīng)已在大田中得到證明，在玉米中超量表達(dá)WRI1，使玉米種子中油脂的含量增加了30 %[15]。研究發(fā)現(xiàn)，油菜Testa16在植物發(fā)育中扮演著多重角色，參與油菜胚胎發(fā)育和脂肪酸合成[16]。將大豆Dof類型的轉(zhuǎn)錄因子基因gmDof4和gmDof11轉(zhuǎn)化到擬南芥中，可以提高轉(zhuǎn)基因植株種子油脂含量[17]。

通過定量PCR研究證明AGL11基因在種子發(fā)育和油脂積累過程中表達(dá)強烈，表明該基因可能在這些發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，后續(xù)實驗通過獲得抑制AGL11基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因油菜，并對轉(zhuǎn)基因油菜進(jìn)行胚分析和油脂含量測定，觀察在轉(zhuǎn)基因植株的種子和胚發(fā)育是否被強烈抑制，胚中脂肪酸含量是否顯著降低，通過上述研究，明確了AGL11基因在控制油菜種子中脂肪酸合成中的作用。

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CloningandExpressionandTransformationofMADS-boxFamilyGeneAGL11inBrassicanapus

XIONG Shu1, LI Yan-jie2, ZHOU Da-xaing2,3*

(1.Department of Basic Medicine, Chongqing Three Gorges Medical College, Chongqing Wanzhou 404120, China; 2.College of Life Science and Engineering, Chongqing Three Gorges University, Chonqqing Wanzhou 404100, China; 3.College of Life Science, Chongqing University, Chongqing Key Lab of Genetic Function and Regulation,Chongqing Wanzhou 400030, China)

【Objective】This study aimed to provide a new clue for the exploration of the molecular regulation mechanism of oil synthesis inBrassicanapusseed. 【Method】The tissue expression pattern ofAGL11 gene by qPCR was analyzed, and its RNA interference vector was constructed. 【Result】Bioinformatics analysis showed that AGL11 protein ofBrassicanapushad a complete and typical MADS-box conserved domain, the overall shape of protein showed typical DNA nucleic acid binding structure, the AGL11 belonged to the MADS-box family transcription factor, and its genetic relationship was the closest with AGL11 protein ofArabidopsis. The qPCR study found thatAGL11 gene expression was the highest in the flowering stage and fruit clamp 5DAP (5 days seed after flowering), and its RNA interference vector was successfully constructed in the experiment. 【Conclusion】TheAGL11 gene was strongly expressed in seed development and oil accumulation, which may play an important role in the seed development and the oil synthesis. The successful construction of RNA interference vector would be favourable to further obtain the transgenicBrassicanapus, observe the embryo development and seed oil accumulation of transgenicBrassicanapusand thus determine theAGL11 gene to play an important role in the embryo development and oil synthesis.

Brassicanapus; MADS-box;AGL11; RNAi; Oil synthesis

1001-4829(2017)10-2174-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.003

2016-11-10

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項目(KJ1502601)；重慶市自然科學(xué)基金(cstc2016jcyjA2132)；重慶市教育委員會項目(KJ1401001)

熊 書(1987-)，女，講師，碩士，主要從事分子生物學(xué)研究；*為通訊作者：周大祥(1979-)，男，副教授，博士，主要從事分子生物學(xué)研究，E-mail：dqzhou79@163.com。

Q945.79

A

(責(zé)任編輯 陳 虹)